Name: בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למד שיטה לבדיקת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות מעכברים, תוך שימוש ב-HPLC-ECD ובאינקובציה בצלחת 48 בארות. השיטה מאפשרת הבחנה בין מנגנוני שחרור וזולה ומהירה לבדיקות תרופתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן ייזום Fondecyt N 11191049 J.A.P. ו NIH מענק DA038598 ל- G.E.T.

כל הניסויים, כולל טיפול בבעלי חיים ואיסוף רקמות, בוצעו בהתאם לאוניברסיטת פלורידה ולוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המכללה העירונית של ניו יורק (IACUC), בעקבות הפרוטוקול המאושר 201508873 (UF) ו- 1071 (CCNY). עבור ריאגנטים ומאגר אנא עיין בקובץ המשלים.
1. הכן פרוסות מוח חולדה חריפה
הערה: בניסוי זה חולדות זכר מבוגר (250-350 גרם) שימשו. עם זאת, מערך זה פונקציונלי עבור נקודות התפתחותיות שונות, חולדות נקבה, ומינים אחרים. אם משתמשים בחיה קטנה יותר, כגון עכברים, הנסיין עשוי להתאים את עצמו כדי לייעל את הפרוטוקול באמצעות מספר שונה של פרוסות מוח או אגרופים לכל תנאי. מאגר הניתח ייקרא Buffer 1; מאגר שפכים ייקרא מאגר 2.
<ol><li>הכן מאגר 1 כפי שצוין בקובץ המשלים. חוצץ רווי 1 עם חמצן על ידי מבעבע עם 95%/5% (O2/CO2) למשך 20 דקות על קרח. מוציאים 50 מ"ל של Buffer 1, ומצננים על קרח בכוס קטנה או צלחת פטרי. חוצץ זה משמש כדי להחזיק את המוח כולו שנקטף בחריפות.</li>
	<li>להרדים חולדה בוגרת אחת או שתיים (250-350 גרם) עם 1%-2% איזופלוראן, לערוף את ראשן באמצעות גיליוטינה ולהסיר במהירות את מוחם. מיד למקם את המוח במאגר מחומצן קרח 1 במיכל מ שלב 1.1. הערה: ודא איזופלוראן גיליוטינה משמשים בבטחה. פתח איזופלוראן מתחת למכסה המנוע.</li>
	<li>בעזרת ויברטום או דחיסה, חתכו מקטעי מוח קורורליים של 300 מיקרומטר מכל אזור מעניין (איור 1). מאגר מבעבע 1 חייב להיות נוכח בעת נעשה מקטעים. בעזרת מרית נירוסטה, מעבירים בזהירות ובמיידי פרוסות מוח לצלחת פטרי חדשה מלאה במאגר מחומצן קר כקרח 1 (איור 2).</li>
	<li>ניתוח נוסף של פרוסות המוח (למשל, אגרופים, חיתוך) על-ידי הזזה זהירה של הפרוסות לשקופיות זכוכית (איור 1G) באמצעות אטלס מוח חולדה57. לדוגמה, לזהות את הסטריאטום של הגעש המבוסס על המבנה הכהה והמפוסך שלו, ולזהות את ההיפוקמפוס בהתבסס על קרבתו לקליפת המוח ומבנה הספירלה הייחודי. ניתן להפריד את האונה הימנית והשמאלית לשימוש כפרוסות שליטה וניסוי (איורים 2G - H). כאן, הסטריאטום של החזרה נותח עוד יותר לאגרופים של 2 מ"מ (איור 1G).</li>
	<li>באמצעות פיפטה העברת פלסטיק עם קצה חתוך, להעביר פרוסות או אגרופים במוח לתוך מיכלים קטנים שקועים חוצץ קר קרח מחומצן 1 עם חמצן מבעבע. מיכלים אלה עשויים להיות רשת נירוסטה, או מנות פטרי קטנות מלאות חוצץ (איור 1H).</li>
</ol>2. שחרור מונואמין אנדוגני Ex-vivo מפרוסות מוח או אגרופים
הערה: ההתקן המשמש עבור סעיף זה מורכב מצלחת של 48 באר ומחזיק רקמות העשוי משש יחידות סינון מיקרו-צנטריפוגה ללא מסנני החדירה המחוברים לקו קרבוגן (איור 2). כדי להפוך את המחזיק, להשתמש מוט פלסטיק יציב (למשל, מגרד תא) וסופר להדביק את יחידות מסנן microcentrifuge ללא מסנני inset אליו. תן לו להתייבש במשך 1-2 ימים. הזמן הנדרש לניסוי שחרור מונואמין אנדוגני וריכוזים של אמפטמין, פלואוקסטין וקוקאין מבוססים על הספרות הנוכחית והפרוטוקולים הקודמים13,20,58.
<ol><li>
הפעלת רקמות
	<ol>
<li>העבר את רקמת המוח מצעד 1.1.5 לכל באר של תא השפכים ואפשר התאוששות למשך 30-50 דקות ב-37 °C (37 °C) על מחמם שקופיות ב-0.5-1 מ"ל של Buffer 2 מחומצן, עם מבעבע מתמיד ועדין (איור 2B1).</li>
		<li>במהלך דגירה זו, לדלל את התרופות לריכוז הרצוי לניסוי. כל התרופות חייבות להיות מומסות במאגר 2, והריכוזים מבוססים על הספרות הנוכחית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דגירה ראשונה
	<ol>
<li>הזז את מחזיק הרקמה עם רקמת המוח לבארות המכילות 500 μL של חוצץ מחומצן 2 ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C (57 °F). ודא כי מאגר מינימלי עד ללא מועבר על ידי הקשה על המחזיק בקצה הבאר עד שאין מאגר עודף במחזיק.</li>
		<li>בניסויים עם חומרים פרמקולוגיים כגון מעכבי משגר מונואמין, דגירה על דגימות הרקמות עם התרופות המדוללות במאגר מחומצן 2 (למשל, 10 מיקרומטר פלואוקסטין, 40 מיקרומטר קוקאין; ראו איור 2B2). הנפח הסופי בכל באר יהיה 500 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דגירה שנייה
	<ol>
<li>העבר את המחזיק עם הרקמה לסט חדש של בארות המכילות 500 μL סה"כ Buffer 2 עם או בלי הריכוז הרצוי של כל תרופה. ודא שאין שאריות מאגר עודפות. כל באר מייצגת n = 1 עבור תנאי ניסוי. כל מצב ניסיוני מבוצע במשולש.</li>
		<li>באר אחת כוללת חוצץ מחומצן 2, הבא 10-30 μM AMPH, ואת הבאר הסופית כוללת 10-30 μM אמפר בתוספת מעכבי משגר מונואמין. כל תרופה מומסת במאגר מחומצן 2.</li>
		<li>לדגור את הרקמה במשך 20 דקות ב 37 °C (500 μL) של מצב התרופה. הערה: בארות נוספות עשויות לכלול מאגר K+ גבוה מחומצן 2 עם או בלי מעכבי טרנספורטר מונואמין. להמיס כל תרופה במאגר מחומצן 2 (500 μL).</li>
		<li>במהלך הדגירה השנייה של 20 דקות, לאסוף את הפתרון מן בארות מן הדגירה הראשונה בשלב 2.2.1 ולעבור צינורות microcentrifuge המכיל 50 μL של 1 N חומצה פרכלורית או חומצה זרחתית (תלוי בסוג של HPLC, ריכוז סופי 0.1 N). הנפח הסופי של המדגם יהיה 550 μL. לשמור על צינורות microcentrifuge על קרח, ולתייג את הצינורות #1.</li>
		<li>לאחר הדגירה השנייה של 20 דקות, להזיז את מחזיק הרקמה עם מקטעי מוח או אגרופים לבאר ריקה ולשמור על הצלחת על קרח. העבר את supernatant לצינורות microcentrifuge המכיל 50 μL של 1 N חומצה פרכלורית או חומצה זרחתית. הנפח הסופי של המדגם יהיה 550 μL. לשמור על צינורות microcentrifuge על קרח, ולתייג את הצינורות #2.</li>
		<li>יש להוסיף מ"ל אחד של Buffer 1 קר כקרח לכל רקמה המכילה היטב. לאסוף את כל הרקמה באמצעות פינצטה קטנה, ולהעביר צינורות microcentrifuge נקי.</li>
		<li>לשמור על צינורות עם רקמת המוח ב -80 °C (80 °F). השלך את 1 מ"ל של מאגר 1 (איור 2B4).</li>
		<li>פתרונות סינון המתקבלים מכל דגירה באמצעות צינורות מסנן microcentrifuge (0.22 מיקרומטר) ב 2,500 x g עבור 2 דקות. השתמש בסינון כדי לקבוע תוכן מונואמין באמצעות HPLC עם זיהוי אלקטרוכימי (איור 2B5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. כדאיות רקמות
<ol><li>MTT אסייד הערה: חשש משמעותי לגבי התקנה ניסיונית זו היא כדאיות רקמות כמו הרקמה עשויה לשמש עד כמה שעות59. בדיקת MTT 60,61 משמשת לקביעת כדאיות הרקמות עד סוף הניסוי. מבדק זה מבוסס על ההמרה של מלח טטרזוליום צהוב MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד) לגבישי פורמזן סגולים על ידי תאים ברי קיימא עם חילוף חומרים נאות.<ol>
<li>לאחר הניסוי לשמור על קבוצה נפרדת של דגימות רקמה ולהפריד אותם לשתי קבוצות.</li>
		<li>לדגור קבוצה אחת במשך 20 דקות ב 37 °C ב Triton X-100 (1%) מומס במאגר 2 כפקד. טריטון X-100 טיפול תוצאות מוות תאים. שמור על הקבוצה השנייה במאגר 2, ואל תידגר בטריטון X-100 (בקרת כדאיות רקמות).</li>
		<li>הוסף MTT (פתרון מלאי 5 מ"ג / מ"ל ב PBS, pH 7.4) לשתי הקבוצות במאגר מחומצן 2 לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל.</li>
		<li>לדגור את דגימות הרקמה במשך 20 דקות ב 37 °C ,, לשטוף עם PBS, ולהעביר לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 250 μL של תערובת של SDS (10%, w / v), DMF (25%, v / v), ומים כדי להמיס את גבישי formazan.</li>
		<li>לדגור את הדגימות עבור 24 שעות.</li>
		<li>צנטריפוגות הצינורות ב 10,000 x g במשך 10 דקות ולמדוד את הספיגה של supernatant (200 μL) ב 562 ננומטר ו 690 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוח. כדאיות הרקמות מחושבת כדלקמן: (A562-A690)/משקל רקמות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח HPLC של מונומינים
<ol><li>כימות שחרור מונואמין מכל מצב ניסיוני באמצעות HPLC-ECD בהתאם לפרוטוקולים קודמים13,44, באמצעות עמודת שלב הפוך.<ol>
<li>הכן את השלב הנייד הנדרש לזיהוי. זה מורכב 100 mM חומצה זרחתית, 100 mM חומצת לימון, 0.1 mM EDTA-Na2, 600 מ"ג / L חומצה אוקטנסולפונית, 8% v / v acetonitrile (pH סופי 6.0). הרכב השלב הנייד תלוי בסוג HPLC ובעמודה בהם נעשה שימוש.</li>
		<li>הגדר את הפוטנציאל של הגלאי האלקטרוכימי (אלקטרודת פחמן מזוגגת 2 מ"מ,) ל 0.46 V, והגדיר את קצב הזרימה ל 0.05 מ"ל / דקה.</li>
		<li>טען 5 μL של כל דגימה, כולל תקני נוירוטרנסמיטר לתוך HPLC עבור autoinjection וזיהוי. כמות כל דגימה שנוספה תלויה בסוג HPLC המשמש.</li>
		<li>לאחר ש-HPLC השלים את ההפעלה, השתמש בתוכנת הניתוח הנתונה HPLC כדי לרכוש ולנתח את נתוני הכרומטוגרפיה.</li>
		<li>לנתח תוכן מונואמין באמצעות עקומה סטנדרטית המורכבת מכל מונואמין (דופמין: DA, נוראדרנלין: NE, וסרוטונין: 5-HT; איור 2C). השתמש בכרומטוגרמה המתקבלת כדי להשיג את האזור שמתחת לעקומה (AUC) בהתבסס על הנחיות היצרן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הכנת רקמות לכימות חלבונים
<ol><li>
חלבון אסייד
	<ol>
<li>הוסיפו חיץ תמוגה קר כקרח בתוספת מעכבי פרוטאז (0.1 גרם/1 מ"ל) לכל צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מקטעי מוח/אגרופים והומוגניזציה באמצעות הומוגניזר עלה. צינורות microcentrifuge חייב להישמר על קרח תוך הומוגניזציה כדי למנוע השפלת חלבון.</li>
		<li>רקמת דגירה הומוגנטים עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F) עם סיבוב אור.</li>
		<li>רקמת צנטריפוגה הומוגנטית ב 16,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (55 °F) לשחזר את supernatant.</li>
		<li>קבע ריכוז חלבון בסופרנטאנטים, עם אלבומין בסרום בקר (BSA) כסטנדרט.</li>
		<li>לנרמל את התוכן מונואמין בכל דגימת מוח לתכולה הכוללת של חלבון (מיקרוגרם) נמדד 250 μL של רקמת המוח lysed. השתמש בנוסחה שלהלן כדי לקבוע את חלבון nmol מונואמין/g. df = גורם דילול.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62127/62127eq01.jpg">
6. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>לנתח שחרור מונואמין (nmol/g) באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של Sidak להשוואות שלאחר הוק.</li>
	<li>לנתח את הכדאיות של הרקמות באמצעות מבחן t של סטודנט לא מנוצל לקבוצות עצמאיות (בקרה לעומת 1% טריטון X-100).</li>
	<li>עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים, הגדר את רמת האלפא ≤ 0.05.</li>
</ol>

למחברים אין גילויים.

מדידות שחרור מונואמין בוצעו במשך שנים במספר מערכות כגון תאים הטרולוגיים, תרביות עצביות, סינפטוזומים במוח, פרוסות מוח חריפות ex vivo, ובעלי חיים שלמים13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . תכשירי...

שפע של מחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות קשורות dysregulation או תחזוקה מספקת של נוירוטרנסמיטר מונואמין (דופמין [DA], סרוטונין [5-HT], נוראדרנלין [NE]) הומאוסטזיס1,2,3. תנאים אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, דיכאון1,2, סכיזופרניה2, חרדה2, התמכרות4, גיל המעבר5,6,7, pain8, ומחלת פרקינסון3. לדוגמה, מספר מודלים חולדה של גיל המעבר הראו כי dysregulation או הפחתת מונומינים בתוך ההיפוקמפוס, קליפת המוח הקדם מצחית, סטריאטום עשוי להיות קשור הן דיכאון וירידה קוגניטיבית, אשר נראה אצל נשים חווה גיל המעבר. dysregulation של מונומינים בדגמים אלה נבדקו בהרחבה באמצעות HPLC-ECD, אם כי המחקרים לא להפלות בין תוכן נוירוטרנסמיטר נמדד לעומת שחרור נוירוטרנסמיטר 5,6,7. מונומינים משתחררים באופן קלאסי לחלל החוץ-תאי באמצעות שחרור רכבים תלוי Ca2+, והם ממוחזרים בחזרה דרך מערכת ספיגה מחדש של קרום הפלזמה שלהם (משגר דופמין, DAT; טרנספורטר סרוטונין, SERT; משגר נוראדרנלין, NET)10,11. לעומת זאת, הנתונים מצביעים על כך שמשגרים אלה מסוגלים לשחרר או efflux monoamines, שכן תרופות של התעללות כגון אמפטמין (AMPH) ו 3,4-מתילנדיוקסימטאמפטמין (MDMA) ידועים לשחרר DA ו 5-HT, בהתאמה באמצעות מערכות טרנספורטר שלהם12,13,14,15,16,17 . לכן, הבנה מכנית נכונה של דינמיקת שחרור מונואמין חיונית לפיתוח תרופות ספציפיות וממוקחות.
מגוון רחב של טכניקות שימשו לחקר שחרור מונואמין כגון Voltammetry מחזורי סריקה מהירה (FSCV)18, ב microdialysis vivo13, הדמיה19, דגירה מוקדמת עם מונומימינים radiolabeled20, אופטוגנטיקה, ולאחרונה, חיישנים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית ו photometry21,22 . FSCV ו- in vivo microdialysis הן הטכניקות העיקריות המשמשות לחקר שחרור מונואמין. FSCV משמש לחקר שחרור אקסוציאוטי מגורה של, בעיקר, DA בפרוסות מוח חריפה ב- vivo23. מכיוון ש- FSCV משתמש באלקטרודות כדי לעורר או לעורר שחרור, המקור העיקרי לשחרור נוירוטרנסמיטר הוא שחרור רכבים תלוי Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . במיקרודיאליזה של Vivo בשילוב עם HPLC מודדים שינויים ברמות הנוירוטרנסמיטר החוץ-תאי באמצעות בדיקה הממוקמת באזור מוח של עניין13,32. בדומה ל- FSCV, מגבלה מרכזית למיקרודיאליזה של ויוו היא הקושי לקבוע את מקור שחרור הנוירוטרנסמיטר: שחרור רכב תלוי Ca2+ או טרנספורטר תלוי. ראוי לציון, שתי השיטות מאפשרות מדידה ישירה של שחרור מונואמין. באמצעות ההתקדמות האחרונה של אופטוגנטיקה, המחקר מדגים זיהוי של שחרור 5-HT ו DA ב- תוחלת זמן קצרה עם ספציפיות מעולה סוג תא21,22. עם זאת, אסטרטגיות אלה דורשות טכניקות וציוד מורכבים ויקרים, ולמדוד בעקיפין שחרור מונואמין, במיוחד באמצעות מונואמין מחייב קולטנים. יתר על כן, מונמינים radiolabeled משמשים גם לחקר דינמיקת מונואמין. מונומינים Radiolabeled עשוי להיות טעון מראש לתוך מערכות מודל שונות כגון תאים הטרולוגיים overexpressing כל משגר מונואמין20,33,34,35,36,37,38,39,40, נוירונים ראשוניים20, synaptosomes33,39,41, 42, ופרוסות מוח חריפות43,44. עם זאת, רדיואקטיביות מהווה נזק פוטנציאלי לנסיין, וייתכן שהניתוחים המסומנים על ידי טריטיום לא יתמכו בנאמנות על דינמיקת מונואמין אנדוגני45,46. מערכות Superfusion בשילוב עם שיטות זיהוי לא קו כגון HPLC-ECD אפשרו זיהוי של מונומינים ממקורות רקמות מרובים. כאן, פרוטוקול זה מספק כשיטה ממוטבת ובעלות נמוכה, פשוטה ומדויקת באמצעות פרוסות מוח חריפות כדי למדוד ישירות את שחרור הבזל אנדוגני ומונואמין מגורה.
פרוסות מוח חריפות מאפשרות לבחון השערות מכאניסטיות, בעיקר כאשר הן משמרות את המיקרו-סביבה האנטומית, ושומרות על סינפסות שלמות47,48,49,50,51,52. במספר מחקרים, פרוסות מוח חריפות או רקמת מוח קצוצה שימשו בשילוב עם טכניקת superfusion באמצעות KCl כדי לעורר Ca2 + שחרור מתווך53,54,55,56. מערכות Superfusion היו קריטיות כדי לקדם את ההבנה של השדה של מנגנוני שחרור נוירוטרנסמיטר, כולל מונונמינים. עם זאת, מערכות אלה יקרות יחסית, ומספר התאים הזמינים לניתוח רקמות נע בין 4-12. לשם השוואה, השיטה המוצגת כאן היא זולה, מאפשרת מדידה של 48 דגימות רקמה, וניתן לזקק אותו לשימוש עד 96 דגימות רקמה. כל באר בתוך צלחת 48-well מכיל מחזיקי רקמות המשתמשים במסננים כדי להפריד את המוצר ששוחרר מן הרקמה, מונמינים משוחררים נאספים לאחר מכן מנותחים על ידי HPLC-ECD. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת מדידה סימולטנית של 5-HT, DA, ו- NE לשחרר מאזורים שונים במוח כגון קליפת המוח הקדם מצחית, ההיפוקמפוס, ואת סטריאטום געש לאחר טיפול עם סוכנים פרמקולוגיים המווסתים שחרור מונואמין. לכן, הנסיין יכול לענות על שאלות מרובות באמצעות מערכת רב-באר זולה המגבירה את מספר הדגימות שנבדקו ובכך מפחיתה את מספר בעלי החיים המשמשים.

<table><tbody><tr><td>48 באר צלחת</td><td>NA</td><td>NA</td><td>מבחן</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>פישר מדעי</td><td>A998-1</td><td>שלב נייד</td></tr><tr><td>סידן כלוריד אקוטי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C1016</td><td>שונה נוזל מוחי מלאכותי או מאגר פליטה</td></tr><tr><td>בהירות תוכנה</td><td>Anetc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>שלב נייד</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>1002608421</td><td>דיסקציה</td></tr><tr><td>מאגר DMF</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D4551</td><td>MTT מבחן</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>נייד שלב</td></tr><tr><td>GraphPad תוכנה</td><td>Graphpad, Inc</td><td></td><td>ניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G5516</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>HPLC, עשור אמפרומטרי</td><td>Anetc</td><td></td><td>HPLC, מערכת LC-EC</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Amuza</td><td></td><td>HPLC HTEC-510.</td></tr><tr><td>L-Asrobic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>מאגר דיסקציה</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>סיגמא</td><td>7487-88-9</td><td>KH מאגר</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה יחידות סינון UltraFree</td><td>Millipore</td><td>C7554</td><td>Assay - 6 כדי להתאים ל-48 באר</td></tr><tr><td>צלחת MTT</td><td>Thermo Fisher</td><td>M6494</td><td>MTT</td></tr><tr><td>Assay Nanosep</td><td>VWR</td><td>29300-606</td><td>מבחן; בדיקת חלבון</td></tr><tr><td>חומצה אוקטנסולפונית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>V800010</td><td>שלב נייד</td></tr><tr><td>Pargyline Clorohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8013</td><td>נוזל מוחי מלאכותי שונה או מאגר פליטה</td></tr><tr><td>חומצה זרחתית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>שלב נייד</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>12636</td><td>KH מאגר</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>1001655559</td><td>KH Buffer</td></tr><tr><td>VF-21-0Z</td><td>Precissonary</td><td></td><td>Compresstome</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2714</td><td>מאגר ליזה.</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>מאגר דיסקציה</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S5761</td><td>מאגר דיסקציה</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>S3014</td><td>KH מאגר</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>' L3771</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T8787</td><td>מאגר MTT מבחן / ליזה</td></tr></tbody></table>

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

נוירוטרנסמיטורים מונואמין קשורים ל מחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות רבות. מודלים בעלי חיים של תנאים כאלה הראו שינויים בשחרור נוירוטרנסמיטר מונואמין דינמיקה ספיגה. שיטות מורכבות מבחינה טכנית כגון אלקטרופיזיולוגיה, סקירה מהירה ולטמטריה מחזורית (FSCV), הדמיה, מיקרודיאליזה ויוו, אופטוגנטיקה, או שימוש רדיואקטיביות נדרשים ללמוד תפקוד מונואמין. השיטה המוצגת כאן היא גישה דו-שלבית ממוטבת לזיהוי שחרור מונואמין בפרוסות מוח חריפות באמצעות צלחת 48 באר המכילה מחזיקי רקמות לבחינת שחרור מונואמין, וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ECD) למדידת שחרור מונואמין. בקצרה, חלקים במוח חולדה המכילים אזורים של עניין, כולל קליפת המוח הקדם מצחית, היפוקמפוס, וסטריאטום שרירי אל-קדם הושגו באמצעות פורס רקמות או ויברטום. אזורים מעניינים אלה נותחו מכל המוח ודגרו במאגר פיזיולוגי מחומצן. הכדאיות נבדקה לאורך כל קורס הזמן הניסיוני, על ידי בדיקה 3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT). אזורי המוח ניתחו באופן חריף דוגרו בתנאי סמים שונים הידועים כמזינים לשחרור מונואמין באמצעות המשגר (אמפטמין) או באמצעות הפעלה של שחרור אופניים אקסוציאוטיים (KCl). לאחר הדגירה, המוצרים שפורסמו בסופרנט נאספו ונותחו באמצעות מערכת HPLC-ECD. כאן, שחרור מונואמין בזאלי מזוהה על ידי HPLC מפרוסות מוח חריפות. נתונים אלה תומכים בתוצאות קודמות של vivo ו- in vitro המראים כי AMPH ו- KCl גורמים לשחרור מונואמין. שיטה זו שימושית במיוחד לחקר מנגנונים הקשורים לשחרור תלוי מונואמין טרנספורטר ומספקת הזדמנות לסנן תרכובות המשפיעות על שחרור מונואמין באופן מהיר ובעלות נמוכה.

טכניקה זו מתארת את השימוש בפרוסות המוח כדי למדוד את שחרורם של מונומינים אנדוגניים באמצעות HPLC עם זיהוי אלקטרוכימי המבוסס על צלחת 48 באר עם מחזיק רקמות פנימי. מערך ניסיוני מתואר באיור 1 ובאיור 2. בתחילה, כדי להבטיח את הכדאיות של הרקמה עד סוף הניסוי, בוצעה בדיקת MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד, בדיקת טטרזול). לאחר ניסויים פונקציונליים, פרוסות המוח החריפות פעילות מטבולית ונשארות ברות קיימא בהשוואה לאלה שדו...

שיטה זו מציגה טכניקה פשוטה לזיהוי של שחרור מונואמין אנדוגני באמצעות פרוסות מוח חריפות. ההתקנה משתמשת בלוח 48 באר המכיל מחזיק רקמות לשחרור מונואמין. מונואמין ששוחרר מנותח על ידי HPLC יחד עם זיהוי אלקטרוכימי. בנוסף, טכניקה זו מספקת שיטת סינון לגילוי סמים.

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

טכניקה זו היא התאמה של שיטות נפוצות לבחינת שחרור מונואמין, המאפשרות מדידת שחרור אנדוגני ולא מונומינים טעונים מראש רדיובל בתנאים פרמקולוגיים מרובים בבת אחת. היתרונות העיקריים לטכניקה זו הם כי זה חסכוני למדי, תנאים פרמקולוגיים מרובים ניתן לבחון בבת אחת, ואנחנו יכולים ללמוד שחרור מונואמין אנדוגני עם היכולת להבחין בין ניסיון ושחרור מתווך טרנספורטר. כדי להכין פרוסות מוח ממבוגרים 250 עד 350 גרם חולדות זכר לאחר הקציר, מיד להציב את המוח ואת קרח קר מחומצן חוצץ, ולרכוש 300 מקטעי מוח קורוני מיקרון מכל אזור של עניין.לניתוח נוסף של פרוסות המוח, הזיזו בזהירות את הרקמות לשקופיות זכוכית והשתמשו באטלס מוח חולדה כדי לזהות את הסטריאטום של הגעש בהתבסס על המבנה המפוספס הכהה שלו, ולזהות את ההיפוקמפוס בהתבסס על קרבתו לקליפת המוח והמבנה הספירלי הייחודי שלו. הפרד את האונה הימנית והשמאלית לשימושם כשליטה ופרוסות ניסיוניות. ניתן לנתח עוד יותר את הסטריאטום של החזרה לשני מילימטרים.לאחר מכן השתמש pipette העברת פלסטיק עם קצה שונה כדי להעביר את הדגימות לתוך מיכלים קטנים שקועים חיץ ניתוח קר קרח מחומצן עם מבעבע חמצן. כדי לגרום לשחרור מונואמין, להעביר את דגימות הרקמה לכל באר של תא שפכים מותאם אישית 48 טוב המכיל 0.5 כדי אחד מיליליטר של חוצץ שפכים לכל טוב עם מבעבע עדין מתמיד ולאפשר את הדגימות להתאושש במשך 30 עד 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף תקופת שיווי משקל, להעביר את מחזיק הרקמה עם רקמת המוח לבארות המכילות 500 microliters של חיץ שפכים מחומצן עם או בלי סוכן פרמקולוגי, הקשה על המחזיק על קצה הבאר כדי למנוע העברה מינימלית של חוצץ בין בארות עבור דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, להעביר את המחזיק לסט חדש של בארות המכילות 500 microliters של חוצץ שפכים עם או בלי התרופה של עניין ולהחזיר את הצלחת לחממה תרבית התא במשך 20 דקות נוספות. במהלך הדגירה השנייה, העבירו את הפתרון מהבארות מהדגירה הראשונה לצינורות מיקרוצנטריפוגה המכילים 50 מיקרוליטרים של חומצה פרכלורית או זרחתית רגילה אחת על קרח, ותייגו את הצינורות מספר אחת"בסוף הדגירה השנייה, הזיזו את מחזיק הרקמה לבארות ריקות עם הצלחת על הקרח והעבירו את הסופרנטנטים מדגירה השנייה לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים המכילים 50 מיקרוליטרים של פרכלורי או זרחתי אחד רגיל חומצה על קרח. סמן צינורות אלה מספר שתיים"כאשר כל supernatants הועברו, להוסיף מיליליטר אחד של חוצץ ניתוח קר קרח לכל באר של רקמה ולהשתמש פינצטה קטנה להעביר כל דגימת רקמה לצינור microcentrifuge חדש.הסר את המאגר מצינורות הדגימה ולאחסן את הרקמות במינוס 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את פתרונות הדגירה שנאספו לתוך צינורות מסנן microcentrifuge עבור צנטריפוגה ומניחים את הסינון על קרח עד ניתוח HPLC. הגדר את הפוטנציאל של ה- ECD וקצב הזרימה להמלצת היצרן לאיתור מונומינים. טען ו- aliquot מתאים של כל מדגם, כולל תקני משדר עצבי לתוך HPLC להזרקה אוטומטית וזיהוי ולאפשר את המכשיר כדי להשלים את הניתוח.לאחר מכן השתמש בתוכנת הניתוח של HPLC כדי לרכוש ולנתח את נתוני הכרומטוגרפיה באמצעות עקומה סטנדרטית המורכבת מכל מונואמין כדי להשיג את השטח שמתחת לעקומה בהתבסס על הנחיות היצרן. לאחר שש שעות של ניתוח פונקציונלי, דגימות רקמה נשארות קיימא, בעוד דגימות דגירה עם 1% Triton X-100 להפגין ירידה משמעותית טרנספורמציה MTT. טיפול חריף של 20 דקות בחלקי מוח בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית עם אמפטמין גורמת לעלייה משמעותית ברמה החוץ-תאית של כל מונואמין.כאשר הדגימות מטופלות מראש עם פלואוקסטין, מעכב ספיגה חוזרת של סרוטונין סלקטיבי, אמפטמין המושרה עלייה בסרוטונין חוץ תאי בתוך ההיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית אינה מתרחשת, בעוד הגידול בייצור דופמין ונוראפינפרין חוץ תאי אינו מושפע. בנוסף, טיפול חריף של 20 דקות של אגרופים סטריאטום הגב עם אמפטמין גורם לעלייה של פי 35 ביטוי רמת דופמין חוץ תאי, בעוד טיפול אגרוף סטריאטום הגב עם קוקאין, חוסם משגר מונואמין, תוצאות עיכוב משמעותי של אמפטמין המושרה דופמין חוץ תאי. הגדלת הריכוז של אשלגן כלורי חוץ תאי כדי לעורר דה-פולאריזציה של הממברנה מספיקה כדי לגרום לשחרור אקסוציאוטי של מונומינים בהשוואה לתנאי בקרה לא מטופלים, ולא פלואוקסטין ולא טיפול בקוקאין חוסמים את הגידול העמוק הזה.זה הכרחי יש קטעים לחתוך נקי, לוקליזציה מדויקת של אגרופים, ולשמור על חמצון עקבי לאורך כל הניסוי. ניתן להשתמש במקטעי המוח לאחר ניסויים לעיבוד וניתוח ביוכימיים נוספים, כגון סופג מערבי והיסתולוגיה.

a-plate-based-assay-for-measurement-endogenous-monoamine-release

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

דופאמין הוא מוסדר בבירור בגרעין המוח התיכון, אשר מכילים תאים הגופות דנדריטים של נוירונים דופאמין. כאן נתאר את הגישה לנתיחה ו מדגם הטיפול על מנת למקסם את התוצאות, ולכן מסקנות ותובנות, על ויסות הדופמין בגרעין המוח התיכון של nigra substantia (SN) ואזור tegmental הגחוני (VTA) במכרסמים.

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה החוקרת מנגנוני שחרור מונואמין מתאי העצב של פרוסות מוח של חולדות ex vivo פעילות מטבולית, כאשר הן מטופלות בתרופות בדיקה. הבדיקה מדגימה כי תרופות נוירוסטימולנטיות גורמות לשחרור מונואמין באמצעות מובילי מונואמין תאי, בעוד שריכוז KCl גבוה גורם לשחרור מונואמין שלפוחית סינפטית בתיווך אקסוציטוזה.

בדיקה מבוססת צלחת למדידת שחרור מונואמין מפרוסות מוח בחשיפה לתרופות בדיקה

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת מערך מיקרואלקטרודות לחקר פעילות הרשת העצבית באזורי חוט השדרה של עכבר. ראשית, נרשמת הפעילות האלקטרופיזיולוגית מהקרן הגבית השטחית (SDH) של הפרוסה. לאחר מכן, מעכב תעלת אשלגן מוצג כדי להאריך את הדפולריזציה, וכתוצאה מכך פעילות ריתמית סינכרונית על פני הרשת העצבית.

הערכה מבוססת מערך מיקרואלקטרודות של רשתות עצביות בפרוסות חוט השדרה של עכבר

סרטון זה מדגים את הערכת ספיגת הדופמין בסינפטוזומים שנאספו ממוחות עכברים. הוא מתאר שלבים להכנת סינפטוזומים לספיגת דופמין באמצעות מובילי דופמין, טיפול בהם בריכוזים משתנים של דופמין עם תווית רדיו, בידוד הסינפטוזומים ומדידת רדיואקטיביות כדי לכמת את ספיגת הדופמין.

מדידת ספיגת דופמין בסינפטוזומים במוח עכבר באמצעות דופמין עם תווית רדיו

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

כאן, אנו מתארים את ההתקנה, תוכנת ניווט, וניתוח נתונים עבור שיטה מרחבית מדויקת ובזמן של מדידת טוניק ושינויי גלוטמט תאי פאזית in vivo באמצעות מערכי microelectrode enzyme-linked (MEA).

באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר

ספיגת דופמין synaptosomal ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים ניתוח מייצגים ניסוי כלים לחקור דופמין הומאוסטזיס בעכברים על-ידי הערכת את הפונקציה של המשגר דופמין, רמות הדופמין ברקמת striatal, בהתאמה. כאן אנו מציגים פרוטוקולים למדוד דופמין רקמות תוכן, להעריך את הפונקציונליות של המשגר דופמין.

הערכה של דופאמין הומאוסטזיס בעכברים באמצעות ניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית, דופמין Synaptosomal ספיגת

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את האיזון בין שחרור גלוטמט לבין הסיווג ב corticostriatal glutamatergic בודד בפרוסות חריפה מעכברים למבוגרים. פרוטוקול זה משתמש חיישן פלורסנט iGluu עבור זיהוי גלוטמט, מצלמה scmos עבור רכישת אותות והתקן עבור תאורה לייזר מוקד.

בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

קצב צריכת חמצן (OCR) הוא פרוקסי נפוץ לתפקוד המיטוכונדריה וניתן להשתמש בו כדי לחקור מודלים שונים של מחלות. פיתחנו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את ה-OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים, שהיא רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית משיטות אחרות.

מדידת קצב צריכת חמצן בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לשימוש במערכות משלימות של מערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה של תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS-HD-MEAs) כדי לתעד פעילות דמוית התקף מפרוסות מוח ex vivo .

פעילות דמוית פרכוסית באיכות גבוהה מפרוסות מוח חריפות באמצעות מערכת משלימה של מערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה של מתכת-תחמוצת-מוליכים למחצה

למד שיטה לבדיקת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות מעכברים, תוך שימוש ב-HPLC-ECD ובאינקובציה בצלחת 48 בארות. השיטה מאפשרת הבחנה בין מנגנוני שחרור וזולה ומהירה לבדיקות תרופתיות.

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

גלה סרטונים נוספים