Name: אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: חקור שחזור נוקלאוזומים עם אצטילציה ספציפית של ליזין בהיסטון H3 באמצעות הרחבת קוד גנטי ב-Escherichia coli. שיטה זו מאפשרת ייצור נוקלאוזומים מתאימים למחקר אפיגנטי וביוכימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר ווסלי וונג על הנחת היסודות לפרוטוקול הזה ולחונכותו החשובה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענקים R01GM127575 ו R01GM121584) וקרן וולש (גרנט A-1715).

1. בניית פלסמיד
<ol><li>התחילו בהחלטה איזה חלבון היסטון יהיה אצטילאט ובאיזה אתר ליסטין. מוטציה האתר כדי לעצור ענבר קודון (TAG) באמצעות mutagenesis מכוון האתר. הערה: ישנם ארבעה פלסמידים שתוכננו בעבר מנוצלים לביטוי של חלבוני היסטון. כל ארבעת חלבוני ההיסטון שוכפלו לווקטור pETDuet-1 עם תג היסטידין N-terminal. Histone H4 כולל גם תג SUMO, המקור של colE1 שכפול עם מספר עותק של כ 40, אמיטצילין עמיד, ו מקדם T7.<ol>
<li>עצבו פריימרים קדמיים ומתהווכים המכילים מוטציית TAG באתר הרצוי (החלפת קודון ליצין קיים בקודון עצירת הענבר) באחד מארבעת פלסמידי החלבון של היסטון.</li>
		<li>השתמש ב- PCR שלם כדי להגביר את התג המכיל פלסמיד. קבעו טמפרטורת חישול מתאימה לפריימרים. באופן כללי, טמפרטורת ההיתוך (Tm)של פרייומרים מינוס 5 מעלות צלזיוס יהיה מספיק. אם יש קושי בהשגת מוצר PCR, ניתן להשתמש במעבר טמפרטורה סביב Tm - 5 °C (60 °F) כדי למטב את טמפרטורת חישול להגברה. הערה: בניסוי זה פולימראז PFU מבוטא בתוך הבית שימש במשך 30 מחזורים עם התנאים הבאים: 94 °C (94 °C (30 s (denaturation), חישול טמפרטורה עבור 30 s, ו 72 °C (6 דקות (או 1 דקה לקילו-בייס-זוגות). לפרטים נוספים על סוג זה של שיטת PCR ראו ליו ונייסמית'7.</li>
		<li>נקה את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR על-ידי ביצוע פרוטוקול היצרן. לנתח את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose וכתמים אתידיום ברומיד הבאים.</li>
		<li>Ligate פלסמיד על ידי דגירה עם T4 ligase לילה ב 16 °C (66 °F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ראשית להפוך את תג המכיל פלסמיד (AmpR)לתוך כימית מוסמך Escherichia coli. בחר מינימום של 4 מושבות מהשינוי ולטהר את הפלסמיד. הפוך את מלאי התאים של כל אחד עם גליצרול בשיטות סטנדרטיות ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. שלח רצף כדי לאשר את המוטציה הרצויה TAG.</li>
	<li>לאחר שהרצף מאושר, הפוך במשותף את הפלסמיד המכיל תג (AmpR)עם pEVOL-AckRS (ChlR)לקובB בעל יכולת כימית (הליסין deacetylase ההיסטון היחיד הידוע בתאי BL21 E. coli). pEVOL הוא פלסמיד עם מספר עותק בינוני למקור p15A בעל העתקה נמוכה. הערה: סדרת pEVOL של פלסמידים נבנו בהתבסס על מחקרים קודמים שהראו ביטוי מוגבר של זוג aaRS / tRNATyr אורתוגונלי היה יעיל בהפחתת חיתוך חלבון ובהגדלת התפוקה הכוללת של חלבונים מוטנטים8. אם תאי מחיקה של CobB אינם נגישים, המשך עם תאי BL21 בעלי יכולת כימית. CobB הוא ליצרין ליצרין דמוי סירטואין וניקוטינמיד ניתן להוסיף בריכוז סופי של 5 מ"מ במהלך ביטוי חלבון היסטון כדי לעכב את CobB כגישה חלופית9.</li>
	<li>הפוך מלאי תא ולאחסן ב -80 °C (69 °F).</li>
</ol>2. ביטוי חלבון histone אצטילאט
<ol><li>הכן 1 L של מדיה 2YT autoclaved (או נפח של בחירה) בבקבוק תרבות.</li>
	<li>לחסן 20 מ"ל של 2YT מדיה המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה עם מלאי תאים טרנספורמציה משותפת כי יש פלסמיד המכיל תג (AmpR)ו pEVOL-AckRS (ChlR)ולגדול ב 37 °C (70 °F) כדי OD = 0.6 (4-6 שעות).</li>
	<li>הוסיפו את האנטיביוטיקה המתאימה ל-1 ליטר של מדיה 2YT אוטומטית וחסן עם תרבות המתנע של 20 מ"ל. לגדול ב 37 °C (70 °F) כדי OD = 0.6-0.8 (2-3 שעות).</li>
	<li>הוסף סוכני גרימת אצטיליסין (AcK) לריכוזים הסופיים של IPTG 1 מ"מ, 0.2% arabinose, ו AcK 5 mM.</li>
	<li>לגדל את התרבות ב 37 °C (67 °F) עבור 6-8 שעות.</li>
	<li>כדורי תאים ב 2,700 x g במשך 15 דקות.</li>
	<li>לאחסן את גלולת התא ב -80 מעלות צלזיוס לילה.</li>
	<li>מצעד זה ואילך לשמור את המדגם על הקרח כל הזמן. להמיס את גלולת התא ב 50 מ"ל של מאגר תמוגה היסטון לכל 1 L של תרבות.</li>
	<li>Sonicate על פי המחזור הבא: 1 s על, 1 הנחה, סה"כ בזמן: 3 דקות ב 60% משרעת.</li>
	<li>גופי הכללה גלולה ב 41,600 x g במשך 45 דקות.</li>
	<li>השלך את גופי ההכללה העל-טבעיים וההתחדשות ב- 30 מ"ל של מאגר תמוגה של היסטון. גלולה הכללה bodes ב 41,600 x g במשך 30 דקות.</li>
	<li>השלך את גופי הכללה supernatant ו resuspend ב 30 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה. גופי הכללה גלולה ב 41,600 x g במשך 30 דקות.</li>
	<li>להשליך את גופי הכללה supernatant ולהמיס ב 25 מ"ל של 6 M Guanidine הידרוכלוריד (GuHCl) חיץ. דגירה עם עצבנות ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעות. הערה: במידת הצורך, גופי הכללה ניתן לדגור עם עצבנות לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>גלולה הכללה bodes ב 41,600 x g במשך 45 דקות. דגירה supernatant עם 1 מ"ל של שף Ni-NTA שווה עם 6 M GuHCl חיץ עבור 2 שעות.</li>
	<li>המשך עם טיהור Ni-NTA בתנאים מפורקים. שטפו את העמודה עם נפח של 3 עמודות של מאגר שטיפת עמודות. חלבון histone Elute עם 10 מ"ל של חיץ אלוטיון. הערה: ניסיון לרכז את החלבון כאן הוא אופציה אבל היסטוני אצטילציה הם מאוד בלתי צפויים והוא יכול בקלות לזרז. לא מומלץ להתרכז מעבר ל-2 מ"ל בנפח הכולל.</li>
	<li>דיאליז נרחב חלבון histone אצטילאט נגד 5% חומצה אצטית חוצץ כדי להסיר מלחים. Dialyze עבור 3 שעות בכל פעם ב 4 מעלות צלזיוס, החלפת חיץ טרי מינימום של 6 פעמים. הערה: לשיפור טוהר החלבון, קיימת אפשרות לחייג נגד מים טהורים. עם זאת, זה גורם משקעים משמעותיים וירידה בתפוקה אשר עשוי להיות לא רצוי עבור חלבונים histone אצטילציה בתשואה נמוכה.</li>
	<li>Aliquot ו lyophilize חלבון, ולאחסן ללא הגבלת זמן ב -80 מעלות צלזיוס. חלבוני היסטון מסוג פראי מניבים בדרך כלל 10-50 מ"ג/ל' ואילו חלבוני היסטון עם אצטילאט מניבים פחות מ-10 מ"ג/ליטר בהתאם לאתר הליצין הספציפי. לדוגמה, H3K79Ac ממוצעים 5 מ"ג / ליטר.</li>
</ol>3. ביטוי חלבון היסטון מסוג פראי
<ol><li>להרכבת נוקלאוזומים מלאים, יש לבטא את כל 4 חלבוני ההיסטון. כאשר מבטאים ומטהרים היסטונים מסוג פראי הפרוטוקול זהה להיסטוני האצטילאט למעט הדברים הבאים:<ol>
<li>אל תבצע המרה משותפת. אין להשתמש ב- pEVOL-AcKRS עבור ביטוי histone מסוג בר. התאימו אנטיביוטיקה בהתאם.</li>
		<li>אין להשתמש בקו תא מחיקה של CobB או להוסיף Nicotinamide, AcK או arabinose במהלך אינדוקציה של ביטוי תאי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנת 601 DNA
הערה: רצף דנ"א ממוטב שתוכנן בעבר למיקום נוקלאוזום ישיר מורכב עם תמנוני היסטון כדי לייצר מונונוקלאוזום ביעילות גבוהה. רצף זה נקרא 601 DNA או רצף Widom. רצף זה הפך לרצף הדנ"א הסטנדרטי למחקרי חוץ גופיות של נוקלאוזומים ממסיעות שיפוץ כרומטין למדידות מולקולה אחת10.
<ol><li>כדי להכין כמויות משמעותיות של 601 DNA להרכבה גרעינית, להפוך pGEM-3z/601 לתוך למעלה 10 תאים ולגדול 10 מ"ל של תרבות עבור הגברה פלסמיד ומיצוי. השתמש בערכת חילוץ פלסמיד ופעל בהתאם להמלצת היצרן.</li>
	<li>השתמש בפולימראז PFU מבוטא בתוך הארגון (יעיל יותר) עבור פרוטוקול הגברה זה. הגדר תגובת PCR: לתגובת 250 μL, להשתמש 207.5 μL autoclaved MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL קדימה פריימר: ctggagaatccctggccg, 5 μL הפוך פריימר: acaggatgtatatatctctgacacg, 5 μL dNTP לערבב, 2.5 מיקרול PFU אנזים. אנחנו בדרך כלל רצים 60 תגובות בבת אחת כדי לקבל מספיק DNA להרכיב.</li>
	<li>השתמש בטמפרטורת חישול של 52 °C (70 °F) עבור 30 s וזמן הארכה של 30 s אם באמצעות פולימראז PFU. אחרת, פעל בהתאם לתנאים המומלצים על-ידי היצרנים.</li>
	<li>לאחר ש- PCR נעשה, השתמש בערכת ניקוי PCR לבחירתך כדי לטהר את מוצר PCR.</li>
</ol>5. הרכבה של אוקטמר היסטון
<ol><li>להמיס aliquots של כדורי חלבון histone H2A, H2B, H3, ו H4 כך שיש מלאי נפרד של כל חלבון histone במאגר GuHCl עם נפח כולל של 100 μL.</li>
	<li>לחשב את הריכוז של כל חלבון histone על ידי מדידת ספיגת A280.</li>
	<li>אם הספיגה גדולה מ-1 עבור חלבון כלשהו, יש לדלל עם מאגר GuHCl כדי לקבל ריכוז מדויק יותר.</li>
	<li>ערבבו חלבוני H2A ו-H2B ביחס טוחנת של 1:1 ודללו לריכוז חלבון כולל של 4 מיקרוגרם/μL. חזרו על הפעולה עבור H3 ו-H4.</li>
	<li>חייג ברצף ב- 4 °C (70 °F) מול מאגר TE של 2 M למשך לילה, מאגר TE M אחד עבור 2 שעות ומאגר TE של 0.5 M למשך 5 שעות. הערה: השלב השני והשלישי של הדיאליזה גורם קונפורמציות לא יציבות של חלבון לזרז החוצה. הוא צפוי לראות משקעים כבדים בשלבים אלה.</li>
	<li>הסר משקעים על ידי צנטריפוגה ב 16,800 x g ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שוב, לחשב את הריכוז של דימרים histone (תערובת H2A / H2B) ו tetramers (תערובת H3/H4) מדידת ספיגת A280.</li>
	<li>מערבבים דימרים וטטרמה ביחס טוחנת של 1:1 ומתאימים את NaCl ל-2 מ' על ידי תוספת של NaCl מוצק.</li>
	<li>תמנון Histone ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס והוא יציב יותר מאשר dimers ו tetramers. לעולם אל תקפיא את תמנון היסטון מכיוון שזה יכול לגרום לפירוק.</li>
	<li>אם הרכבה עם היסטוני אצטילאט, פשוט להחליף את החלבון סוג הבר עם חלבון אצטילאט בהליך.</li>
</ol>6. הרכבה נוקלאוזום
<ol><li>השתמש במאגר TE 100x וב- NaCl מלא כדי להתאים 601 דנ"א למאגר TE של 2M. הוסף את ה- DNA של 601 במאגר TE של 2M לתמנון histone ביחס טוחנת של 0.85:1 ל- 0.90:1. ניתן להוסיף יחס נמוך יותר של דנ"א אם קיים דנ"א חופשי בניתוח משמרת הג'ל.</li>
	<li>מעבירים את תערובת הדנ"א-histone לשקית דיאליזה ומניחים כ-200 מ"ל של מאגר TE 2M (או יותר אם מרכיבים דגימות מרובות) ומערבבים בעדינות רבה ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הגדר משאבה פריסטלית לטיהור כדי לטפטף באיטיות ללא מאגר TE מלח. כאשר עוצמת הקול הוכפלה בערך, שפוך חצי מעוצמת הקול. עשה זאת לפחות 4 פעמים בסך הכל. עם משאבה זה יכול לקחת 4-8 שעות בהתאם לנפח ההתחלה. גרעינים נוצרים כאשר ריכוז המלח מצטמצם ל-150 מ"ר (נמדד על ידי מד מליחות).</li>
	<li>לאחר ריכוז המלח מצטמצם ל 150 מ"מ, dialyze נגד מאגר TE 20 מ"מ לילה.</li>
	<li>הסר משקעים על ידי צנטריפוגה ולמדוד את הריכוז של הגרעינים על ידי קריאהA 260 באמצעות קורא צלחת.</li>
	<li>הוסף פרוטאז His-TEV (TEV: נוקלאוזום 1:30, w:w) ודגר לילה ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל תגי היסטידין. הסר את זיהומים תג היסטידין מתמיסת הגרעין על ידי שף Ni-NTA למשוך למטה.</li>
	<li>כדי למקם את הגרעין הומוגנית המדגם, דגירה ב 60 °C (60 °F) במשך 1 שעות. הערה: עבור אתרים עם אצטילאט שאינם יציבים במיוחד, ייתכן שצעד זה לא מומלץ.</li>
	<li>יש לאחסן גרעינים לטווח קצר (כמה שבועות) ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחסון לטווח ארוך, נוקלאוזומים dialyze נגד מאגר אחסון ולאחסן ב -80 °C (60 °F).</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר על ידי אף אחד מהכותבים.

זה חיוני כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה בכל פרט במהלך ניסוי. Nucleosomes אינם יציבים מאוד הרבה ניסוי וטעייה נכנסה לתוך קביעת פרוטוקול זה. זה המפתח להסרת משקעים בכל שלב (או בכל פעם שנצפה) כי חלקיקים יכולים בקלות להפריע לתהליכי ההרכבה. תמיד לשמור דגימות היסטון על קרח. אם נוקלאוזומים מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב מדי, הם יכולים לפרק באופן ספונטני. הקפד לבדוק את כל הדגימות על ידי דף מקורי אם מאוחסן ב 4 °C (70 °F) במשך יותר מ 2 שבועות לפני השימוש בכל ניסוי. הימנע תמציות מערבולת ונוקלאוזומים כמו זה יכול גם לגרום להם לפרק. א...

השתמשנו ב-PylRS וב-tRNAPyl כדי לסנתז ולהרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטוני אצטילציה ספציפיים לאתר. PylRS הוכיחה את עצמה ככלי להרחבת קוד גנטי לייצור חלבונים עם שינויים לאחר תרגום (PTMs) והתפתחה גנטית כדי לשלב כ -200 ncAAs שונים. PylRS משלבת בקודון עצירת ענבר, הסרת תחרות מחומצות אמינו אחרות במהלך התרגום. PylRS התגלה לראשונה בארכיאולוגיה מתנוגנית, ומאז נוצל בביולוגיה כימית כדי לשלב קבוצות כימיות תגובתיות חדשניות לחלבונים1,2.
MmAcKRS1 התפתח מ מתנוזרצ'ינה mazei PylRS ומשמש לעתים קרובות במעבדה שלנו לסינתזה של חלבונים acetylated3,4,5,6. MmAcKRS1 מספק AcK באתר מוטציה ענבר mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia קולי. טכניקה זו שימשה בעבר לשלב AcK ב K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, ו K79 היסטון H3 לידין אתרים ללמוד את הפעילות של Sirtuin 1, 2, 6, ו 7 על מונונוקלאוזומים acetylated4,5,6. כאן אנו מפרטים שיטה זו כדי להביע היסטונים אצטילאטים ו לבנות מחדש נוקלאוזומים acetylated.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ' מאגר TE</td><td>NA</td><td></td><td>NA 0.5 מ' NaCl, 20 מ"מ טריס, 1 מ"מ EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>1 מ' מאגר TE</td><td>NA</td><td></td><td>NA 1 מ' NaCl, 20 מ"מ טריס, 1 מ"מ EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>100x מאגר TE</td><td>NA</td><td></td> NA <td></td></tr><tr><td>2 מ' מאגר TE</td><td>NA</td><td></td><td>2 מ' NaCl, 20 מ"מ טריס, 1 מ"מ EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>20 מ"מ מאגר TE NA</td><td></td><td>NA</td><td>20 מ"מ NaCl, 20 מ"מ Tris, 1 מ"מ EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 מ"מ GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M גואנידיניום כלוריד, 20 מ"מ Tris, 500 מ"מ NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>מאגר שטיפת עמודים</td><td></td><td></td> אצטיליזין <td>NA NA 6 מ' אוריאה, 500 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס, 20 מ"מ אימידזול pH 7.8</td></tr><tr><td>מאגר אלוטיון</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td> Fisherbrand&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> משאבת העברה כימית בזרימה משתנה</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV פרוטאז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה היסטון</td><td>NA</td><td></td><td>NA 60 מ"מ Tris, 100 מ"מ NaCl, 0.5% טריטון-X100 (v/v), 1 מ"מ PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>שרף</td><td></td><td></td> Ni-NTA <td>6 מ' אוריאה, 500 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס, 250 מ"מ אימידזול, ערכת ניקוי pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>מאגר שטיפת גלולה</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 מ"מ Tris, 100 מ"מ NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>מאגר אחסון</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 מ"מ NaCl, 20 מ"מ Tris, 20 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 20% גליצרול, pH 7.8</td></tr><tr><td>תרמציקלר</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב escherichia קולי

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

חלבוני histone אצטילאט יכול לבוא לידי ביטוי בקלות ב Escherichia coli קידוד מוטציה, Nε-אצטיל-ליצין (AcK) ספציפי מתנוסרצ'ינה מזי פירוסין tRNA-סינתטאז (MmAcKRS1) ו tRNA קוגנטיבי שלה (tRNAPyl)להרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטון אצטילאט ספציפי לאתר. MmAcKRS1 ו- tRNAPyl מספקים AcK באתר מוטציה ענבר ב mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia coli. טכניקה זו שימשה בהרחבה כדי לשלב AcK באתרי ליזין H3. סינתזת Pyrrolysyl-tRNA (PylRS) ניתן גם להתפתח בקלות לשלב חומצות אמינו לא קאנוניות אחרות (ncAAs) עבור שינוי חלבון ספציפי לאתר או פונקציונליזציה. כאן אנו מפרטים שיטה לשלב AcK באמצעות מערכת MmAcKRS1 לתוך H3 histone ולשלב חלבוני H3 אצטילאט לתוך mononucleosomes מחדש. מונונוקלאוזומים משוחזרים אצטילאטים יכולים לשמש מבחנים ביוכימיים ומחייבים, קביעת מבנה ועוד. השגת מונונוקלאוזומים מותאמים היא חיונית לתכנון ניסויים הקשורים לגילוי אינטראקציות חדשות והבנת אפיגנטיקה.

ניתן להעריך דימרים, טטרמרים ושמיניות על ידי הפעלת ג'ל SDS PAGE של 12%(איור 1 ואיור 2). כאן ניתן לראות שלחלק מהטטרמרים בעלי האצטילאט יש תשואה נמוכה יותר מאחרים (איור 1). למעשה, ככל שאזור הליבה קרוב יותר לאזור הליבה, כך התשואה נצפתה נמוך יותר. זה ככל הנראה בשל אצטילציה להפריע להרכבה של tetramer קרוב יותר אתה מקבל לאזורי הליבה. השפעה דומה נצפית לאחר הרכבת תמנונים (איור 2). ...

כאן אנו מציגים שיטה לבטא חלבוני histone אצטילאט באמצעות הרחבת קוד גנטי להרכיב נוקלאוזומים מחדש במבחנה.

אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

השגת מונונוקלאוזום שונה היא חיונית לתכנון ניסויים אפיגנטיים. הפרוטוקול שלנו מספק מונונוקלאוזומים משוחזרים שעברו אצטילציה שניתן להשתמש בהם בבדיקות ביוכימיות וקשירה, קביעת מבנה ועוד. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא הרבגוניות שלה.ניתן לשנות מערכת זו בקלות כדי לשלב סוגים רבים של שינויים במונוקלאוזומים. התחל בהכנת ליטר אחד של מדיה 2YT שעברו חיטוי בבקבוק תרבית. חסנו 20 מיליליטר של המדיה המכילה אנטיביוטיקה מתאימה עם מלאי התאים הטרנספורמציה המשותפת שיש לו את התג המכיל פלסמיד ו-pEVOL-AckRS וגדל אותם ב-37 מעלות צלזיוס כדי להשיג OD של 0.6.הוסף אנטיביוטיקה מתאימה בליטר אחד של חומר 2YT שעבר חיטוי וחסן אותו ב-20 מיליליטר של תרבית התחלה. גדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש כדי לקבל OD של 0.6, 2.8. הוסף חומרים מעוררים ו-AcK לריכוז סופי של IPTG מילימולרי אחד, 0.2% ארבינוז וחמישה מילי-מולארי AcK.גדל את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה שעות. לאחר מכן גלולה את התאים ב -2, 700 x גרם למשך 15 דקות ואחסנו אותם למשך הלילה במינוס 80 מעלות צלזיוס. ממיסים את הגלולה ב-50 מיליליטר של מאגר ליזה היסטון לליטר תרבית וסוניקציה של התאים במשרעת של 60% למשך שלוש דקות במרווחי הפעלה של שנייה אחת ושנייה אחת כבויה.גופי הכללת גלולה ב 41, 600 x גרם למשך 45 דקות. השליכו את הסופרנטנט ולאחר מכן השעו מחדש את גופי ההכללה ב-30 מיליליטר של מאגר ליזה היסטון, ואז צנטריפוגה שוב למשך 30 דקות. השעו מחדש את גופי ההכללה ב-30 מיליליטר של מאגר שטיפת גלולות וחזרו על הצנטריפוגה.לאחר מכן, ממיסים גופי הכללה ב -25 מיליליטר של שישה מאגר גואנידין הידרוכלוריד מולרי. דגירה בתסיסה בחום של 37 מעלות למשך שעה, ואז צנטריפוגה למשך 45 דקות. דגרו את הסופרנטנט עם מיליליטר אחד של שרף ניקל-NTA מאוזן עם שישה מאגר גואנידיניום הידרוכלוריד טוחנת למשך שעתיים והמשיכו בטיהור ניקל-NTA בתנאים דנטורציה.שטפו את העמוד עם שלושה נפחי עמודות של מאגר כביסה, ואז הוצאו חלבון היסטון אצטילי עם 10 מיליליטר של מאגר פליטה. יש לבצע דיאליזה של חלבון ההיסטון האצטילי כנגד חומצה אצטית של 5% כדי להסיר מלחים למשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס, ולהחליף את המאגר לפחות שש פעמים. Aliquot ו- Lipolyze חלבון ומאוחסנים ללא הגבלת זמן במינוס 80 מעלות.ממיסים כמויות של כדורי חלבון היסטון H2A, H2B, H3 ו-H4 כך שיהיה מלאי נפרד של כל חלבון היסטון במאגר גואנידיניום הידרוכלוריד לנפח כולל של 100 מיקרוליטר. חשב את הריכוז של כל חלבון היסטון על ידי מדידת הסופגים ב-280 ננומטר. אם הספיגה גדולה מ-1 עבור חלבון כלשהו, יש לדלל עם מאגר גואנידיניום הידרוכלוריד כדי לקבל ריכוז מדויק יותר.שלב H2A עם H2B ו-H3 עם חלבוני H4 ביחס מולארי של אחד לאחד ודלל לריכוז חלבון כולל של ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר. יש לבצע דיאליזה ברצף בארבע מעלות צלזיוס כנגד שני מאגר TE מולארי למשך הלילה, מאגר TE מולרי אחד למשך שעתיים ומאגר TE מולארי של 0.5 למשך חמש שעות. בסיום, צנטריפוגה ב 16, 800 x גרם בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את המשקעים.חשב את ריכוז הדימרים והטטרמרים של היסטון על ידי מדידת ספיגה ב-280 ננומטר. מערבבים את הדימרים והטטרמרים ביחס מולארי של אחד לאחד ומכוונים את ריכוז הנתרן הכלורי ל-2M. התאם 601 DNA למאגר TE דו-מולארי באמצעות מאגר TE 100X ונתרן כלורי מוצק.הוסף את התמיסה לאוקטמר ההיסטון ביחס מולרי של 0.85, 2.9 לאחד. העבירו את תערובת ה-DNA היסטון לשקית דיאליזה והניחו אותה על כ-200 מיליליטר של שני מאגר TE מולארי תוך ערבוב עדין מאוד בארבע מעלות צלזיוס. הגדר משאבה פריסטלטית כדי לטפטף לאט פנימה מאגר TE ללא מלח.כאשר הנפח הוכפל בערך, שפכו מחצית מהנפח. עשה זאת לפחות ארבע פעמים, מה שיכול לקחת ארבע עד שמונה שעות בהתאם לעוצמת הקול ההתחלתית. לאחר הפחתת ריכוז המלח ל-150 מילי-מולאר, יש לבצע דיאליזה כנגד מאגר TE של 20 מילי-מולרי למשך הלילה.הסר משקעים על ידי צנטריפוגה ומדוד את ריכוז הנוקלאוזומים בעזרת קורא צלחות. הוסיפו פרוטאז של ה-TEV שלו ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל תגי ההיסטידין. לאחר מכן הסר את זיהומי תג ההיסטידין מתמיסת הנוקלאוזום עם משיכה כלפי מטה של שרף ניקל-NTA.דגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי למקם את הנוקלאוזום ולהומוגניזציה של הדגימה. אחסן נוקלאוזומים בארבע מעלות צלזיוס לטווח קצר. לאחסון לטווח ארוך, יש לבצע דיאליזה של נוקלאוזומים כנגד מאגר האחסון ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.לחלק מהטטרמרים האצטיליים הייתה תשואה נמוכה יותר מאחרים כפי שהוערך על ידי הפעלת ג'ל SDS-PAGE של 12%. ככל שקרוב יותר לאזור הליבה, כך התשואה הנצפית נמוכה יותר. זה היה ככל הנראה בגלל האצטילציה, שהפריעה למכלול האוקטמר.לאחר הרכבת אוקטמרים עם רצף ה-DNA 601, ניתן להעריך את הנוקלאוזום באמצעות ג'ל PAGE מקורי 5%1X TBE ואחריו צביעה באתידיום ברומיד. לפני המיקום התרמי, רצועות הנוקלאוזום הנצפות רחבות מאוד ועשויות לפס. בעת ביצוע פרוטוקול זה, שמור את החלבונים על קרח כל הזמן.חיוני לשמור על דימרים מורכבים, טטרמרים ונוקלאוזום. הליך זה אפשר לחוקרים להתקין את אתרי האצטיל ליזין, במיוחד במונוקלאוזומים, ופתח את הדלת לחקר שינויים לאחר תרגום בהקשר של כרומטין. ניתן להתאים אותו בקלות להתקנת כל מספר של חומצות אמינו לא קנוניות.

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

פרוטוקול ביטוי קל לשימוש ונטול תאים לשילוב ספציפי לשאריות של אנלוגים של חומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים, כולל ניתוח במורד הזרם, מוצג למחקרים רפואיים, פרמצבטיים, מבניים ופונקציונליים.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

פרוטוקול זה מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. במקביל, סימטרית שלאחר translationally נוקלאוזום שונה יכול להיווצר לאחר שימוש בעותק היסטון premodified. תכשירים אלה יכולים לשמש בקלות ללמוד מנגנוני crosstalk השינוי, בו זמנית משני ההיסטונים אחותו, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה.

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

הרחבת הקוד הגנטי מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל חלבון acetylation. כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול נתיישב לנצל בטכניקה זו ליצירת homogeneously acetylated חלבונים באתרים ספציפיים בתאים Escherichia coli .

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

מחקר זה קבע שיטה המשתמשת בהרחבת הקוד הגנטי כדי לשלב בהצלחה את לקטיל-ליזין (Klac) באתרים ספציפיים של האנולאז-1 (hENO1) והסופרפולקציה GFP (sfGFP) באשריכיה קולי ותאי יונקים.

לקטילציה ליזין ספציפית לאתר באמצעות התרחבות קוד גנטי ב-E. coli ובתאים יונקים

חקור שחזור נוקלאוזומים עם אצטילציה ספציפית של ליזין בהיסטון H3 באמצעות הרחבת קוד גנטי ב-Escherichia coli. שיטה זו מאפשרת ייצור נוקלאוזומים מתאימים למחקר אפיגנטי וביוכימי.

אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי

גלה סרטונים נוספים