Name: מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד כיצד לפתח מודל עכברוש לזיהום מוחי EcoHIV באמצעות הזרקה סטריאוטקטית. מודל זה מאפשר חקר הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל-HIV ומנגנוני ההדבקה במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי HD043680, MH106392, DA013137, ו NS100624.

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר הבטחה פדרלית: D16-00028). שישה זכר בוגר F344 / N חולדה שוכנה בסביבה מבוקרת תחת אור 12/12: מחזור כהה עם גישה libitum המודעה למזון ומים. כל בעלי החיים טופלו באמצעות הנחיות שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. אריזת וירוסים בתאי FT 293
<ol><li>תרבות 293 תאי FT (5×105/ מ"ל) בג'לטין מצופה 75 ס"מ2 בקבוקים עם DMEM בתוספת 10% FBS11. לגדל תאים ב 37 °C (69 °F) להיות 50% קונדיטוריה ב transfection.</li>
	<li>לדלל 22.5 μL של מגיב transfection (למשל, Lipofectamine 3000) ב 750 μL של בינוני (למשל, Opti-MEM) בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 mL ומערבולת עבור 3 s.</li>
	<li>לדלל 20 מיקרוגרם של EcoHIV פלסמיד DNA ב 750 μL של מדיום בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מ"ל ומערבבים היטב.</li>
	<li>מוסיפים דנ"א מדולל לצינור של מגיב טרנס-פקציה מדולל ומערבבים בעדינות. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מוסיפים את התערובת ל-10 מ"ל של מדיום DMEM שנחמר מראש בבקבוק 75 ס"מ2. דגירה תאים במשך 2 ימים ב 37 °C (69 °F).</li>
	<li>קציר ולשלב 24 מ"ל של מדיום מותנה משני בקבוקונים הכוללים lentivirus ארוז.</li>
	<li>צנטריפוגה כל 24 מ"ל של בינוני מותנה ב 500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להעביר את supernatant הבהיר לצינור סטרילי 50 מ"ל.</li>
	<li>שלב 8 מ"ל של רכז Lenti-x עם 24 מ"ל של על-טבעי מובהק (יחס של 1:3). מערבבים על ידי היפוך עדין. תערובת דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך יומיים.</li>
	<li>תערובת צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant.</li>
	<li>בעדינות להשעות את גלולה עם 100 μL של 100 מ"מ PBS.</li>
	<li>ריכוז וירוס טיטר עם ערכת אליזה p24.</li>
</ol>2. ניתוחים סטראוטקסיים של וירוס EcoHIV-EGFP
<ol><li>הרדמה חולדות באמצעות 3% sevoflurane. המשך לשלב 2.2 כאשר החולדות אינן מגיבות לגירויים רעילים ורפלקסים נעדרים.</li>
	<li>גילחו את השערות מאזור המוח ועקרו את העור פעמיים עם 70% אתנול וקרצוף על בסיס כלורקסידין. אבטח את החולדה בעמדה מועדת במנגנון הסטריאוטאקסי.</li>
	<li>בצע חתך (5-6 ס"מ) דרך העור לאורך קו האמצע הקרקפת.</li>
	<li>סמן שתי עמדות קידוח ב 0.8 מ"מ לרוחב, 1.2 מ"מ rostral כדי bregma. לקדוח חור (קוטר 0.4 מ"מ) בכל מיקום גולגולת.</li>
	<li>מלא פתרון לנטיוירוס EcoHIV (1.04 × 106 TU / mL) במזרק הזרקת 10 μL. אבטחו את המזרק למנגנון הסטריאוטאקסי.</li>
	<li>הזז במורד המחט קרוב לפני השטח של חור קידוח. למדוד ולהזיז 2.5 מ"מ לעומק.</li>
	<li>להחדיר 1 μL של פתרון וירוס בקצב של 0.2 μL / min. שמור את המחט בתוך אזור ההזרקה במשך 5 דקות. תזיז לאט את המחט עד שהיא מחוץ לגולגולת החולדה.</li>
	<li>לתפור את העור עם חוט משי 4-0.</li>
	<li>לעקר את החתך עם 70% אתנול פעם אחת. תת עורית להזריק butorphenol (דורולקס, 0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף).</li>
	<li>מעבירים את החולדה לתא התאוששות עם כרית חימום עד שהיא מתעוררת.</li>
</ol>3. הדמיה של חלקי מוח
הערה: המתן שבוע עד שמונה שבועות לאחר עירוי ויראלי EcoHIV.
<ol><li>הרדמה החולדה עם 5% sevoflurane. המשך לשלב 3.2 כאשר החולדות אינן מגיבות לגירויים רעילים ורפלקסים נעדרים.</li>
	<li>תקן את החולדה בתנוחת על-חוש בתוך מכסה המנוע של אדים.</li>
	<li>להסית את העור לאורך קו האמצע של בית החזה. חותכים את הסרעפת ופותחים את חלל בית החזה.</li>
	<li>הכנס מחט 20 G × 25 מ"מ לתוך החדר השמאלי.</li>
	<li>מיד לפתוח את האטריום הנכון עם מספריים.</li>
	<li>לעיין 50 מ"ל של PBS מראש 100 מ"מ בקצב של 5 מ"ל / דקה.</li>
	<li>לחלחל 100 מ"ל של קר 4% paraformaldehyde בקצב של 5 מ"ל / דקה.</li>
	<li>לערוף את ראש החולדה, לפתוח את הקרקפת ולהסיר את המוח.</li>
	<li>פוסטפיקס לילה עם 4% פארפורמלדהיד.</li>
	<li>להעביר את המוח 40 מ"ל של 30% סוכרוז ב 100 מ"מ PBS בצינור 50 מ"ל עד המוח צף למטה (כ 3 ימים).</li>
	<li>הצמד להקפיא את המוח במתילבוטנול במשך 2 דקות ב - 80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאבטח את רקמת המוח על פלטפורמת מתכת בתוך -20 מעלות צלזיוס cryostat.</li>
	<li>חותכים 50 מיקרומטר עבה חלקי coronal באמצעות cryostat.</li>
	<li>מעבירים את פרוסות המוח לשקופיות זכוכית בעזרת מברשת עדינה.</li>
	<li>הר קטעים ב 0.3 מ"ל של בינוני נגד פשתן לכסות עם 22 מ"מ 50 מ"מ coverlips.</li>
	<li>שמור את מגלשות הזכוכית בחושך בטמפרטורת החדר עד לייבוש.</li>
	<li>תמונה נוירונים ממוקדים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות מחסנית Z מבוסס על גבולות אזור המוח ומאפיינים מורפולוגיים של נוירונים. הערה: הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקל בהן נעשה שימוש היו: הגדלה של 60 X (A/1.4, שמן), ומרווח מישור Z של 0.15 מיקרומטר (גודל חור סיכה 30 מיקרומטר; רדיוס חור סיכה מוקרן לאחור 167 ננומטר) באמצעות אורך גל של 488 ננומטר.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

בפרוטוקול זה, הקמנו מודל זיהום איידס הנגרמת על ידי EcoHIV בחולדות. באופן ספציפי, תיארנו הזרקה סטראוטקסית דו-צדדית של EcoHIV לתוך קליפת המוח אשר בהצלחה גרמה לזיהום HIV פעיל במוח החולדה 7 ימים לאחר הזרקה. פית'מור, אנו מראים כי זיהום EcoHIV בחולדות יכול להיות מערכת ביולוגית טובה ללמוד היבטים מרכזיים של HAND. שמונה שבועות לאחר זיהום EcoHIV, חולדות הפגינו ליקויים נוירוקוגניטיביים משמעותיים, שכללו את השינויים בעיבוד זמני ותפקוד סינפטי ב- MSNs של NAc. בהתחשב בחשיבותם של מודלים של בעלי חיים לחקר neuroHIV ו HAND...

מערכות ביולוגיות שיפרו את ההבנה שלנו של הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות HIV-1 (HAND) ואת המנגנונים העצביים הבסיסיים שלהם2. קביעת איזו מערכת ביולוגית מתאימה ביותר לכל מחקר נתון תלויה לעתים קרובות בשאלת הריבית2. המגבלה של מגוון המודלים המארחים של בעלי חיים מאתגרת מחקרים על התפתחות מחלת HIV-1. כדי לחקור HIV-1 שכפול ויראלי פתוגנזה, אשלג ואח'3 יצר מודל העכבר של זיהום פעיל HIV-1, החלפת אזור הקידוד של גליקופרוטאין מעטפת משטח HIV, gp120, עם gp80 MLV ecotropic, אשר הוביל שכפול ויראלי מוצלח בעכברים4. לאחר זריקות וריד הזנב בעכברים HIV כימרי (EcoHIV), מאפיינים רבים נצפו דומים לאלה של אנשים seropositive HIV-1 (למשל, לימפוציטים נגועים מקרופאגים, ממוקד לתגובות חיסוניות אנטי ויראליות, ודלקת3,5,6).
למרות עכברים וחולדות הם שניהם חברים של Muridae, הבדלים מינים בסיסיים עשויים להשפיע על התאמתם לשאלות ניסיוניות ספציפיות7. לכן, ההרחבה של מודל זיהום EcoHIV לחולדות (נפוץ במחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות) יהיה יתרון במחקר של neuroHIV. לדוגמה, גודלם הגדול יותר הופך את השתלת הקטטר הצווארי להליכי ניהול עצמי של תרופות למעשית יותר8. טכניקות ניהול עצמי סמים בחולדות נוצלו כדי להעריך את המוטיבציה ב-HIV-1 9. יתר על כן, משימות נוירוקוגניטיביות / התנהגותיות רבות תוכננו בתחילה עבור חולדות10. כאן, אנו מדווחים על ניצול של זריקות סטראוטקסיות של EcoHIV בחולדות כדי להרחיב את מודל הזיהום EcoHIV ולאפשר הזדמנות מפתח כדי לענות על שאלות חדשות הקשורות neuroHIV ו HAND.

<table><tbody><tr><td>תאי 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatin 75 ס"מ&sup2; בקבוק תרבית תאי צוואר מלבני עם כובע מאוורר</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus אנטיבקטריאלי, 4-0 פוליגלקטין 910 תפר, 27 אינץ'. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>המילטון</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection</td><td>Reagent Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>ערכת p24 ELISA הקשורה ל-Lentivirus</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X רכז</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>טכנולוגיות חיים בינוניות</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt אספקה וטרינרית</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי</td><td>Kopf מכשירים</td><td>דגם 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr> <tr><td>Vannas מספריים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל עכברוש של זיהום מוחי ecohiv

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

נחקר היטב כי מודל העכבר הנגוע EcoHIV הוא בעל תועלת משמעותית בחקירת סיבוכים נוירולוגיים הקשורים ל- HIV. הקמת מודל עכברוש נגוע EcoHIV למחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות, יהיה מועיל במחקר של neuroHIV ו- HIV-1 הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות (HAND). במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את היצירה המוצלחת של מודל חולדה של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV). ראשית, המבנה lentiviral של EcoHIV נארז בתאי FT 293 תרבותיים במשך 48 שעות. לאחר מכן, המדיום המותנה היה מרוכז וטריטר. לאחר מכן, ביצענו זריקות סטראוטקסיות דו-צדדיות של EcoHIV-EGFP לתוך רקמת מוח עכברוש F344/N. שבוע לאחר ההדבקה, אותות פלואורסצנטיים EGFP זוהו ברקמת המוח הנגועה, המציין כי EcoHIV בהצלחה גורם לזיהום HIV פעיל בחולדות. בנוסף, בוצעה חיסון עבור סמן התא המיקרוגליאלי, Iba1. התוצאות הצביעו על כך שמיקרוגליה היו סוג התא השולט ב-EcoHIV. יתר על כן, חולדות EcoHIV הציגו שינויים בעיבוד הטמפורלי, מנגנון נוירו-התנהגותי פוטנציאלי של HAND, כמו גם תפקוד סינפטי שמונה שבועות לאחר ההדבקה. באופן קולקטיבי, המחקר הנוכחי מרחיב את מודל EcoHIV של הידבקות ב- HIV-1 לחולדה המציעה מערכת ביולוגית בעלת ערך לחקר מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח, כמו גם HAND ותחלואה נלווית כגון שימוש בסמים.

המדיום מותנה נאסף מ lentivirus של EcoHIV-EGFP נגוע 293FT תאים. לאחר מכן, הוא היה מרוכז ו titered, אז מוזרק באופן סטריאוטקסי לתוך המוח (אזור קליפת המוח) של חולדות F344/N. שבעה ימים לאחר ההזרקה, חולדות הוקרבו ותמונות נלקחו מפרוסות מוח קורונל החל bregma 5.64 מ"מ כדי bregma -4.68 מ"מ. באיור 1A, ישנם אותות EcoHIV-EGFP משמעותיים בכל המוח, במיוחד בקליפת המוח ובג'ירואים משומנים בהיפוקמפוס. יתר על כן, שתי תיוג עם Iba1and EcoHIV-EGFP בדיקות סיפק ראיות חזקות כי microglia היו סוג התא השולט מחסה ביטוי Ec...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להקים מודל עכברוש חדש של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV), שהוא קריטי לשיפור ההבנה שלנו של מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח ומציע מערכת לחקור הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל- HIV ותחלואה נלווית (כלומר, שימוש בסמים).

מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

באמצעות חולדות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקים מודל חדש של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי. עם חולדות, הקמת מודל זיהום EcoHIV למחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות יכול להיות מועיל לחקר נוירו HIV ו- HIV-1 הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות. הליך ההדרה יהיה Hailong לי, עמית מחקר מהמעבדה שלי.עבור אריזה של הנגיף לתוך 293 תאי T, זרע חמש פעמים 10 כדי החמישי 293 תאי T למיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS לתוך כל אחד משני צלויי ג'לטין מצופה 75 ס"מ רבועים דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד התרבויות להגיע 50% קונפלורציה. ביום של transfection, לדלל 22.5 microliters של reagent transfection ב 750 microliters של בינוני לכל בקבוק בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך שלוש שניות. לדלל 20 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד EcoHIV כימרי ב 750 microliters של מדיום בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר השני לכל בקבוק עם ערבוב יסודי.ערבבו את הדנ"א המדולל עם ריאגנט transfection מדולל עם ערבוב עדין לדגר את הפתרון וכתוצאה מכך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף כל השעיה וירוס 10 מיליליטר של בינוני DMEM לפני המלחמה ולהוסיף כל פתרון תוספת וירוס בקבוק אחד של 293 T-תאים. לאחר יומיים של תרבות תאים, בריכה supernatant מן הבקבוקים בצינור חרוט אחד 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה ולהעביר את supernatant הבהיר לצינור חדש 50 מיליליטר.הוסיפו שמונה מיליליטרים של רכז לנטי-X לסופרנאטנט המובהר וערבבו עם היפוך עדין. לאחר דגירה של יומיים בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה את התערובת בזהירות להסיר את supernatant, ולאחר מכן בעדינות resuspend גלולה עם 100 microliters של 100 PBS מילימולארי ולהשתמש בערכת אליזה P24 כדי titer ריכוז הנגיף. להזרקת EcoHIV-EGFP, לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושות, גילחו את השיער מאזור המוח ועקרו את העור החשוף פעמיים עם 70% אתנול וקרצוף מבוסס כלורקסידין.לאבטח את החולדה בתנוחה נוטה במנגנון סטריאוטאקסי ולעשות חתך של חמישה עד שישה סנטימטרים דרך העור לאורך קו האמצע הקרקפת. סמן תנוחת קידוח אחת ב-0.8 מ"מ לרוחב ואחת של 1.2 מ"מ לרגמה וקדח חור בקוטר 0.4 מ"מ בכל מיקום גולגולת. לטעון 1.04 פעמים 10 ליחידות התמרה השישית לכל מיליליטר של פתרון EcoHIV Lentivirus מרופט לתוך מזרק הזרקת 10 מיקרוליטר ולאבטח את המזרק למנגנון סטריאוטאקסי.להזיז את המחט קרוב לפני השטח של חור קידוח אחד ולהכניס את המחט 2.5 מיליליטר לתוך החור. להחדיר מיקרוליטר אחד של פתרון וירוס בקצב של 0.2 microliters של וירוס לדקה. כאשר כל הנגיף הוזרק, להשאיר את המחט בתוך אזור ההזרקה במשך חמש דקות לפני לאט חוזר המחט עד שהוא מחוץ לגולגולת החולדה.סגור את החתך בעור עם תפר חוט משי 4-0 ועקר את הפתרון עם 70% אתנול, ולאחר מכן למקם את החולדה בתא התאוששות עם כרית חימום עם ניטור עד שיקום. שבוע עד שמונה שבועות לאחר עירוי ויראלי, לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה, לתקן את החולדה בתנוחה סופית בתוך מכסה המנוע אדים ולהסית את העור לאורך קו האמצע של בית החזה. חותכים את הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה ולהכניס 20 מד על ידי מחט 25 מילימטר לתוך החדר השמאלי.מיד לפתוח את האטריום הנכון עם מספריים לחלחל 50 מיליליטר של PBS מצונן מראש 100 מילימולאר בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. כאשר כל PBS נמסר, לחלחל עם 100 מיליליטר של קר 4% paraformaldehyde. כאשר כל התיקון נמסר, להסיר את המוח מהגולגולת ולתקן את הרקמה לילה טרי 4% paraformaldehyde.למחרת בבוקר, למקם את המדגם ב 40 מיליליטר של 30% סוכרוז ב PBS 100 מילימולאר בצינור 50 מיליליטר במשך כשלושה ימים עד המוח מתיישב לתחתית הצינור לפני הצמד הקפאת רקמת המוח במתיל butanol במשך שתי דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, יש להשתמש בהקפאה של מינוס 20 מעלות צלזיוס ובמברשת צבע עדינה כדי לרכוש 50 חלקי קורונל בעובי מיקרון. כאשר כל החלקים הושגו, לכסות את הדגימות עם 300 microliters של מדיום נגד עמעום ולהרכיב אותם עם 22 50 מיליליטר coverlips.כאשר המדיום התייבש, צלם את החלקים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שבעה ימים לאחר הזרקת Lentivirus, תמונות פרוסת מוח coronal חולדה לחשוף נוכחות משמעותית של אותות EcoHIV-EGFP בכל רקמת המוח, במיוחד בתוך קליפת המוח ואת gyrus שקע ההיפוקמפוס. שתי תיוג עם Iba1 ו EcoHIV-EGFP בדיקות לספק ראיות חזקות כי microglia הם סוג התא השולט מחסה ביטוי EcoHIV במוח.שמונה שבועות לאחר ההדבקה, EcoHIV הזריק בעלי חיים להפגין חוסר רגישות יחסית למניפולציה של מרווח interstimulus כפי שמעידים על ידי פונקציית מרווח מחמיא יחסית בהשוואה לבקרות מלוחים. בנוסף, חולדות מוזרקות EcoHIV מציגות שינויים עמוקים במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי שלהן, כפי שמעידות תדירות יחסית מוגברת של קוצים דנדריטיים קצרים יותר עם קטרים מוגברים של הראש והצוואר ביחס לבעלי חיים שולטים. הריכוז והטיטרטינג של מדיום המצב לפני הזרקה סטראוטקסית הוא קריטי כדי להבטיח את התוצאות עקביות שכפול על פני ניסויים.הזרקה סטראוטקסית אזורית ספציפית זו של EcoHIV מספקת זיהום HIV יעיל בתוך המוח ומייצרת ליקויי עיבוד זמניים בחולדות. הניצול של זריקות HIV סטראוטקסי בחולדות כדי להרחיב את מודל זיהום EcoHIV מאפשר הזדמנות מפתח לטיפול בשאלות חדשניות הקשורות נוירו HIV בהישג יד.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

המודל עכברוש הלידה לפגיעה hypoxic-איסכמי המוח הוא מודל ומבוססת של אנצפלופתיה הילוד האנושי איסכמי היפוקסי (HIE). במאמר זה, אנו מתארים את המודל של HIE ב שלאחר הלידה גורי חולדה.

מודל hypoxic אנצפלופתיה איסכמי של איסכמיה הלידה

סרטון זה מדגים את הליך הזרקת נגיפי HIV כימריים לקליפת המוח של חולדה, שם ה-RNA של הנגיף משתלב בגנום המארח, משתכפל ומתפשט כדי לבסס זיהום HIV פעיל במודל הניסוי.

הקמת זיהום HIV פעיל במודל חולדה

אנצפלופתיה של פגות מקיפה את ההפרעות במערכת העצבים המרכזית הקשורות לפגיעה מלידה מוקדמת. דוח זה מתאר מודל חולדה רלוונטי מבחינה קלינית של איסכמיה מערכתית חולפת ברחם ומתן ליפופוליסכריד תוך מי שפיר (LPS) המחקה כוריואמניוניטיס, ואת ההשפעה הקשורה של גירויים זיהומיים ותת-עירוי שליה על התפתחות מערכת העצבים המרכזית.

דוגמנות אנצפלופתיה של פגות שימוש בהריון היפוקסיה-איסכמיה עם lipopolysaccharide Intra-השפיר בחולדות

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר רבייה של חיקוי נרחב של חומר אפור של שתי ההמיספרות הקליפתיות בחולדות אגוטי אפלות זכריות בוגרות. השיטה כוללת השתלה תוך-מוחית של קטטר, חיסון תת-אקליני נגד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין, והזרקה תוך-מוחית של תערובת ציטוקינים פרו-דלקתית דרך הצנתר המושתל.

מודל חולדה של דמיאלינציה קליפת המוח הנרחבת הנגרמת על ידי הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים פרו דלקתיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת ICR מוסמך (המכון לחקר הסרטן) מודל murine של זיהום מערכת העצבים המרכזית כדי להציג את ההתפתחות של נוירופתיה. ניטור ויראלי חריפה הפרעות נצאליטיות על ידי עשרות מחלה זהה יכול להתבצע על מראה דנגי וירוס המושרה נוירופתיה ב vivo.

מודל Murine של וירוס דנגה-הנגרמת חריפה דלקת קרום המוח-כמו מחלה

מטרת מחקר זה היא להקים ולאמת מודל בעלי חיים עבור מחקר בשלבים שחזור והצלה של איסכמיה של המוח על ידי בדיקת אוטם המוח ואת הפונקציה sensorimotor לאחר חסימה באמצע עורק מוחין/reperfusion (MCAO/R) לאחר 1-90 ימים...

מודל טרום קליני להעריך את ההתאוששות המוח לאחר שבץ חריף בחולדות

כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

ניתן לעצב הידרוצפלוס פוסט-דימומי של פגות (PHHP) בחולדות יילודים על ידי שילוב של כוריואמניוניטיס ודימום תוך חדרי. השילוב של אירועים אלה לפני הלידה ואחרי הלידה מסכם במדויק את סימני ההיכר הקליניים של PHHP, כולל מקרוצפליה, ונטריקולומגליה, ולחץ תוך גולגולתי מוגבר, לאורך החיים.

מידול הידרוצפלוס פוסט-דימומי של פגות בחולדות

פרוטוקול זה מתאר כיצד השילוב של זיהום EcoHIV עם עכברי Tmem119-EGFP מציע מערכת ביולוגית רבת ערך לחקירת שינויים במיקרוגליה ומאגרים נגיפיים במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV.

זיהוי תאים נגועים ב-EcoHIV בעכברים טרנסגניים שעברו מניפולציה במיקרוגליה

מאמר זה מציג פרוטוקול לאינדוקציה של מודל עכברוש ייחודי של הפרעה דו קוטבית הלוכד התנהגות דמוית מאניה ודיכאון.

פיתוח מודל חולדות להפרעה דו קוטבית

למד כיצד לפתח מודל עכברוש לזיהום מוחי EcoHIV באמצעות הזרקה סטריאוטקטית. מודל זה מאפשר חקר הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל-HIV ומנגנוני ההדבקה במוח.

מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

גלה סרטונים נוספים