Name: הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בשלבי החיים המוקדמים של דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: למד שיטה לבחינת הצטברות מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בזברה דגיגים בשלבי התפתחות מוקדמים. השיטה מאפשרת הדמיה וכימות של אצירת חלקיקים בחוריון, שק החלמון והמעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21777145, 22076170), והתוכנית לחוקרי צ'אנגג'יאנג וצוות מחקר חדשני באוניברסיטה (IRT_17R97).

דגי זברה בוגרים מקורם במרכז המשאבים של דגי הזברה בסין (ווהאן, סין). הניסויים נערכו בהתאם למדריך הלאומי "הנחיות לבעלי חיים במעבדה לבדיקה אתית של רווחת בעלי חיים (GB/T35892-2018).
1. אוסף עוברים
<ol><li>לשמור על דגים 20 L מיכלי זכוכית עם מערכת מי ברז מסונן פחם (pH 7.0 ± 0.2) בטמפרטורה קבועה (28 ± 0 °C (60 °F) על photoperiod של 14:10 שעות אור: כהה.</li>
	<li>להאכיל דגים פעמיים ביום עם ארטמיה נאופלי. מומלץ כי האוכל ניתן לכל היותר 3% משקל דגים ליום ויש לאכול בתוך 5 דקות בכל פעם14.</li>
	<li>מעבירים דג זברה בוגר מפותח (עם אורך גוף של 3-4 ס"מ) למיכל ההשרצה ביחס של זכר אחד לשתי נקבות בלילה שלפני הרבייה. הערה: למחרת בבוקר, הדגים מתחילים להשריץ לאחר תחילת מחזור האור.</li>
	<li>לאסוף ביצים באמצעות פיפטה פסטר. יש לשטוף עם 10% מהתמיסה של האנק מספר פעמים, ולאחר מכן לבדוק אם יש הפריה באמצעות מיקרוסקופ. ביצים מופרות לעבור את תקופת המחשוף לאחר כ 2 שעות לאחר הפריה (hpf) והוא יכול להיות מזוהה בבירור15.</li>
	<li>דגירה העוברים מופרית 500 מל המכיל 200 מל של 10% הפתרון של האנק עם 1% כחול מתילן לחיטוי ב 28 °C (69 °F). אין לחרוג מקצב הטעינה של פתרון עובר אחד/2 מ"ל. הערה: 10% הפתרון של האנק מורכב 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mMNa 2HPO4, 0.44 מ"מ KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4 ו 4.2 mM NaHCO3.</li>
</ol>2. הכנת מתלים מיקרופלסטיק
<ol><li>Sonicate את פתרון המלאי של חרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים ירוקים שכותרתו (10 מ"ג / מ"ל) בקוטר נומינלי של 500 ננומטר (עירור / פליטה: 460/500 ננומטר) במשך 10 דקות.</li>
	<li>לדלל את פתרון המניה עם 10% הפתרון של האנק לייצר את פתרונות החשיפה הרצויים (0.1, 1, ו 10 מ"ג / ליטר).</li>
	<li>תמיד להכין את פתרונות החשיפה של מיקרופלסטיק לפני החשיפה. הערה: יש לנקוט זהירות בעת הערכת ההשפעות הרעילות של מיקרופלסטיק, כי נוכחותם של חומרים משמרים, כגון נתרן אזיד, בניסוחים החלקיקים המסחריים, יכולה להיות רעילה לאורגניזמים שונים 16. לכן, תוספים אלה יש להסיר או בחשבון את הפקדים לפני ביצוע ניסוי רעילות.</li>
</ol>3. חשיפה מיקרופלסטיק
<ol><li>בחר באופן אקראי 6 עוברים מופרים טריים (4 כ"ס), ולאחר מכן העברה לכל באר של צלחת 6 באר המכילה 5 מ"ל של פתרונות מיקרופלסטיק עם ריכוזים שונים. כלול את קבוצות הבקרה המכילות 10% מהפתרון של האנק.<ol>
<li>השתמש בארות משולשות (עם סך של 18 עוברים) עבור כל טיפול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה העוברים תחת אותו אור: מחזור כהה וטמפרטורה כמבוגרים (ראה 1.2) ולהתבונן כל 12 שעות. הסר את המתים מיד.</li>
	<li>לחדש את הפתרונות מיקרופלסטיק 90% כל 24 שעות. במהלך תקופת החשיפה, הדגים אינם ניזונים. הערה: בדרך כלל, הבקיעה של העובר מתחילה ב 48 hpf ומשלימה על 72 hpf.</li>
</ol>4. הערכת התפלגות מיקרופלסטיק
<ol><li>ב 24, 48, 72, 96, ו 120 שעות לאחר ההפריה, לבחור באופן אקראי את העוברים / הזחלים (אחד מכל אחד משלושת השכפולים) ולשטוף עם 10% הפתרון של האנק.</li>
	<li>מעבירים את הזחלים לצלחת פטרי וחושפים ל-0.016% טריקאין להרדמה.<ol>
<li>הכינו את פתרון המלאי של הטריקאין: 4 מ"ג אבקת טריקאין מומסים ב-100 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, ומתאימים את ה-pH ל-7.0 עם Tris-HCl (pH 9.0). אחסן את תמיסת המלאי במקפיא.</li>
		<li>הכן את פתרון העבודה. לדלל את פתרון המניה לריכוז הרצוי (0.016%) עם 10% הפתרון של האנק בטמפרטורת החדר14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מסדרים את העוברים/הזחלים ומתכוננים לתצפית.</li>
	<li>שימו לב לדגים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותמונה עם תוכנת הדמיה.</li>
	<li>כימתו את עוצמת הפלואורסצנטיות בדגים באמצעות ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+Scientific+Perspective+on+Microplastics+in+Nature+and+Society%22">A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society</a>. , SAPEA. Berlin. (2019).</li>
<li>Plastics Europe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plastics-the+facts+2019%22">Plastics-the facts 2019</a>. , Plastics Europe. Brussels. (2019).</li>
<li>Andrady, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+the+marine+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Pollution+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Microplastics in the marine environment.</a> Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).</li>
<li>Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proceedings+of+the+International+Research+Workshop+on+the+Occurrence%2C+Effects+and+Fate+of+Microplastic+Marine+Debris%5BTitle%5D)+AND+%22National+Oceanic+and+Atmospheric+Administration+Technical+Memorandum%22%5BJournal%5D)">Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris.</a> National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).</li>
<li>Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastic+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microplastic in aquatic ecosystems.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).</li>
<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollutant+toxicology+with+respect+to+microalgae+and+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria.</a> Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).</li>
<li>Huang, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+microplastics+impairs+digestive+performance%2C+stimulates+immune+response+and+induces+microbiota+dysbiosis+in+the+gut+of+juvenile+guppy+%28Poecilia+reticulata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata).</a> Science of the Total Environment. 733, 138929(2020).</li>
<li>Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastic+brain%3A+neurotoxicity+of+micro-+and+nanoplastics%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics.</a> Particle and Fibre Toxicology. 17, 24(2020).</li>
<li>Jakubowska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+exposure+to+microplastics+of+different+polymer+types+on+early+life+stages+of+sea+trout+Salmo+trutta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta.</a> Science of the Total Environment. 740, 139922(2020).</li>
<li>Qiang, L., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+polystyrene+microplastics+impairs+gonads+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio).</a> Chemosphere. 263, 128161(2021).</li>
<li>Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+and+molecular+damage+in+Nile+Tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+after+exposure+to+microplastics%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics.</a> Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).</li>
<li>Burns, E. E., Boxall, A. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+the+aquatic+environment%3A+Evidence+for+or+against+adverse+impacts+and+major+knowledge+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).</li>
<li>Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+aquatic+environments%3A+Toxicity+to+trigger+ecological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences.</a> Environmental Pollution. 261, 114089(2020).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+reio%29.+4th+ed%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+assessments+of+micro-+and+nanoplastics+can+be+confounded+by+preservatives+in+commercial+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations.</a> Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).</li>
<li>Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+survey+on+the+use+and+welfare+of+zebrafish+Danio+rerio+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Biology%22%5BJournal%5D)">International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research.</a> Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).</li>
<li>Pitt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+tissue+distribution%2C+and+toxicity+of+polystyrene+nanoparticles+in+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).</li>
<li>Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9, 1608-1618 (2013).</li>
</ol>

המחבר אינו מצהיר על אינטרסים מתחרים או כספיים.

על פי ההנחיה להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות, כגון הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU, אישור אתיקה של בעלי חיים אינו חובה לניסוי בשלבי חיים מוקדמים של דגי זברה עד לשלב היכולת להאכיל באופן עצמאי (5 ימים לאחר ההפריה)17. עם זאת, שיטת הרווחה הטובה ביותר חשובה לאופטימיזציה של השימוש בזברה, למשל, השיטות ההומניות של הרדמה והמתת חסד צריכות להדאיג. אתיל 3-אמינובנזואט מתנסולפט (MS-222, או tricaine), הסוכן בשימוש שגרתי ברוב המעבדות, מועסק כאן להרדמה והמתת חסד.
לפני התצפית מ...

מאז מסונתז לראשונה בשנת 1900, פלסטיק נמצאים בשימוש נרחב בתחומים שונים, וכתוצאה מכך צמיחה מהירה של הייצור העולמי1. בשנת 2018 יוצרו ברחבי העולם כ-360 מיליוןטוןפלסטיק. הפלסטיק בסביבה הטבעית יתפרק לחלקיקים עדינים עקב תהליכים כימיים, פיזיקליים או ביולוגיים3. בדרך כלל, חלקיקי פלסטיק עדינים <5 מ"מ בגודל מוגדרים מיקרופלסטיק4. מיקרופלסטיק מתוכנן גם עבור יישומים ספציפיים, כגון microbeads ממוצרי קוסמטיקה5. כמזהמים כמעט קבועים, מיקרופלסטיק מצטבר בסביבה, ומשכו תשומת לב גוברת ממדענים, קובעי מדיניות והציבור1,6. מחקרים קודמים תיעדו כי מיקרופלסטיק עלול לגרום לתופעות לוואי בדגים, כגון נזק למערכת העיכול7, neurotoxicity8, הפרעה אנדוקרינית9, מתח חמצוני10 ונזק DNA11. עם זאת, הרעילות של מיקרופלסטיק לא נחשפה במלואה עד כה12,13.
עוברי זברה מציעים יתרונות ניסיוניים רבים, כולל גודל קטן, הפריה חיצונית, שקיפות אופטית ומצמדים גדולים, ונחשבים כאורגניזם מודל אידיאלי לחקר ההשפעות של מזהמים על דגים בשלבי חיים מוקדמים. בנוסף, רק כמויות מוגבלות של חומרי בדיקה נדרשים להערכת תגובות ביולוגיות. כאן, עוברי זברה נחשפים לריכוזים שונים של מיקרופלסטיק (0.1, 1, 10 מ"ג / ליטר) במשך 5 ימים, ואת ביואקומולציה והפצה של מיקרופלסטיק בעוברים / זחלים זברה מוערכים. תוצאה זו תקדם את הבנתנו לגבי הרעילות של מיקרופלסטיק לדגים, ואת השיטה המתוארת כאן ניתן להכליל באופן פוטנציאלי כדי לקבוע את הצטברות והפצה של סוגים אחרים של חומרים פלואורסצנטיים בשלבי החיים המוקדמים של זברה.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>ניקון, יפן</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>ירוק חרוזי פוליסטירן עם תווית פלואורסצנטית</td><td>זרחן, ארה"ב</td><td>2103A</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בשלבי החיים המוקדמים של דגי זברה

Accumulation and Distribution of Fluorescent Microplastics in the Early Life Stages of Zebrafish

כסוג חדש של מזהם סביבתי, מיקרופלסטיק נמצא באופן נרחב בסביבה הימית ומהווה איום גבוה על אורגניזמים ימיים. הביואקומולציה של מיקרופלסטיק ממלאת תפקיד מרכזי בהשפעות הרעילות שלהם; עם זאת, כחלקיקים, הביואקומולציות שלהם שונות ממזהמים רבים אחרים. המתוארת כאן היא שיטה אפשרית כדי לקבוע חזותית את הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק בעוברים זברה או זחלים באמצעות מיקרופלסטיק פלואורסצנטי. עוברים נחשפים לריכוזים שונים (0.1, 1 ו-10 מ"ג/ליטר) של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בקוטר של 500 ננומטר ל-120 שעות. זה מוצג בתוצאות כי מיקרופלסטיק יכול bioaccumulate בעוברים זברה / זחלים באופן תלוי ריכוז. לפני הבקיעה, פלואורסצנטיות חזקה נמצא סביב chorion עוברי; בעוד בזחלים זברה, שק החלמון, קרום הלב, ומערכת העיכול הם האתרים המצטברים העיקריים של מיקרופלסטיק. התוצאות ממחישות את ספיגת והפנמה של מיקרופלסטיק בזברה בשלבי חיים מוקדמים, אשר יספקו בסיס להבנה טובה יותר של ההשפעה של מיקרופלסטיק על בעלי חיים ימיים.

ההתפלגות וההצטברות של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי מוצגות באיור 1 ובטבלה 1. לא נצפתה פלואורסצנטיות גלויה בקבוצה (פקד) שלא נחשפו. עם זאת, הצטברות של פלואורסצנטיות נמצא סביב chorion לאחר חשיפה לריכוזים שונים של מיקרופלסטיק (24 hpf). פלואורסצנטיות ירוקה מזוהה גם בזחלים, ונראה כי רמות הפלואורסצנטיות עולות באופן תלוי ריכוז וזמן. שק החלמון, קרום הלב ומערכת העיכול הם האתרים המצטברים העיקריים של מיקרופלסטיק(איור 2).
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

עוברים/זחלים של דגי זברה מתפתחים חיצונית והם שקופים אופטית. הביואקומולציה של מיקרופלסטיק בדגים בשלבי חיים מוקדמים מוערכת בקלות עם מיקרוביאדות בעלות תווית פלואורסצנטית.

As a new type of environmental pollutant, microplastic has been widely found in the aquatic environment and poses a high threat to aquatic organisms. The ...

הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בשלבי החיים המוקדמים של דגי זברה. מבוא. הביואקומולציה של מיקרופלסטיק לשחק תפקיד מפתח ההשפעות הרעילות שלהם. עם זאת, כמו חלקיקים, bioaccumulations שלהם שונים מזהמים רבים אחרים.המתוארת כאן היא שיטה אפשרית כדי לקבוע חזותית את הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק בעוברים זברה או זחלים באמצעות מיקרופלסטיק פלואורסצנטי. הניסויים נערכו בהתאם לקו המנחה הלאומי של מעבדת בעלי החיים לבדיקה אתית של רווחת בעלי החיים. אחד, אוסף עוברים.דגי זברה בוגרים מקורם במרכז המשאבים של דגי הזברה בסין. דגים נשמרים במיכלי זכוכית 20 ליטר עם מערכת מי ברז מסוננת פחם בטמפרטורה קבועה, כלומר, 28 מעלות צלזיוס, על פוטופריוד של 14 ו -10 שעות, אור: כהה. דגים ניזונים פעמיים ביום עם ארטמיה נאופלי.מומלץ כי המזון ניתן לכל היותר 3% משקל דגים ליום, ויש לאכול אותו תוך חמש דקות בכל פעם. דגי זברה בוגרים מפותחים מועברים למיכל ההשרצה ביחס של זכר אחד לשתי נקבות בלילה שלפני הרבייה. למחרת בבוקר, הדגים מתחילים להשריץ לאחר תחילת מחזור האור.ביצים נאספות באמצעות פיפטה פסטר, שטף עם 10% הפתרון של האנק מספר פעמים, ולאחר מכן נבדק להפריה באמצעות מיקרוסקופ. ביצים מופרות עוברות את תקופת המחשוף לאחר הפריה של כשעתיים וניתן לזהותן בבירור. העוברים המופריים דגירה ב 500 מיליליטר המכילה 200 מיליליטר של 10% התמיסה של האנק עם 1% כחול מתילן לחיטוי ב 28 מעלות צלזיוס.קצב הטעינה אינו עולה על עובר אחד בכל פתרון של 2 מיליליטר. שתיים, הכנת מתלים מיקרופלסטיק. פתרון המלאי של חרוזי פוליסטירן ירוקים עם תווית פלואורסצנטית בקוטר נומינלי של 500 ננומטר הם sonicated במשך 10 דקות.לדלל את פתרון המניה עם 10% הפתרון של האנק לייצר את פתרונות החשיפה הרצויים, כלומר 0.1, 1 ו 10 מיליגרם לליטר. פתרונות החשיפה של מיקרופלסטיק תמיד מוכנים טריים לפני החשיפה. שלוש, חשיפה למיקרופלסטיק.שישה עוברים שזה עתה הופרו נבחרים באקראי, ולאחר מכן מועברים לכל באר של שש צלחת באר המכילה חמישה מיליליטר של פתרונות מיקרופלסטיק עם ריכוזים שונים. קבוצות הבקרה המכילות את הפתרון של האנק 10% כלולות. בארות משולשות, עם סך של 18 עוברים, משמשים עבור כל טיפול.העוברים הם דגירה תחת אותו מחזור כהה בהיר וטמפרטורה כמו מבוגרים, והם נצפו כל 12 שעות. המתים מוסרים מיד. פתרונות המיקרופלסטיק מתחדשים ב-90% כל 24 שעות.במהלך תקופת החשיפה, הדגים אינם ניזונים. בדרך כלל, הבקיעה של העובר מתחילה בהפריה של 48 שעות לאחר ההפריה ומשלימה בערך 72 שעות לאחר ההפריה. ארבע, הערכה של התפלגות מיקרופלסטיק.ב 24-48-72-96-ו 120 שעות לאחר ההפריה, העוברים והזחלים, אחד מכל אחד משלושת השכפולים, נבחרים באופן אקראי ושטוף עם 10% הפתרון של האנק. העוברים והזחלים מסודרים ומוכנים להשגחה. לפני כן, הזחלים מועברים לצלחת פטרי, ונחשפים ל-0.016% טריקאין להרדמה.הדגים נצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי, ומדובבים בתוכנת הדמיה. עוצמת הפלואורסצנטיות בדגים מכומתת עוד יותר עם ImageJ NIH. תוצאות מייצגות.הוא הראה בתוצאות כי מיקרופלסטיק יכול bioaccumulate בעוברים זברה וזחלים באופן תלוי ריכוז. לפני הבקיעה, פלואורסצנטיות חזקה נמצא סביב chorion עוברי;בעוד זחלים דג זברה, שק החלמון, קרום הלב, ומערכת העיכול הם האתרים המצטברים העיקריים של מיקרופלסטיק. דיון. תוצאה זו תקדם את הבנתנו לגבי הרעילות של מיקרופלסטיק לדגים, ואת השיטה המתוארת כאן ניתן להכליל באופן פוטנציאלי כדי לקבוע את הצטברות והפצה של סוגים אחרים של חומרים פלואורסצנטיים בשלבי החיים המוקדמים של זברה.מאז chorion ישמש מחסום יעיל נגד חלקיקים עם גודל גדול, תהליך dechorionation לפני החשיפה עשויה להיות נחוצה. עם זאת, העובר עם chorion שלם מומלץ יותר להעריך את ecotoxicity של מזהמים כאשר בוחנים את מצב החשיפה בעולם האמיתי. ההתנהגות של מיקרופלסטיק בתמיסה היא קריטית גם הזמינות הביולוגית.יש לעקוב אחר המאפיינים הפיזיוכימיים של מיקרופלסטיק לאורך משך החשיפה.

accumulation-distribution-fluorescent-microplastics-early-life-stages

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

אנו מציגים שיטה חדשנית למיקרו-גבג' (microgavage) של זחלי דגי זברה תוך שימוש בציוד סטנדרטי להזרקה של עוברים ובמיקרוסקופ סטריאו. אנו מדגימים כי מיקרו-גבג' היא טכניקה בטוחה ויעילה, המועילה להחדרה של כמויות מבוקרות של חומרים מגוונים באופן ספציפי אל תוך חלל המעי של זחלי דגי זברה.

Microgavage של זחלי דג זברה

מקור: Zhang, X., et al. מודל עובר דג זברה להדמיה in vivo וניתוח תוך-חיוני של זיהום סטפילוקוקוס זהוב הקשור לביו-חומר. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית של עוברי דג זברה שהוזרקו עם Staphylococcus aureus, המאפשר כימות של התקדמות הזיהום והתפלגות החיידקים כדי להעריך את ההשפעה של מיקרוספירות ביו-חומר על אינטראקציות מארח-פתוגן in vivo.

 הדמיה פלואורסצנטית של זיהום חיידקי הקשור לביו-חומר בעוברי דג זברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

דג הזברה מתגלה כמודל רב ערך של עיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. מתוארים פרוטוקולים של הזנת זחלים עשירה בשומנים, הדמיה חיה של אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים תזונתיים וכימות צריכת מזון. ניתן ליישם טכניקות אלו במגוון טכניקות סינון, הדמיה וחקירה מונעת השערות.

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד את זמן העברה של fluorescently עם תוויות מזון דרך המעי של הזחל דג זברה אופנה תפוקה גבוהה.

מדידת תפוקה גבוהה הבטן מעבר הזמן באמצעות זחל דג זברה

הנוכחי הוא פרוטוקול מפורט עבור השימוש של עוברי הדגים Tg (vtg1: mCherry) לאיתור אפקטים אסטרוגניים. הפרוטוקול מכסה את התפשטות הדג והטיפול של עוברים, ומדגיש את האיתור, תיעוד, והערכה של אותות פלורסנט הנגרמת על ידי תרכובות משבשים האנדוקרינית (EDC).

שימוש Tg (Vtg1: mcherry) עוברי דג Zebrafish כדי לבדוק את ההשפעות אסטרוגניים של תרכובות משבשי האנדוקרינית

פרוטוקול ניסיוני מפורט מוצג במאמר זה להערכת רעילות נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים באמצעות מודל הזחלים דג זברה, כולל תהליך החשיפה ובדיקות אינדיקטורים נוירוהתנהגותית.

לימוד השפעות נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים על הזחלים של דגי הזאב

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

למד שיטה לבחינת הצטברות מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בזברה דגיגים בשלבי התפתחות מוקדמים. השיטה מאפשרת הדמיה וכימות של אצירת חלקיקים בחוריון, שק החלמון והמעי.

הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בשלבי החיים המוקדמים של דגי זברה

גלה סרטונים נוספים