בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

טכניקה זו היא התאמה של שיטות נפוצות לבחינת שחרור מונואמין, המאפשרות מדידת שחרור אנדוגני ולא מונומינים טעונים מראש רדיובל בתנאים פרמקולוגיים מרובים בבת אחת. היתרונות העיקריים לטכניקה זו הם כי זה חסכוני למדי, תנאים פרמקולוגיים מרובים ניתן לבחון בבת אחת, ואנחנו יכולים ללמוד שחרור מונואמין אנדוגני עם היכולת להבחין בין ניסיון ושחרור מתווך טרנספורטר. כדי להכין פרוסות מוח ממבוגרים 250 עד 350 גרם חולדות זכר לאחר הקציר, מיד להציב את המוח ואת קרח קר מחומצן חוצץ, ולרכוש 300 מקטעי מוח קורוני מיקרון מכל אזור של עניין.

לניתוח נוסף של פרוסות המוח, הזיזו בזהירות את הרקמות לשקופיות זכוכית והשתמשו באטלס מוח חולדה כדי לזהות את הסטריאטום של הגעש בהתבסס על המבנה המפוספס הכהה שלו, ולזהות את ההיפוקמפוס בהתבסס על קרבתו לקליפת המוח והמבנה הספירלי הייחודי שלו. הפרד את האונה הימנית והשמאלית לשימושם כשליטה ופרוסות ניסיוניות. ניתן לנתח עוד יותר את הסטריאטום של החזרה לשני מילימטרים.

לאחר מכן השתמש pipette העברת פלסטיק עם קצה שונה כדי להעביר את הדגימות לתוך מיכלים קטנים שקועים חיץ ניתוח קר קרח מחומצן עם מבעבע חמצן. כדי לגרום לשחרור מונואמין, להעביר את דגימות הרקמה לכל באר של תא שפכים מותאם אישית 48 טוב המכיל 0.5 כדי אחד מיליליטר של חוצץ שפכים לכל טוב עם מבעבע עדין מתמיד ולאפשר את הדגימות להתאושש במשך 30 עד 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף תקופת שיווי משקל, להעביר את מחזיק הרקמה עם רקמת המוח לבארות המכילות 500 microliters של חיץ שפכים מחומצן עם או בלי סוכן פרמקולוגי, הקשה על המחזיק על קצה הבאר כדי למנוע העברה מינימלית של חוצץ בין בארות עבור דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להעביר את המחזיק לסט חדש של בארות המכילות 500 microliters של חוצץ שפכים עם או בלי התרופה של עניין ולהחזיר את הצלחת לחממה תרבית התא במשך 20 דקות נוספות. במהלך הדגירה השנייה, העבירו את הפתרון מהבארות מהדגירה הראשונה לצינורות מיקרוצנטריפוגה המכילים 50 מיקרוליטרים של חומצה פרכלורית או זרחתית רגילה אחת על קרח, ותייגו את הצינורות מספר אחת"בסוף הדגירה השנייה, הזיזו את מחזיק הרקמה לבארות ריקות עם הצלחת על הקרח והעבירו את הסופרנטנטים מדגירה השנייה לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים המכילים 50 מיקרוליטרים של פרכלורי או זרחתי אחד רגיל חומצה על קרח. סמן צינורות אלה מספר שתיים"כאשר כל supernatants הועברו, להוסיף מיליליטר אחד של חוצץ ניתוח קר קרח לכל באר של רקמה ולהשתמש פינצטה קטנה להעביר כל דגימת רקמה לצינור microcentrifuge חדש.

הסר את המאגר מצינורות הדגימה ולאחסן את הרקמות במינוס 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את פתרונות הדגירה שנאספו לתוך צינורות מסנן microcentrifuge עבור צנטריפוגה ומניחים את הסינון על קרח עד ניתוח HPLC. הגדר את הפוטנציאל של ה- ECD וקצב הזרימה להמלצת היצרן לאיתור מונומינים. טען ו- aliquot מתאים של כל מדגם, כולל תקני משדר עצבי לתוך HPLC להזרקה אוטומטית וזיהוי ולאפשר את המכשיר כדי להשלים את הניתוח.

לאחר מכן השתמש בתוכנת הניתוח של HPLC כדי לרכוש ולנתח את נתוני הכרומטוגרפיה באמצעות עקומה סטנדרטית המורכבת מכל מונואמין כדי להשיג את השטח שמתחת לעקומה בהתבסס על הנחיות היצרן. לאחר שש שעות של ניתוח פונקציונלי, דגימות רקמה נשארות קיימא, בעוד דגימות דגירה עם 1% Triton X-100 להפגין ירידה משמעותית טרנספורמציה MTT. טיפול חריף של 20 דקות בחלקי מוח בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית עם אמפטמין גורמת לעלייה משמעותית ברמה החוץ-תאית של כל מונואמין.

כאשר הדגימות מטופלות מראש עם פלואוקסטין, מעכב ספיגה חוזרת של סרוטונין סלקטיבי, אמפטמין המושרה עלייה בסרוטונין חוץ תאי בתוך ההיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית אינה מתרחשת, בעוד הגידול בייצור דופמין ונוראפינפרין חוץ תאי אינו מושפע. בנוסף, טיפול חריף של 20 דקות של אגרופים סטריאטום הגב עם אמפטמין גורם לעלייה של פי 35 ביטוי רמת דופמין חוץ תאי, בעוד טיפול אגרוף סטריאטום הגב עם קוקאין, חוסם משגר מונואמין, תוצאות עיכוב משמעותי של אמפטמין המושרה דופמין חוץ תאי. הגדלת הריכוז של אשלגן כלורי חוץ תאי כדי לעורר דה-פולאריזציה של הממברנה מספיקה כדי לגרום לשחרור אקסוציאוטי של מונומינים בהשוואה לתנאי בקרה לא מטופלים, ולא פלואוקסטין ולא טיפול בקוקאין חוסמים את הגידול העמוק הזה.

זה הכרחי יש קטעים לחתוך נקי, לוקליזציה מדויקת של אגרופים, ולשמור על חמצון עקבי לאורך כל הניסוי. ניתן להשתמש במקטעי המוח לאחר ניסויים לעיבוד וניתוח ביוכימיים נוספים, כגון סופג מערבי והיסתולוגיה.