Name: הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: למד הדמיית חבילות סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים חיים באמצעות HPICM. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמי של מכונות המכנוטרנסדוקציה ללא מגע פיזי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופ' יורי קורצ'וב (אימפריאל קולג', בריטניה) על התמיכה והייעוץ ארוכי הטווח לאורך כל שלבי הפרויקט. אנו מודים גם לד"ר פאבל נובאק ואנדרו שבצ'וק (אימפריאל קולג', בריטניה) וכן לאולג בלוב (מרכז המחקר הלאומי לאודיולוגיה, רוסיה) על עזרתם בפיתוח תוכנה. המחקר נתמך על ידי NIDCD/NIH (R01 DC008861 ו- R01 DC014658 ל- G.I.F.).

<ol><li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li>
<li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositol-4%2C5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li>
<li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li>
<li>Engström, H., Engström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti%2C+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li>
<li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li>
<li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobs%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22">Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology</a>. 55, 547-561 (1990).</li>
<li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li>
<li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182(2020).</li>
<li>Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+JARO%22%5BJournal%5D)">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li>
<li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li>
<li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li>
<li>Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li>
<li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li>
<li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li>
<li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).</li>
<li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li>
<li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scanning+ion-conductance+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li>
<li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li>
<li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed+in+English%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+patch-clamp%3A+new+insights+into+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li>
<li>Sánchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li>
<li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li>
<li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li>
<li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים.

כדי להשיג תמונות HPICM מוצלחות, המשתמשים צריכים להקים מערכת רעש נמוכה ורטט נמוך ולייצר צינורות מתאימים. אנו ממליצים בחום להשתמש בתקני כיול AFM כדי לבדוק את יציבות המערכת לפני ניסיון לבצע הדמיה של תאים חיים. לאחר הרזולוציה של המערכת נבדקת, משתמשים יכולים לשקול הדמיה איבר קבוע של דגימות Corti כדי להכיר את הגדרות ההדמיה לפני ניסיון כל הדמיה תא חי.
נקודת התפאורה האופטימלית להדמיה משתנה בין פיפטות שונות, בהתאם לצורה האינדיבידואלית של הטיפים שלהם (שאינה ידועה עד לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים) וע...

למרות העובדה כי חבילות סטריאוסיליה בתאי השיער השמיעתיים גדולות מספיק כדי להיות דמיינו על ידי מיקרוסקופיה אופטית ולהסיט בתאים חיים בניסוי מהדק תיקון, המרכיבים המבניים החיוניים של מכונות transduction כגון קישורי קצה ניתן לדמיין רק עם מיקרוסקופיית אלקטרונים בתאים מתים. בתאי השיער השמיעתי של היונקים, מכונות התמרה ממוקמות בקצוות התחתונים של קישורי הקצה, כלומר, בקצות סטריאציליה שורה קצרהיותר 1 ומוסדרת באופן מקומי באמצעות האיתות בקצות סטרירוצ'ליה2,3. עם זאת, הדמיה ללא תוויות של מבני פני השטח במיקום זה בתאי שיער חיים אינה אפשרית בשל הגדלים הקטנים של סטריאוטיפיליה.
ללולאה היונקים יש שני סוגים של תאים חושיים שמיעתיים: תאי שיער פנימיים וחיצניים. בתאי השיער הפנימיים, סטריוציליה ארוכה ועבה יותר בהשוואה לאלו בתאי השיער החיצוניים4. השורה הראשונה והשנייה של סטריאוטיפיליה יש קוטר של 300-500 ננומטר בתאי שיער פנימיים עכבר או חולדה. בשל עקיפה של אור, הרזולוציה המרבית בר השגה עם מיקרוסקופיה אופטית ללא תווית היא כ 200 ננומטר. לפיכך, הדמיה של סטריאוטיפיליה בודדת בתוך השורות הראשונה והשנייה של חבילת תא השיער הפנימית קלה יחסית עם מיקרוסקופיה אופטית. לעומת זאת, סטריאוטיפיליה שורה קצרה יותר בתאי השיער הפנימיים וכל הסטריאוטיליה של תאי השיער החיצוניים יש קוטרים סביב 100-200 ננומטר ולא ניתן לדמיין עם מיקרוסקופיה אופטית5. למרות ההתקדמות האחרונה בהדמיה ברזולוציית-על, מגבלה בסיסית זו נמשכת בכל הדמיה אופטית ללא תוויות. כל הטכניקות הנוכחיות הזמינות מסחרית סופר רזולוציה דורשות סוג כלשהו של מולקולות פלואורסצנטיות6, אשר מגביל את היישומים שלהם. בנוסף למגבלות בשל הצורך במולקולות ספציפיות מתויגות פלואורסצנטיות, הוכח כי חשיפה להקרנת אור אינטנסיבית גורמת לנזק תאי ועשויה להשפיע על תהליכים תאיים, המהווה חיסרון גדול בחקר תאים חיים7.
הידע הנוכחי שלנו על הפרטים האולטרה-מבניים של חבילות סטריאציליה של תאי שיער הושג בעיקר בטכניקות מיקרוסקופיה אלקטרוניות (EM) שונות, כגון סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM), מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), שבר בהקפאה EM, ולאחרונה עם טכניקות תלת-ממד כגון חתך סדרתי עם קרן יונים ממוקדת או טומוגרפיה קריו-EM8,9,10,11,12,13, 14,15,16. למרבה הצער, כל טכניקות EM אלה דורשות כימי או cryofixation של המדגם. בהתאם לסולם הזמן של התופעות, דרישה זו הופכת את המחקר של התהליכים הדינמיים בקצות סטריאוטיפיליה לבלתי אפשרי או מאוד אינטנסיבי בעבודה.
נעשו מאמצים מוגבלים לדמיין חבילות שיער של תאי שיער חיים עם מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM)17,18. מכיוון ש-AFM פועלת בפתרונות פיזיולוגיים, היא יכולה, בתיאוריה, לדמיין שינויים דינמיים בחבילות הסטריאוטיליה של תאי שיער חיים לאורך זמן. הבעיה נעוצה בעקרונות של AFM ברזולוציה גבוהה, המרמזת על מגע פיזי מסוים בין הבדיקה AFM לבין המדגם, אפילו במצב "הקשה" הכי פחות מזיק19. כאשר הגשושית AFM נתקלת בסטריאוטיניום, היא בדרך כלל מתרסקת עליו, ופוגעת במבנה של חבילת השיער. כתוצאה מכך, טכניקה זו אינה מתאימה לדמיין חיים, או אפילו קבוע, תאי שיער חבילות17,18. הבעיה עשויה להיות הקלה חלקית באמצעות בדיקה AFM בצורת כדור גדול המטיל רק כוחות הידרודינמיים על פני השטח של המדגם20. עם זאת, למרות בדיקה כזו מתאימה באופן אידיאלי כדי לבדוק תכונות מכניות של המדגם21, הוא מספק רק רזולוציה תת מיקרומטר בעת הדמיה האיבר של Corti22 ועדיין חל על המדגם כוח שעשוי להיות משמעותי עבור חבילות סטריאוטיפיליה רגיש מאוד.
סריקת מיקרוסקופיית מוליכת יונים (SICM) היא גרסה של מיקרוסקופיית בדיקה סריקה המשתמשת בגשושית פיפטה מזכוכית מלאה בתמיסה מוליכת23. SICM מזהה את פני השטח כאשר הפיפטה מתקרבת לתא והזרם החשמלי דרך הפיפטה פוחת. מאז זה קורה הרבה לפני נגיעה בתא, SICM מתאים באופן אידיאלי עבור הדמיה ללא מגע של תאים חיים בפתרון פיזיולוגי24. הרזולוציה הטובה ביותר של SICM היא בסדר של ננומטר יחיד, המאפשר פתרון מתחמי חלבון בודדים בקרום הפלזמה של תא חי25. עם זאת, בדומה לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, SICM מסוגל לדמיין רק משטחים שטוחים יחסית. התגברנו על מגבלה זו על ידי המצאת מיקרוסקופ מוליכת יון בדיקה מקפץ (HPICM)26, שבו הננו-צינור מתקרב לדגימה בכל נקודת הדמיה(איור 1A). באמצעות HPICM, הצלחנו לדמיין חבילות סטריאוסיליה בתאי שיער שמיעתיים חיים ברזולוציה ננומטרית27.
יתרון בסיסי נוסף של טכניקה זו הוא כי HPICM הוא לא רק כלי הדמיה. בניגוד לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, הבדיקה HPICM / SICM היא אלקטרודה הנמצאת בשימוש נרחב בפיזיולוגיה של תאים להקלטות חשמליות ואספקה מקומית של גירויים שונים. פעילות ערוץ יון אינה מפריעה בדרך כלל להדמיית HPICM, מכיוון שהזרם הכולל באמצעות הבדיקה HPICM הוא מספר סדרי גודל גדולים יותר מהזרם החוץ-תאי שנוצר על-ידי ערוצי היון הגדולים ביותר25. עם זאת, HPICM מאפשר מיקום מדויק של nanopipette מעל מבנה של עניין והקלטת מהדק תיקון בערוץ יחיד לאחר מכן ממבנה זה28. כך השגנו את ההקלטות הראשוניות הראשונות של פעילות ערוץ יחיד בקצות סטריוציליה של תא השיער החיצוני29. ראוי להזכיר כי אפילו זרם גדול דרך nanopipette לא יכול לייצר שינויים משמעותיים של הפוטנציאל על פני קרום הפלזמה בשל דלף חשמלי עצום של המדיום החוץ תאי. עם זאת, ערוצי יונים בודדים יכולים להיות מופעלים באופן מכני על ידי זרימת נוזל דרך nanopipette30 או כימית על ידי יישום מקומי של אגוניסט31.
ב-HPICM, התמונה נוצרת כאשר ננו-אפיפט ניגש ברצף לדגימה בשלב מסוים, נסוג ואז נע בכיוון רוחבי כדי לחזור על הגישה (איור 1A). מגבר מהדק תיקון מחיל כל הזמן מתח על חוט AgCl בפיפטה (איור 1B) כדי ליצור זרם של ~ 1 nA בתמיסת האמבטיה. הערך של זרם זה כאשר הפיפטה רחוקה מפני השטח של התא נקבע כזרם ייחוס(אניחוזר, איור 1C). לאחר מכן, הפיפטה נעה בציר Z כדי להתקרב לדגימה עד שהזרם יופחת בסכום שהוגדר מראש על-ידי המשתמש (setpoint), בדרך כלל 0.2%-1% מהנציג של I (איור 1C, מעקב עליון). לאחר מכן המערכת שומרת ערך Z ברגע זה כגובה המדגם, יחד עם קואורדינטות X ו- Y של נקודת הדמיה זו. לאחר מכן, הפיפטה נסוגה מפני השטח(איור 1C,מעקב תחתון) במהירות שהוגדרה על ידי המשתמש, בדרך כלל 700-900 ננומטר/ms. לאחר הנסיגה, הפיפטה (או, במקרה שלנו, המדגם - ראה איור 1B) מועבר לרוחב לנקודת ההדמיה הבאה, מתקבל ערך זרם ייחוס חדש, והפפטה שוב מתקרבת לדגימה, חוזרת על התהליך. תנועת X-Y של הפיפטה עדיפה במערך מיקרוסקופ זקוף המשמש בדרך כלל להקלטות של זרמי המכנוטרנסדוקציה של תאי השיער. בהגדרה זו, הבדיקה HPICM מתקרבת לחבילות תאי השיער לא מלמעלה אלא בזווית32. עם זאת, הרזולוציה הטובה ביותר של הדמיית HPICM מושגת במערך מיקרוסקופ הפוך (איור 1A,B),שבו התנועה של המדגם בכיווני X-Y היא דה-מצמיד מ Z-תנועה של nanopipette, ובכך ביטול חפצים מכניים פוטנציאליים.
באמצעות HPICM, השגנו תמונות טופוגרפיות של חבילות סטריאוטיפיליה פנימיות וחתריות של עכבר וחולדה, ואפילו דמיינו את הקשרים בין הסטריאוטיפיליה בקוטר של כ -5 ננומטר26,27. ההצלחה של הדמיית חבילת תאי שיער בטכניקה זו מסתמכת על מספר גורמים. ראשית, הרעש (השונות) של זרם הננו-צינור צריך להיות קטן ככל האפשר כדי לאפשר את נקודת הקבע הנמוכה ביותר האפשרית עבור הדמיית HPICM. נקודת קבע נמוכה מאפשרת לגשושית HPICM "לחוש" משטח סטריוציליה במרחק גדול יותר ובכל זווית לגישת הגשושית, ובאופן מפתיע, משפרת את רזולוציית X-Y של הדמיית HPICM (ראה דיון). שנית, יש להקטין את התנודות והסחף במערכת לפחות מ -10 ננומטר, שכן הם תורמים ישירות לחפצי ההדמיה. לבסוף, למרות שגשושית HPICM ושלב הדגימה מועברות בצירי Z ו- X-Y על ידי מפעילי פיזו מכוילים הנשלטים על ידי משוב שיש להם דיוק של ננומטר יחיד או טוב יותר, הקוטר של קצה הננופיט קובע את התפשטות הזרם (נפח חישה) ומכאן הרזולוציה (איור 1A). לכן, לפני הדמיית תאי שיער חיים, חשוב למשוך את פיפטות נאותה, להגיע לרזולוציה הרצויה עם דגימות כיול, ולהשיג רעש נמוך במערכת ההקלטה.
במשך כמה עשורים לפחות, טכניקת SICM לא הייתה זמינה מסחרית והיא מתפתחת על ידי מעבדות מעטות בלבד בעולם עם המעבדה המובילה של פרופ 'קורצ'ב במכללה הקיסרית (בריטניה). לאחרונה, מספר מערכות SICM הפכו לזמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים), כולן מבוססות על עקרונות HPICM המקוריים. עם זאת, חבילות סטריאציליה הדמיה בתאי השיער דורשת מספר שינויים מותאמים אישית כי הם מאתגרים מבחינה טכנית (או אפילו בלתי אפשרי) במערכות סגורות "מוכן ללכת". לכן, יש צורך בשילוב רכיבים מסוימים. מכיוון שהגדרת HPICM מייצגת אסדת מהדק תיקון עם דרישות רטט וסחף מחמירות יותר ותנועה מונעת פיזו של גשושית HPICM והמדגם (איור 1D), שילוב זה קל יחסית לכל חוקר, הבקיא בהידוק תיקונים. עם זאת, מדען ללא רקע מתאים בהחלט צריך קצת הכשרה אלקטרופיזיולוגיה ראשונה. למרות האתגרים שנותרו כגון הגדלת מהירות ההדמיה (ראה דיון), הצלחנו לדמיין חבילות סטריאציליה בתאי שיער חיים ברזולוציה ננומטרית מבלי לפגוע בהם.
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה מוצלחת של HPICM של חבילות תאי שיער שמיעתיים חיים בחולדה צעירה לאחר הולדות או בגולשי שבלול עכברים צעירים באמצעות המערכת המותאמת אישית שלנו. הרכיבים המשולבים מפורטים בטבלת החומרים. המאמר מתאר גם בעיות נפוצות שניתן להיתקל בהן וכיצד לפתור אותן.

<table><tbody><tr><td>אוסצילוסקופ אנלוגי</td><td>B& </td> אוסצילוסקופ אנלוגי K Precision <td>2160C</td><td>לניטור בזמן אמת של זרם ננו-פיפטה וגישת ציר</td></tr><tr><td>Z תקני כיול AFM</td><td>TED PELLA Inc</td><td>HS-100MG; HS-20MG</td><td>תקני כיול אלה של 100 ו-20 ננומטר משמשים לבדיקת הביצועים של מערכת HPICM</td></tr><tr><td>מבודד רטט ספסל</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Everstill K-400</td><td>בידוד רעידות פעיל</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td> World <td>Precision Instruments (WPI)</td><td>1B100F-4</td><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עבור הננו-פיפטות</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td>יש להוסיף לפתרון האמבטיה להתאמת אוסמולריות</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>דיגיטייזר קלט/פלט רב-ערוצי</td></tr> בקרת נגזרת <tr><td>אנלוגית פרופורציונלית-אינטגרלית-נגזרת (PID) מהירה לתנועת Z</td> מודולי מכשור <td>SIM900, SIM960, SIM980</td> של <td>Standford Research Systems</td><td>משולבים בבקר PID חיצוני לתנועת Z. זה דורש תגובה מהירה שבדרך כלל אינה מיושמת במגברי פייזו מסחריים.</td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td>AMETEK/TMC</td><td>סוג II</td><td>נדרש להגנה על הפרעות אלקטרומגנטיות</td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD5040-100</td><td>משמש כצלחת לתא הרקמות</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>פתרון חוץ-תאי (אמבטיה)</td></tr><tr><td>מגבר מכשור</td><td>Brownlee </td> מגבר מכשור <td>דגם 440</td><td>מדויק מספק קיזוזים נדרשים, סינון והגדלה או הנחתה משנית</td></tr><tr><td>מושך מיקרופיפטה מבוסס לייזר</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>חולץ מיקרופיפטה לייצור הננו-פיפטות. יש צורך בלייזר עבור פיפטות קוורץ חדות.</td></tr><tr><td>L-15 של Lebovitz, ללא</td><td>פנול אדום Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>תמיסה חוץ-תאית (אמבטיה)</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>משמש למיקום "מסלול" של מיקרוסקופ מפעיל Z piezo</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td> מגבר תיקון <td>מיקרוסקופ אופטי הפוך</td></tr><tr><td></td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>Axopatch 200B</td><td>מגבר מהדק התיקון מודד את הזרם דרך</td></tr><tr><td>מגבר הננו-פיפטה Piezo (צירי XY)</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>E-500.00, E-505.00, E-509. </td><td>C2A הגברה ובקרת PID לשלב תרגום XY piezo</td></tr><tr><td>מגבר פייזו (ציר Z)</td><td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 & 800</td><td>מגבר מותאם אישית המורכב מספק כוח ENT 400 ושני מגברים ENT 800 במקביל להשגת זרם מקסימלי של 1.6 nA</td></tr><tr><td>כיסויי פלסטיק</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>משמש בייצור התאים לרקמות&nbsp;</td></tr><tr><td>בקר ותוכנה SICM *</td> <td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td> <td>N / A</td><td>בקר מותאם אישית המבוסס על לוח עיבוד אותות דיגיטלי SBC6711 מבית Innovative Integration Ltd</td></tr><tr><td>אלסטומר סיליקון (Sylgard)</td> <td>World Precision Instruments (WPI)SYLG184</td><td></td> <td>משמש לחיבור סיבי הזכוכית הגמישים לתא לדבק הסיליקון הרקמות</td></tr><tr><td></td><td>The Dow Chemical Company</td><td>734</td><td>משמש להדבקת חלקי החדר השונים לרקמה</td></tr><tr><td>מוט טונגסטן</td><td>A-M Systems</td><td>717500</td><td>משמש להחזקת גדילי החוט הדנטלי בתא לרקמה</td></tr><tr><td>XY piezo nanopositioner</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>P-733.2DD</td><td>XY שלב תרגום עם חיישנים קיבוליים</td></tr><tr><td>Z piezo nanopositioner</td><td>Piezosystem jena</td><td>RA 12/24 SG</td><td>Ring piezoactuator עם חיישן מד מתח</td></tr><tr><td>*Ionscope כבר לא מוכרת בקרי SICM נפרדים. ישנן מעט מערכות מסחריות אחרות:&nbsp; NX12-Bio ו-NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מודולי Park Systems, Korea ו-SICM מבית ICAPPIC Limited, בריטניה (icappic.com). כל המערכות הללו מבוססות על המקור&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עקרונות HPICM. עם זאת, הדמיית חבילות סטריאוציליה בתאי השיער דורשת מספר שינויים מותאמים אישית שהם טכניים;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאתגר (או אפילו בלתי אפשרי) בסגור " מוכן לדרך" מערכות כגון Ionscope או NX12-Bio/NX10. נכון לעכשיו, יש רק אחד&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת מודולרית (ICAPPIC) שיש לה את הגמישות להתאים לכל ניסוי SICM/HPICM אך דורשת אינטגרציה מסוימת של רכיבים.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

תאי שיער באוזן הפנימית מזהים תזוזות המושרות בצליל ומעבירים גירויים אלה לאותות חשמליים בחבילת שיער המורכבת מסטריאוציליה המסודרת בשורות של גובה הולך וגדל. כאשר סטריאוטיפיליה מסויטה, הם מושכים על קצה חוץ-תאי זעיר (~ 5 ננומטר) קישורי סטריאוציליה מחוברים, אשר מעבירים כוחות לערוצי transduction mechanosensitive. למרות mechanotransduction נחקר בתאי שיער חיים במשך עשרות שנים, הפרטים האולטרה-מבניים החשובים מבחינה תפקודית של מכונות mechanotransduction בקצה סטריאוטיפיליה (כגון דינמיקה קישור קצה או שיפוץ סטריוציליה תלויות טרנסדוקציה) עדיין ניתן ללמוד רק בתאים מתים עם מיקרוסקופיה אלקטרונית. תיאורטית, לטכניקות סריקה של בדיקה, כגון מיקרוסקופיית כוח אטומי, יש מספיק רזולוציה כדי לדמיין את פני השטח של סטריאוטיפיליה. עם זאת, ללא תלות במצב הדמיה, אפילו המגע הקל ביותר של גשושית מיקרוסקופיה כוח אטומי עם חבילת סטריאוטיפיליה בדרך כלל פוגע בצרור. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופיית מוליכת יונים בדיקה מקפץ (HPICM) הדמיה של תאי שיער שמיעתי מכרסמים חיים. טכניקת בדיקה זו ללא מגע סריקה מאפשרת הדמיה של זמן לשגות של פני השטח של תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת, כמו תאי שיער, עם רזולוציה של ננומטר יחיד ומבלי ליצור מגע פיזי עם המדגם. HPICM משתמש בזרם חשמלי העובר דרך ננו-צינור הזכוכית כדי לזהות את פני התא בקרבתו לפיפטה, בעוד שמערכת פיזואלקטרית הממוקמת בתלת-ממד סורקת את פני השטח ומייצרת את תמונתו. עם HPICM, הצלחנו לדמיין חבילות סטריאוטיפיליה ואת הקישורים המחברים סטריוציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים במשך מספר שעות ללא נזק מורגש. אנו צופים כי השימוש ב- HPICM יאפשר חקירה ישירה של שינויים אולטרה-מבניים בסטריאוטיפיליה של תאי שיער חיים להבנה טובה יותר של תפקודם.

הפרוטוקול המוצג במאמר זה יכול לשמש כדי לדמיין כל תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת. בעקבות צעדים אלה, אנו משיגים באופן שגרתי תמונות של חבילות תאי שיער שמיעתיים של חולדות חיות(איור 6B,D). למרות רזולוציית X-Y נמוכה יותר בהשוואה לתמונות SEM, תמונות HPICM שלנו יכולות לפתור בהצלחה את השורות השונות של סטריאוטיפיליה, את צורת קצות הסטריאוטיליה ואפילו את הקישורים הקטנים (בקוטר של כ- 5 ננומטר) המחברים סטריאוטיפיליה סמוכה (איור 6F). בנוסף, תמונות HPICM כוללות ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופיית מוליכת היונים של בדיקה מקפיצה (HPICM), טכניקת בדיקה סריקה ללא מגע המאפשרת הדמיה ננומטרית של חבילות סטריאציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים.

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

מעשי זה יכול לעזור לנו ללמוד שינויים דינמיים של הרכיבים המבניים ננו של מכונות טרנסדוקציה חשמלית מכנית על פני השטח של חבילות סטריאציליה תא השיער. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדמיה לשגות זמן של פני השטח של תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת ברזולוציה ננומטר יחיד, ומבלי ליצור מגע פיזי עם המדגם. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט על כל תא חי.בעבר התאמנו את פני השטח של קווי תאי אפיתל ריאות נגועים בווירוסים, תאי שריר, בחיידקי התמונה שלי בקרוב. בדוק את הננו-אפיפטים בתחילת כל מפגש הדמיה. לאחר ייצור ננו-צינור, בדוק אם קיימות בועות, והרכיב את הננופיט על מחזיק המיקרוסקופ של יון הגשושית.בארבעה מיליליטר של פתרון אמבטיה לתא ולהניח את התא על בימת HPICM. הציגו את האלקטרודה הקרקעית לתמיסת האמבטיה וודאו שהמתח המופעל על הפיפטה דרך מגבר המהדק הוא אפס. לאחר הצבת המניפולטור המיקרו במיקום האנכי, הזז את הפיפטה ב- Z עד שהוא נוגע בנוזל והגדיר את מגבר היסט לאפס, לפני הוספת פלוס 100 מילבולט כדי לבדוק את זרם הפיפטה.השתמש בדבק סיליקון כדי לחבר את תקן הכיול AFM לתא ולכסות את המדגם בארבעה מיליליטר של HBSS. השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא לשלב X Y של הגדרת HPICM, וטען ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת התנגדות nanopipette וקוטר, להגדיר את הזרם למגבר ננו אחד.השתמש במניפולציה של מהדק תיקון גס כדי למקם את הננו-צינור בערך מעל מרכז תקן הכיול ולהגדיל את הנקודה שנקבעה תוך ניטור האות מהחיישן של מפעיל Z piezo על אוסצילוסקופ בזמן אמת. לאחר יצירת מחזור גישת Z יציבה שחוזרת על עצמה, להקטין את הנקודה להגדיר לערך רק מעל נקודת חוסר היציבות ולהזיז את pipette למטה במהירות של כחמישה מיקרון לשנייה, עד שהוא מגיע המדגם. הרמה התחתונה של אות מיקום Z בזמן אמת תגדל, מה שמצביע על כך שהננו-פיפט נסוג עקב חישת משטח המדגם.בשל הרכבה לא אחידה על תקן AFM, הנקודה הגבוהה ביותר של תחום העניין עשויה להיות לא ידועה. לכן, להגדיר את המשרעת של נסיגה pipette לפחות 200 עד 500 ננומטר. דואג לא לחרוג מהגבול העליון של תנועת מפעיל Z piezo, להתחיל הדמיה ברזולוציה נמוכה.לאחר שזוהתה הנקודה הגבוהה ביותר של המדגם באזור ההדמיה, הפחיתו את משרעת הדילוג וחזרו בה מהצינור כ-200 מיקרון לאורך ציר Z כדי למנוע התנגשות לא רצויה עם המדגם לפני העברתה למיקום X Y חדש. כאשר אזור העניין אותר, התחל הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר. להדמיית תאי שיער שמיעתיים, אבטחו היטב איבר מבודד טרי של קורטי לתא באמצעות חוט דנטלי, או פיפטות זכוכית גמישות.השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא היטב לשלב הפיזו X Y ולהעמיס ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת עמידות nanopipette, להשתמש תיקון מהדק מיקרו מניפולטור כדי למקם את nanopipette מעל אזור תא השיער תוך התבוננות האיבר של צמח Corti X במיקרוסקופ הפוך. הקלט, אות המיקום הנוכחי בזמן אמת ו- Z באוסקילוסקופ כדי לבדוק אם המערכת יציבה עם נקודה מוגדרת של 0.5%6 או נמוכה יותר, ולקבוע את נקודת הסט האופטימלית ולגשת למדגם כפי שהודגם.בצע הדמיה ברזולוציה נמוכה של המדגם כפי שהודגם באמצעות משרעת הופ של לפחות שישה עד שמונה מיקרון. אם הננו-צינור צריך לעבור למיקום X Y חדש, בטל את הפיפטה כ-500 ננומטרים כדי למנוע התנגשות עם תכונות גבוהות בתוך הרקמה וחזור על הדמיית HPICM ברזולוציה נמוכה עד לאזור העניין שבו ממוקמים תאי השיער. לאחר מכן צלם את אזור העניין ברזולוציה גבוהה יותר ב- 15 דקות או פחות.ניתן להשתמש בפרוטוקול HPICM כדי לדמיין כל תא חי עם טופוגרפיה מורכבת, כגון חבילות תאי שיער שמיעתיים של חולדות חיות. למרות הדגמת רזולוציית X Y נמוכה יותר בהשוואה לסריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים, תמונות HPICM יכולות לפתור בהצלחה את השורות השונות של סטריאוטיפיליה. הצורה של קצות סטריאוטיליה ואפילו חמשת ננומטר קטן קישורים המחברים את סטריאוטיפיליה הסמוכה.בהתחשב באופי ללא מגע של הדמיית HPICM, הדמיה רציפה של אותה חבילת תאי שיער יכולה להתבצע במשך מספר שעות מבלי לפגוע בלכידות החבילה. שים לב כי עם נקודת קבוצה נמוכה מאוד, המערכת עשויה לפרש תנודות קטנות בזרם כמפגש עם משטח התא, מה שמוביל לרעש נקודה לבנה בתמונה. באופן דומה, משרעת הופ גדולה עשויה להגביר את התהודה לרוחב של הפיפטה, וכתוצאה מכך גם ייצור של פיקסלים רועשים.לעומת זאת, אם משרעת הופ היא קטנה מדי, או נקודת הקבע גבוהה מדי, nanopipette עלול להתנגש עם המדגם וכתוצאה מכך חפצים הדמיה או נזק צרור שיער. הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לבלות פחות מ 15 דקות לכל חבילת תא שיער בעת עבודה עם תאים חיים. לאחר קבלת תמונה של חבילת השיער, ניתן לנסות להשיג הקלטות ערוץ יחיד ממיקומים ספציפיים על פני השטח של סטריאוטיפיליה כדי לענות על שאלות על תכונות ערוץ mechanotransduction.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

מקור: Lukasz, D., et al. הדמיית סידן in vivo של תאי שיער בקו הרוחב בדג זברה זחל. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים הדמיה חיה של זרם סידן בתאי השיער בקו הצדדי של זחל דג זברה טרנסגני משותק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. גירוי מכני של צרורות שיער באמצעות פולסים נוזליים גורם לכניסת סידן דרך תעלות מכניות ותעלות מגודרות מתח, אשר מוצגות בזמן אמת באמצעות מחווני פלואורסצנטיות. השיטה מדגישה את הדינמיקה של סידן אפיקלי ובסיסי בתאי שיער נוירומסטים, ומבהירה את תפקידם בזיהוי תנועת מים.

הדמיית דינמיקת סידן בתאי שיער בקו הרוחב של דג זברה זחל

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

של הצפרדע האמריקנית (רנא catesbeiana) sacculus מתיר בדיקה ישירה של פיזיולוגית שיער תאים. כאן לנתיחה וההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical מתוארת. אנחנו מראים ניסויי נציג מתאי שיער אלה, לרבות חישוב יחס כוח-העקירה של צרור והמדידה של התנועה המאולצת שלה.

הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי (<em&gt; רנא catesbeiana</em&gt;)

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

דג זברה היא מערכת מודל יש תכונות רבות ערך כולל בהירות אופטית, התפתחות חיצוני מהירה,, חשוב במיוחד בתחום השמיעה ושיווי, מבחוץ ממוקם תאי שיער חישה. מאמר זה מתאר כיצד הטרנסגניים דג זברה יכול לשמש כדי assay שיער-תא mechanosensation ותפקוד presynaptic בוססו.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

למד הדמיית חבילות סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים חיים באמצעות HPICM. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמי של מכונות המכנוטרנסדוקציה ללא מגע פיזי.

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

גלה סרטונים נוספים