Name: ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: חקור את יעילות התרגום של mRNA במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום. פרוטוקול זה מאפשר הפרדה מדויקת של תתי-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליזומים לניתוח תרגום בנוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN/04246-2018 ל- G.Y.). G.Y. הוא קתדרת מחקר בקנדה. S.K. מומן על ידי מלגת בוגרי Mitacs Globalink ומלגת סטודנטים לתארים מתקדמים של ACHRI.

<ol><li>Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li>
<li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li>
<li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neurogenesis%3A+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359(2012).</li>
<li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li>
<li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eIF4E1%2F4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li>
<li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018(2020).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li>
<li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295(2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15(2017).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+Official+Journal+of+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455(2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

פרופיל פוליזום הוא טכניקה נפוצה ורבת עוצמה להערכת מצב התרגום הן בגן יחיד והן ברמות הגנום הרחבות14 . בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול של פרופיל פוליזום באמצעות פלטפורמה ביתית והיישום שלה כדי לנתח את קליפת העכבר המתפתחת. פלטפורמה חסכונית זו קלה להרכבה ולייצור שיפוע סוכרוז חזק וניתן לשחזור ופרופיל פוליזום ברגישות גבוהה.
ראוי לציין כי הכנת שיפוע סוכרוז עקבי ואיכותי היא קריטית כדי להשיג תוצאות פרופיל פוליזום לשחזור17. שינויים בנפח של 10-50% פתרונות סוכרו...

במהלך התפתחות המוח יונקים, תאי גזע עצביים להתרבות ולהבדיל כדי ליצור נוירונים גליה1,2 . ההפרעה של תהליך זה יכולה להוביל לשינויים במבנה המוח ובתפקוד, כפי שניתן לראות בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות3,4. ההתנהגות הנכונה של תאי גזע עצביים דורשת ביטוי מתוזמר של גנים ספציפיים5. בעוד שהשליטה האפיגנטית והתעתיקית של גנים אלה נחקרה באופן אינטנסיבי, הממצאים האחרונים מצביעים על כך שוויסות גנים ברמות אחרות תורם גם לתיאום התפשטות תאי גזע עצביים ובידול6,7,8,9,10. לפיכך, התייחסות לתוכניות הבקרה התרגומיות תקדם מאוד את הבנתנו את המנגנונים שבבסיס החלטת גורל תאי הגזע העצביים והתפתחות המוח.
שלוש טכניקות עיקריות עם עוצמות שונות יושמו באופן נרחב כדי להעריך את המצב התרגומי של mRNA, כולל פרופיל ריבוזום, תרגום טיהור זיקה ריבוזום (TRAP) ופרופיל פוליזום. פרופיל ריבוזום משתמש ברצף RNA כדי לקבוע שברי mRNA המוגנים על ידי ריבוזום, ומאפשר ניתוח גלובלי של מספר ומיקום של תרגום ריבוזומים על כל תעתיק כדי להסיק בעקיפין את שיעור התרגום על ידי השוואתו לשפעתעתיק 11. TRAP מנצלת חלבונים ריבוזומליים מתויגים באפיטופ כדי ללכוד mRNAs12הקשורים לריבוזום . בהתחשב בכך שהחלבונים הריבוזומליים המתויגים יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ספציפיים באמצעות גישות גנטיות, TRAP מאפשרת ניתוח של תרגום באופן ספציפי לסוג התא. לשם השוואה, פרופיל פוליזום, המשתמש בשבר שיפוע בצפיפות סוכרוז כדי להפריד חלק חופשי ותורגם בצורה גרועה (מונוזומים קלים יותר) מאלה המתורגמים באופן פעיל על ידי ריבוזומים (פוליזומים כבדים יותר), מספק מדידה ישירה של צפיפות הריבוזום ב- mRNA13. יתרון אחד טכניקה זו מציעה היא צדדיות שלה ללמוד את התרגום של mRNA ספציפי של עניין, כמו גם ניתוח תרגום רחב הגנום14.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של פרופיל פוליזום כדי לנתח את קליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו משתמשים במערכת ביתית כדי להכין מעברי צבע של צפיפות סוכרוז ולאסוף שברים עבור יישומים במורד הזרם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי לנתח סוגים אחרים של רקמות ואורגניזמים.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו צינורות ללא RNA</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת</td><td>Greiner-Bio</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>21-23G מחט</td><td>BD</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM8640G</td><td></td></tr><tr><td>30 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>קצה קהה מחט</td><td>VWR</td><td>20068-781</td><td></td></tr><tr><td>לוח לחם</td><td>Thorlabs</td><td>MB2530 / M</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>CD1 עכבר</td><td></td><td></td><td>מעבדת צ'ארלס נהר</td></tr><tr><td>מלקחיים קצה מעוקל</td><td>סיגמא</td><td>#Z168785</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td></td><td>Sigma</td><td>66-81-9</td></tr><tr><td>תוכנת רכישת נתונים TracerDAQ</td><td>מדידה מחשוב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממיר</td><td></td> דיגיטלי <td>מדידה מחשוב</td><td>USB-1208LS</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA miniprep kit</td><td>Zymo</td><td>R2070</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>ביו-בייסיק</td><td>12-03-3483</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 מלקחיים</td><td>סיגמא</td><td>#F6521</td><td></td></tr><tr><td>אספן שברים</td><td>Bio-Rad</td><td>דגם 2110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wisent</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>מפעיל שלב ליניארי</td><td>Rattmmotor</td><td>CBX1605-100A</td><td></td></tr><tr><td>בקרת לוציפראז RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>ערכת סינתזה cDNA גדיל ראשון של מקסימה</td><td>Themo Fisher</td><td>M1681</td><td></td></tr><tr><td>מיניאטורי V-clamp</td><td>Thorlabs</td><td>VH1/M</td><td></td></tr><tr><td>לוח אב-טיפוס מסדרה</td><td>מיני Thorlabs</td><td>MSB7515/M</td><td></td></tr><tr><td>עמוד אופטי מסדרה מיני</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R/M</td><td></td></tr><tr><td>בסיס מחזיק עמוד מסדרה מיני</td><td>Thorlabs</td><td>MBA1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-basic</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>מדיה נוירו-בזאלית</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 12.7 מ"מ אלומיניום פוסט</td><td>Thorlabs</td><td>TRA150/M</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR ירוק fastmix</td><td>Quanta Bio</td><td>CA101414-274</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td> <td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Bioshop</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>מהדק זווית ישרה</td><td>Thorlabs</td><td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>זווית ישרה ואוסלאש; 1/2 אינץ' ל-&Oslash; 6 מ"מ מהדק פוסט</td><td>Thorlabs</td><td>RA90TR/M</td><td></td></tr><tr><td>Rnase AWAY</td><td>מוצרים ביולוגיים מולקולריים</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>טיפים ללא RNase</td><td>Frogga Bio</td><td>FT10, FT200, FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNase מים חופשיים</td><td>Wisent</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>סוגר דק בזווית ישרה</td><td>Thorlabs</td><td>AB90B/M</td><td></td></tr><tr><td>קטן V-clamp</td><td>Thorlabs</td><td>VC1 / M</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא</td><td>302-95-4</td><td></td></tr><tr><td>נהג מנוע צעד</td><td>SongHe</td><td>TB6600</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>ביושופ</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 רוטור Ti</td><td>בקמן קולטר</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>הרווארד מנגנון</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>הרווארד מנגנון</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>טריטון-X-100</td><td>ביו-בסיסי</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>טריזול</td><td>תרמופישר מדעי</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>פירסר צינור</td><td>ברנדל</td><td>BR-184</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td></td><td>בקמן קולטר</td><td>L8-70M</td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>ערכת התחלה סופר פרויקט UNO</td><td>Elegoo</td><td>EL-KIT-003</td><td></td></tr><tr><td>צג UV</td><td>Bio-Rad</td><td>EM-1 Econo</td><td></td></tr><tr><td>תושבת אנכית</td><td>Thorlabs</td><td>VB01A/M</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

ההתפתחות התקינה של מוח היונקים מסתמכת על איזון עדין של התפשטות תאי גזע עצביים ובידול לסוגי תאים עצביים שונים. איזון זה נשלט היטב על ידי ביטוי גנים כי הוא מכוון היטב ברמות מרובות, כולל שעתוק, לאחר שעתוק ותרגום. בהקשר זה, גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש תפקיד קריטי של רגולציה תרגום בתיאום החלטות גורל תאי גזע עצביים. שבר פוליזום הוא כלי רב עוצמה להערכת מצב תרגום mRNA הן ברמה הגלובלית והן ברמת הגנים האינדיבידואלית. כאן, אנו מציגים צינור פרופיל פוליזום בתוך הבית כדי להעריך יעילות תרגום בתאים מקליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו מתארים את הפרוטוקולים להכנת שיפוע סוכרוז, תמוגה לרקמות, ultracentrifugation וניתוח מבוסס שבר של מצב תרגום mRNA.

כהדגמה, ליסט קליפת המוח המכיל 75 מיקרוגרם RNA (מאוגד מ 8 עוברים) הופרד על ידי שיפוע סוכרוז ל 12 שברים. פסגות ספיגת UV ב-254 ננומטר זיהו שברים המכילים את יחידת המשנה 40S, יחידת משנה של 60S, מונוזום 80S ופוליזומים(איור 4A). ניתוח שברים לפי כתם מערבי עבור יחידת המשנה ריבוזומה גדולה, Rpl10 הראה את נוכחותו ב subunit 60S (שבר 3), מונוזום (שבר 4) ו polysomes (שברים 5-12) (איור 4B). לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים Gapdh ו-Csde1 לא היו קשורים לריבוזומים אלא הועשרו בשברים ...

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

ויסות תרגום ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות המוח. פרופיל פוליזום מספק כלי שימושי ורב עוצמה להערכת מצב התרגום של mRNA, המאפשר לבחון פונקציות בקרה תרגום במהלך התפתחות המוח. שיטה זו היא גישה קלה וזולה כדי להפוך את מעברי צבע סוכרוז ולהעריך שבר פוליזום.בפרוטוקול זה, הוא משמש לניתוח קליפת העכבר המתפתחת. עם זאת, זה יכול להיות מותאם בקלות ללמוד מערכות אחרות. התחל על ידי דילול 2.2 סוכרוז טוחנת להכין שישה 10 עד 50% שיפוע סוכרוז.מלא מזרק 30 מיליליטר עם כ 16 מיליליטר של 10% סוכרוז, למקם אותו על משאבת המזרק ולחבר אותו למחט. ודא כי אין בועות אוויר במזרק, צינורות או מחט, ולנגב את קצה המחט כדי להסיר כל פתרון שיורית. הזז את השלב הממונע למעלה כך שקצה המחט נוגע במרכז הצינור בתחתית.הגדר את משאבת המזרק לקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה עבור נפח של 2.3 מיליליטר. לאחר חלוקת 2.3 מיליליטר של 10% פתרון סוכרוז, לעבור את השלב הממונע ולחזור על התהליך עבור כל ששת שיפוע. לאחר מכן הוסיפו 20% פתרון סוכרוז לתחתית הצינורות ואחריו 30, 40 ו-50% אספו עוברי עכבר CD1 ביום העוברי 12 והניחו אותם בצלחת של 10 ס"מ המכילה HBSS קר כקרח על קרח.תחת טווח הניתוח, להעביר עובר אחד לצלחת שישה סנטימטרים המכיל HBSS קר כקרח. השתמש 21 כדי 23 מחטים מד כדי לתקן את המיקום של הראש על ידי חדירה דרך העיניים בזווית של 45 מעלות ולהחיל כוח כדי לוודא את המחטים קבועים על הצלחת. השתמש מספר חמש מלקחיים כדי להסיר את העור ואת הגולגולת עובד מהאמצע לצדדים, ולאחר מכן לחתוך את נורות הריח ולהסיר את קרום המוח כדי לחשוף את הרקמות קליפת המוח.השתמש מלקחיים מעוגלים לחתוך את הרקמות קליפת המוח לשניים עד שלושה מיליליטר של מדיום נוירובסאלי על קרח. משוך את הרקמות מעוברים שונים לפי הצורך. רקמות משמונה עד 10 עוברים בדרך כלל לתת כ 200 מיקרוגרם של RNA הכולל.מוסיפים ציקלוהקסימיד למדיום הנוירו-בסל עם הרקמות המנותקות לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה הרקמה ב 500 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לשטוף את הרקמות פעמיים עם PBS קר כקרח בתוספת 100 מיקרוגרם לכל ציקלוהקסימיד מיליליטר.הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה התא בתוספת ארבעה מיקרוליטרים של מעכב RNase ופיפט למעלה ולמטה כדי resuspend הרקמה. השתמש במחט אינסולין בעדינות lyse הרקמה. ואז דגירה על קרח במשך 10 דקות עם מערבולת קצרה כל שתיים עד שלוש דקות.לאחר הדגירה, צנטריפוגה lysate ב 2000 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על הקרח. חזור על תהליך זה פעם נוספת צנטריפוגה ב 13, 000 x g. לאחר העברת supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על קרח, למדוד את ריכוז RNA ברקמה lysate באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.לטעון את הדגימות על גבי שיפוע סוכרוז על ידי מחלק לאט את lysate לקירות של צינורות ultracentrifuge. מניחים בעדינות את שיפוע סוכרוז בדליים ו ultracentrifuge את הדגימות ב 190, 000 x g וארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. מניחים צינור אולטרה צנטריפוגה ריק על מדקר הצינור בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה.מלא מזרק 30 מיליליטר עם 25 מיליליטר של 60% פתרון מרדף סוכרוז. לאחר מכן לחץ בעדינות על המזרק כך שתמיסת המרדף תמלא את הצינור הריק ותעבור דרך צג UV 254 ננומטר כדי להגדיר את הבסיס לגילוי. לחץ על אפס אוטומטי בצג ה- UV כדי לרשום תוכנית בסיסית לזיהוי ולאחר מכן הקש על הפעל בתוכנה כדי להתחיל בהקלטה.ברגע שהמערכת קובעת בסיס, השהה את ההקלטה על התוכנה וחזר בו מפתרון המרדף, וודא שלא נשאר פתרון מרדף שיורית במערכת. לטעון צינור מדגם אחד על מדקר הצינור בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה. התחל להקליט על התוכנה, ודא כי אין בועות אוויר בשורה.לאחר מכן הפעל את משאבת המזרק ואת אספן השברים כדי לאסוף שברים פוליזומים, הגדרת השבר ל 30 שניות. לאסוף את השברים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. הליסט הקליפתי המכיל RNA שנמשך משמונה עוברים הופרד על ידי שיפוע סוכרוז ל-12 שברים.פסגות של ספיגת UV ב 254 ננומטר זיהו שברים המכילים את subunit 40S subunit 60S ו 80S מונוזום ופוליזומים. ניתוח השברים על ידי כתם מערבי עבור subunit ריבוזומלי גדול Rpl10 הראה את נוכחותה מונוזומים subunit 60S ו polysomes. לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים, Gapdh ו- Csde1, לא היו קשורים לריבוזומים, אלא הועשרו בשברים המכילים רנ"א חופשי.בהתאם להפרדת חלבונים בשברים שונים, Gapdh ו- sox2 mRNAs היו מועשרים מאוד בשברים המכילים פוליזומים כבדים, דבר המצביע על כך ש- mRNAs אלה מתורגמים ביעילות בקליפת המוח המתפתחת. לעומת זאת, rpl7 ו- rpl35 mRNAs הועשרו בשבר המכיל מונוזומים, מה שמרמז על תרגום מודחק. כדי להשיג תוצאות לשחזור, חשוב לשמור על עקביות בביצוע מעברי צבע סוכרוז.משאבות המזרק יש להשתמש כדי להוציא את סוכרוז. במהלך השבר ואיסוף המדגם, חשוב לשטוף את המערכת עם מים ללא RNase. פעולה זו מפחיתה את כל שאריות סוכרוז שנותרו מהמדגם הקודם.שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs ברקמות שונות. באמצעות הפלטפורמה, ניתן להשיג מעברי צבע עקביים ליצירת פרופיל פוליזום, המספק פתרון בעלות נמוכה עבור טכניקה קלאסית ושימושית זו.

analysis-translation-developing-mouse-brain-using-polysome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ"א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

בעוד שמבנה הריבוזום אופיין בהרחבה, ארגון הפוליזומים עדיין לא נחקר. כדי להתגבר על חוסר ידע זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול הכנה מפורט להדמיה מדויקת של פוליזומים של יונקים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) באוויר ובנוזל.

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

חקור את יעילות התרגום של mRNA במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום. פרוטוקול זה מאפשר הפרדה מדויקת של תתי-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליזומים לניתוח תרגום בנוירומדע.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

גלה סרטונים נוספים