הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת
11 בפברואר 2021
תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.
מודל המעיים הוא דרך מסתגלת ופיזיולוגית נרחבת למדוד עד כמה דולף המעיים וכיצד לויקוציטים נודדים במעי בעכברים, ב- vivo. שיטה זו מסייעת להבין טוב יותר מנגנונים שבבסיס חלחול מעיים מוגבר ודלקת מעיים פתולוגית. ניתן להשתמש בטכניקה כדי לסייע במנגנוני ההבנה שלנו שבבית תפקוד מחסום המעיים, ודלקת פתולוגית, כפי שניתן לראות קוליטיס כיבית ומחלת קרוהן.
מודל זה משתמש במגזר מעיים חיצוני בעל כלי דם, או של האיליום או המעי הגס הפרוקסימלי, לבדיקת תפקוד מחסום המעי או גיוס תאי החיסון בעכבר. עם יישום רחב זה, מודל לולאת המעי יכול לספק תובנה במחלות הנובעות ממחסום מעיים דולף, כמו גם את התגובה הדלקתית. מאבקים ניתן להתגבר על ידי תרגול הצעדים הכירורגיים.
חשוב מאוד להפוך את מקטע המעי בעל כלי הדם במלואם ולבחור מיקומים מתאימים עבור הקשירות כדי למנוע דימום. מודל לולאת המעיים הוא טכניקה מיקרו-כירורגית, ולכן, כמו עם הליכים כירורגיים אחרים, הוא נהנה מאוד מהדגמה חזותית והצגה צעד אחר צעד של השיטה. לאחר השגת מישור כירורגי של הרדמה, להתחיל על ידי קרצוף הפרווה של קו האמצע הבטן עם ספוגיות אלכוהול או ספוג גזה ספוג עם 70%אתנול.
אין להרטיב אזור רחב של פרווה עם אלכוהול כדי למנוע היפותרמיה. באמצעות מספריים, לבצע לפרוסטומיה בקו האמצע. לעשות חתיכה אופקית באמצע הבטן, ולחשוף את צפק, דואג לא לפגוע באיברים תוך בטן.
מניחים גזת כותנה רטובה חתוכות מראש על חלל הבטן החשוף. השתמש צמר גפן רטוב כדי לגייס חיצוני cecum ולהניח אותו בזהירות על גזה כותנה רטובה. לאחר מכן, גייסו וחצנו בעדינות את האיליום.
לפרוס לפחות שישה סנטימטרים של איליאום סופני על גזת כותנה רטובה מבלי לשבש את כלי mesenteric ואת אספקת הדם. שמור על הרקמות החשופות לחות בכל עת עם HBSS חם. זהה את העורק הראשי המספק את האיליום במזנטריה, קרוב ל cecum.
לאחר מכן, אתר שני אתרי קשירה במזנטריה נטולי כלי דם קריטיים. תפס בחוזקה את ileum מסוף עם מלקחיים רקמה קהה ולהשתמש מלקחיים קצה עדין כדי להדוף את mesentery, הימנעות מכלי הדם. מניחים תספורת משי על פני הניחור, וקושרים קשר כירורגי כדי ליצור את הקשירה הראשונה.
השתמש בסרגל כדי למדוד ארבעה סנטימטרים מהקשירה הראשונה, וליצור את הקשירה השנייה. חותכים בזהירות ליד כל קשירה עם מספריים עדינים כדי לבודד את לולאת ileal ארבעה סנטימטרים, שמירה על אספקת הדם ואת הממברנה mesenteric ללא פגע. שטף בעדינות את התוכן של קטע לולאת ileal עם HBSS חם באמצעות צינור הזנה צהוב גמיש המחובר מזרק 10 מיליליטר.
הקפד לשטוף את התוכן הזוהר מתוך חלל הבטן כדי לשמור על האתר הכירורגי נקי. ליגט את שני קצות החתכים של לולאת האילול הסמוקה עם תפר משי. השתמש מזרק מיליליטר אחד עם מחט 30 מד לאט להזריק 250 microliters של ריאגנט, כגון FITC-dextrans או chemokine, לתוך לומן המעי.
לולאת האילול תתנפח, ותגרום להתנפחות מתונה של הרירית. סגור את דופן הבטן באמצעות מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים, 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה. לאחר ייבוש החיה כדי למנוע היפותרמיה, למקם אותו בתא הרדמה מוסדר טמפרטורה לתקופת הדגירה.
הכן את העכבר לניתוח וחוץ את cecum כפי שהוכח בעבר. בעזרת צמר גפן רטוב, יש להפוך את האילול כולו לחוץ ומניחים אותו על גבי גזת כותנה רטובה. זהה את המעי הגס הפרוקסימלי ואת אספקת הדם הממוקמת במזוקולון.
גייסו את המעי הגס הפרוקסימלי ויצרו את הקשירה הראשונה באזור נטול כלי שיט במזוקולון בגובה של כ-0.5 ס"מ מהקקום. למדוד שני סנטימטרים מן הקשירה הראשונה וליצור קשירה שנייה באזור ללא אספקת דם ב mesocolon. באמצעות מספריים עדינים, לחתוך בזהירות ליד כל קשירה כדי לבודד pcLoop באורך שני ס"מ.
יש לשטוף בעדינות את ה-pcLoop עם HBSS חם כדי להסיר צואה באמצעות צינור האכלה צהוב גמיש המחובר למזרק 10 מיליליטר. הקפד לשטוף את התוכן הזוהר מתוך חלל הבטן כדי לשמור על האתר הכירורגי נקי. לאחר מכן, ליט את שני הקצוות החתוכים של pcLoop הסמוק באמצעות תפר משי.
השתמש מזרק מיליליטר אחד עם מחט 30 מד לאט להזריק 200 microliters של ריאגנט, כגון FITC-dextran או chemokine, לתוך לומן המעי. pcLoop יהיה לנפח, גרימת התנערות מתונה של הרירית. השתמשו בצמר גפן רטוב כדי להחזיר בעדינות את המחשב, האילולי והצט'ם.
סגור את דופן הבטן באמצעות מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים, 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה. לאחר תקופת הדגירה, להרדים את העכבר מורדם ולאסוף רקמות לניתוח. על מנת לאמת את הדיוק של מודל לולאת I להערכת חלחיליות מעיים, FITC-dextran pcLoop assay בוצע כדי להעריך את התפקיד של צומת הדוק הקשור חלבון Jam-a ברגולציה של תפקוד מחסום מעיים ב vivo.
עם דגם pcLoop, עלייה של פי 2.5 ברמות סרום FITC-dextran כותמה בעכברים ריקים בהשוואה לבקרות. תוצאות דומות התקבלו עם עכברים מחסה אובדן סלקטיבי של Jam-a על תאי אפיתל מעיים. מודל pcLoop שימש לחקר נויטרופיל פולימורפונוקלארי, או PMN, גיוס לתוך רירית המעיים ונדידה טרנס-אפיתלית לאחר מכן ב vivo.
מספר PMN בתוכן הזוהר של pcLoop היה לכמת על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. מספר PMN הנוכחי בקטע של המעי הגס הפרוקסימלי היה נמוך בתנאים פיזיולוגיים. טיפול מקדים עם ציטוקינים פרו דלקתיים, TNF אלפא ו- IFN גמא, לפני הניתוח, הביא למספרים מוגברים של PMN שגויסו ב- pcLoop lumen.
ניהול הכימותרפיה PMN מושך LTB4 הוביל לעלייה דרמטית בספירת PMN. כתמים אימונוהיסטוכימיים של PMN ברירית המעי הגס מאששים את הגיוס הגבוה של PMN בעקבות גירוי עם ציטוקינים ו- LTB4. התרומה של Jam-a לנדידה טרנס-אפיתלית PMN נחקרה באמצעות מודל pcLoop על עכברים מחסה אובדן סלקטיבי של Jam-a על תאי אפיתל מעיים.
אובדן ג'אם-a אפיתל הוביל למספר מופחת של PMN transmiged בלומן המעי הגס לעומת פקדי המלטה. היבט קריטי עבור טכניקה זו היא לזכור לשמר את אספקת הדם למקטע המעי החיצוני בעת ביצוע הניתוח. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקת חלחלות מעיים ובבדי הגירה טרנס-אפיתל נויטרופילי כדי לחקור אובדן שלמות המחסום ודלקת מעיים ב vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט מודל עכברי in vivo חסון המשתמש במקטע מעי חיצוני ומסומך כלי דם (אילאום או מעי גס פרוקסימלי) כדי להעריך באופן כמותי את חדירות המעי ואת הנדידה הטרנס-אפיתליאלית (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקליאריים (PMN). המודל מתגבר על מגבלות של גישות ex vivo, ומאפשר מחקרים פיזיולוגיים של תפקוד מחסום המעי וגיוס תאי מערכת החיסון הרלוונטיים למחלות כגון מחלה דלקתית של המעי (IBD).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- גסטרואנטרולוגיה
- אימונולוגיה
- פיזיולוגיה in vivo
רקע
- הרירית של המעי מהווה מחסום סלקטיבי, המאפשר ספיגה של חומרים מזינים ומים תוך חסימה של פתוגנים ורעלים.
- פגיעה במחסום זה מעלה את השקיפות (permeability) ואת חדירת תאי מערכת החיסון, המהווים מאפיינים מרכזיים של IBD והפרעות קשורות.
- שיטות in vivo קיימות לחקר תפקוד המחסום והגירה של תאי מערכת החיסון מוגבלות ביכולתן הכמותית.
- חלבון הצומת המהודק JAM-A מעורב בבקרת שלמות המחסום ושל הגירת PMN.
מטרת המחקר
- להקים ולהדגים מודל in vivo סטנדרטי וניתן לשחזור לחקר חדירות המעי ו-PMN TEpM בעכברים.
- להעריך באופן כמותי את תפקידו של JAM-A בוויסות תהליכים אלו.
- לספק פלטפורמה לחקירת המנגנונים העומדים בבסיס תפקוד לקוי של מחסום המעי ודלקת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאה חיצונית מיקרו-כירורגית וקישירה של מקטע מvaskularized של איליאום או קולון פרוקסימלי של עכבר (iLoop/pcLoop).
- הזרקה תוך-לומנלית של FITC-dextran למדידת חדירות מעיים באמצעות פלואורסצנציית סרום.
- מתן תוך-לומנלי של כימו-אטרקטורים (למשל, LTB4) או ציטוקינים (TNF-α, IFN-γ) להשראה וכימות של נדידת PMN.
- ציטומטריית זרימה ואימונוהיסטוכימיה לניתוח נוכחות PMN בתכנים הלומנליים וברקמה.
תוצאות עיקריות
- מודל ה-iLoop/pcLoop מאפשר מדידה מדויקת וניתנת לשחזור של חדירות מעיים ושל PMN TEpM in vivo.
- עכברים עם Jam-a null ועכברים עם מחיקה ספציפית של Jam-a באפיתל מראים עלייה של פי 2.5 ברמות FITC-dextran בסרום, מה שמעיד על עלייה בחדירות.
- טיפול מקדים בציטוקינים פרו-דלקתיים ומתן LTB4 מגבירים באופן משמעותי את גיוס ה-PMN ואת נדידתם אל תוך חלל המעי.
- אובדן של JAM-A אפיתלי מפחית את הטרנסמיגרציה של PMN, דבר המדגיש את תפקידו הרגולטורי.
מסקנות
- מודל לולאת המעי החשופה הוא כלי רב-עוצמה למחקרים in vivo של תפקודי מחסום המעי ודלקת.
- JAM-A הוא קריטי לשמירה על שלמות המחסום ולהסדרת נדירת PMN במהלך הומאוסטזיס ודלקת.
- מודל זה מקדם את חקר ההומאוסטזיס של המעי והפתוגנזה של מחלות כגון IBD.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הערכה כמותית של חדירות המעי ומגירת תאי נויטרופילים רב-אפיתלית היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות ובמנגנונים המעורבים במחלות מעי דלקתיות ובפתולוגיות קשורות. מודל לולאת המעי בעכברים בסטנדרט אחיד מאפשר הערכה חוזרה ובעלת רלוונטיות פיזיולוגית in vivo של תפקוד המחסום וגיוס תאי חיסון, ובכך תומך בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקרים תרגומיים. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיק הפיתוח על ידי אספקת נתונים חסונים על שלמות המחסום ותגובות דלקתיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד מחסום המעי ומעבר תאי מערכת החיסון in vivo.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של מטרות כגון חלבון הצמידות (למשל, JAM-A).
- מספק פלט כמותי לתיקוף תפקודי של מטרות במסלולים דלקתיים.
- מסייע במיון מנגנונים מועמדים על בסיס רלוונטיות פיזיולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מספק תוצאות in vivo מתוקשפות וניתנות לשחזור עבור בדיקות חדירות ונדידה של תאי מערכת החיסון.
- מבצע סטנדרטיזציה של מדידת FITC-dextran בסרום וספירת PMN בלומנלית להשוואתיות של הבדיקות.
- מאפשר סקלאביליות לסריקת תרכובות או הפרעות גנטיות במודלים רלוונטיים למחלה.
- תומך בהערכה מהימנה של התערבויות המכוונות לשמירה על שלמות המחסום או לדלקת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים למאפייני מחלה בבני אדם, כגון הפרעה בתפקוד המחסום והסננה של נויטרופילים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של היפותזות טיפוליות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמות סיכון, בהתבסס על תוצאות תפקודיות in vivo.
- תומך בפיתוח סמני ביולוגיים (biomarkers) למחקרים תרגומיים במחלות מעיים דלקתיות (IBD) והפרעות קשורות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
מודל זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות, תיקוף מטרות ומחקרים מכניסטיים במערכת in vivo רלוונטית פיזיולוגית.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקה כמותית של השערות הנוגעות לתפקוד המחסום ולנדידה של תאי מערכת החיסון.
- סקרינג: מספקת בדיקות in vivo סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור חדירות ונדידה של PMN.
- אנליטיקה: מייצרת מדדים כמותיים של הסרום והלומן להשוואה סטטיסטית בין תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני במודלים רלוונטיים למחלות של דלקת במעיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרי מנגנון והתערבות מגוונים בחקר מחסום המעי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחסום המעי ודלקות.
- ערך תפעולי: מייצב את ההערכה של חדירות ונדידת תאי מערכת החיסון in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי אספקת נתונים תפקודיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות ומכניזמים בקווי פיתוח של מחלות דלקתיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה ושימור קפדני של אספקת הדם למקטע המעי.
- דורש גישה לתשתיות של ציטומטריה זרימה, זיהוי פלואורסצנציה ואימונוהיסטוכימיה.
- דורש סטנדרטיזציה של הפרוצדורות הכירורגיות והאנליטיות בין הצוותים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה למקטעי האיליאום (מעי דק) והקולון (מעי גס) לצורך גמישות של מערכת המודל.
- תלוי בטכניקה קפדנית כדי למנוע משתנים מתערבים כגון איסכמיה של רקמות או זיהום.
