הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

הפרוטוקול האופטוגנטי המתוקנן מיועד למעבדות המעוניינות להשתמש באור כתמריץ לשליטה בתכונות התאים במערכות תאיות מהונדסות של יונקים. פרוטוקול זה קל ליישום במעבדות אחרת לא מוכר עם optogenetics ומספק שיטות לשליטה זמנית מרחבית מדויקת של מערכות ביולוגיות מהונדסות. שיטה זו כוללת מגוון רחב של יישום בתחומי מחקר ספציפיים שבהם מידע מרחבי עשוי להיות חשוב כולל ביולוגיה של סרטן, ביולוגיה של מערכות ובידול רקמות.

ראשית, בחר את הרכיבים הגנטיים כדי לשלב לאגד לתוך מעגל גן יחיד או plasmid. לדוגמה, אתרי שילוב DNA של יונקים, אלמנטים מגיבים לאור או גנים פונקציונליים. לאחר הרכבה ובדיקה של כל התכונות הדרושות כגון קודונים התחלה, רצפים רגולטוריים או מתורגמים, השתמש בכל הנדסה גנטית ותוכנת שיבוט מולקולרית, ביאורים ואחסון רצפי ה- DNA לשימוש מאוחר יותר וכהפניה.

אמת את הפריימרים באופן חישובי לבניית פלסמיד באמצעות תכונות תוכנת השיבוט המולקולרי המובנות, לדוגמה, יישור רצף. כדי ליצור קו תאים יציב, להעביר את מעגלי הגנים העיצוביים ואת התאים הרצויים באמצעות תערובת ליפוזום של DNA מעגל הגן עם רקומבינאז מתאים. לאחר שהתאים הם 80 עד 100% רציפים, להקפיא את התאים בתערובת של 45% מדיה ישנה, 45% מדיה טרייה, ו 10% DMSO.

העבר את התאים הנותרים לצינור סטרילי ובצע מיון של תאים חד-תאיים כדי לבודד תאים חד שבטיים לצלחת של 96 בארות. כשבועיים עד שלושה שבועות לאחר מיון חד שבטי, הבארות בתוך צלחת 96-well צריך להיות foci. כאשר 50 עד 60% מפגש מושגת, לפצל את התאים לצלחת 12-well.

הוסף את הקושחה למעגל LPA המורכב באמצעות מתכנת מיקרו-בקר. לאחר מכן, שלבו חלקים מודפסים בתלת-ממד בלוח המעגלים המורכב באמצעות לוח ההרכבה, לוח המעגלים, מרווח ה- LED, מתאם הצלחת, צלחת בעלת 24 בארות, מכסה צלחת, ברגי הרכבה, אגוזי כנף ורכיבי ערימה. כדי להתחיל בניסוי אופטוגנטי, השתמש בתוכנת הקשתית הזמינה באתר מעבדת תבור כדי לתכנת כרטיס SD עבור ה- LPA ולחקור את תנאי האור המתאימים.

לאחר מכן, הזן ערכי עוצמה עם השכפולים הטכניים עבור החלוקה לרמות הניסיונית הרצויה. הוסף כ -75, 000 תאים לבאר בלוח שחור של 24 באר בנפח כולל של 500 מיקרוליטרים, ולאחר מכן למקם את התאים באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר להם להסתפק במשך שעתיים עד שש שעות. לאחר העברת התאים במכסה המנוע תרבית הרקמות בסוף הדגירה, להסיר את מכסה הפלסטיק ולהוסיף רצועת רדיד דבק לחלק העליון של הצלחת למזעור העברת האור בין הבארות, כך האור יכול להיכנס רק דרך LED הממוקם בתחתית הבאר.

הניחו את הצלחת בחלקים התלת-ממדיים המותאמים של ה-LPA, ולאחר מכן כסו את הצלחת במכסה LPA המודפס בתלת-ממד שמתאים לברגי ההתקן בכל פינה. חבר את ההתקן למקור החשמל ולחץ על לחצן האיפוס בהתקן LPA כדי להבטיח שהגדרות הניסוי המעודכנות של LPA יוחלו וידגרו את התאים. לאחר הדגירה, בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות, הסר את רצועת נייר הכסף מהצלחת ותן לצלחת לשבת במשך דקה עד שתי דקות כדי למנוע עיבוי מלהיווצר על מכסה הפלסטיק.

לאחר מכן, החזירו את מכסה הפלסטיק המקורי לצלחת ודמיינו את התאים עם ניגודיות הפאזה המתאימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. לאחר 24 עד 72 שעות לאחר אינדוקציה, ואחריו טריפסיניזציה, להעביר את כל התוכן של כל באר של כ 500 microliters לצינורות המסומנים מצויד מסננת התא. לאחר מכן, באמצעות תוכנת מכשיר ציטומטריית זרימה מתאימה, צור שער פיזור קדמי וצדדי כדי ללכוד את התאים הבודדים בגודל ובגרגריות המתאימים כדי לא לכלול פסולת וגושים תאיים.

ברגע שהשער מוגדר, ללכוד כ 10, 000 תאים עם השער המתאים ולהתאים את מספר התא בהתאם לכמות הנתונים הסלולריים הנדרשים ולכידת תאים ניסיוניים חוזרים בכל צינור. לאחר אינדוקציה ו טריפסיניזציה, להעביר את כל התוכן של כל באר של כ 500 microliters לצינורות המסומנים. צנטריפוגות התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G.לאחר השלכת supernatant, להעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.

סנכרן מחדש את התאים ב 750 ל 1, 000 microliters של 4%PFA מדולל PBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבור את גושי התא. לאחר 15 דקות של דגירה, להוסיף 750 ל 1, 000 microliters של PBS ושוב פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים, ולאחר מכן גלולה את התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת supernatant, להעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים resuspend התאים ב 750 ל 1, 000 microliters של מתנול קר כקרח כפי שהודגם ולאפשר לתאים לשבת במשך 30 דקות במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, להוסיף 750 ל 1, 000 מיקרוליטרים של PBS תוך על ידי צנרת למעלה ולמטה כמה פעמים. ואז לאחר צנטריפוגת התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה מנוע אדים כימי. לפנק מחדש את התאים ב 100 microliters או דילול מתאים אחר של נוגדן ראשוני שכותרתו פיפטה למעלה ולמטה שש עד שמונה פעמים, ולאחר מכן לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, להוסיף 750 ל 1, 000 מיקרוליטרים של מאגר הדגירה ופתרון פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים, ולאחר מכן צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G.Next, resuspend התאים ב 500 מיקרוליטרים של PBS ולשבור את הגושים על ידי צנרת למעלה ולמטה כמה פעמים. העבר את כל התוכן של כל צינור לצינורות מסומנים עם מסננות תאים. הביאו את התאים למכשירי ציטומטריית זרימה מתאימים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים.

הכיול האופטי בוצע עבור ההתקנים. באמצעות התמונה שנרכשה חושבו ערכי פיצוי עבור נורית LED, אות הרקע הופחת ועוצמת הפיקסלים הוסקה. מקדם הווריאציה היה מינימלי בין 96 בארות.

תוכנת הכיול הדגימה את וריאציית ה-LED לפי מיקום ויצרה כוונון בקנה מידה אפור כך שכל נורת LED מנורמלת לאותה עוצמה. ביטוי גנים הושרה בתאים קלים מהונדסים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית במשכי דופק אור שונים על LPA והתאים צולמו עבור ביטוי ברייטפילד ו- GFP. באמצעות ציטומטריית זרימה, התאים הושרו בערכי אורך דופק שונים והראו תגובת מינון של ביטוי גנים המכומתת ברמת האוכלוסייה של יותר מפי ארבעה שינוי ממצבים לא מושרים.

המשוב השלילי הושג על פני הפחתת רעש של ביטוי גנים פי חמישה כפי שמוצג על ידי השוואת ערכי עוצמת אור שונים למערכת הקלה יותר לעומת חי או אור דולק. ניתוח qPCR הראה כי התאים הקלים המהונדסים הביעו את רמות ה-RNA באופן תגובתי במינון עם יותר מפי עשרה אינדוקציה ממצבים לא מושרים, התואמים לכימות ציטומטריית הזרימה. מעגל הגנים המהונדס הראה כמויות הולכות וגדלות של אור כחול שהביאו לעלייה ברמות חלבון KRAS ורמות ERK זרחתיות.

מספר בדיקות פונקציונליות עשויות להתבצע כולל צמיחה, תנועתיות תאים, ריפוי פצעים, התפשטות, או בדיקות פלישה. שיטות אלה יכולות לספק תובנות ספציפיות על המנגנונים של ביולוגיה של סרטן, בידול רקמות או עמידות לתרופות.