חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY: פלטפורמה חדשה ליישום חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים
17 במאי 2021
פלטפורמה סטטית חדשה משמשת לאפיון מבנה החלבון ואתרי האינטראקציה בסביבת התאים המקומית תוך שימוש בטכניקת טביעת רגל של חלבון הנקראת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים (IC-FPOP).
שיטה זו מספקת פתרונות לשאלות הביולוגיות התובעניות של ימינו. מניסוי FPOP בתא, אנו יכולים לחקור אינטראקציות חלבון-ליגנד, אתרי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון ואזורים של שינוי קונפורמי. היתרון של טכנולוגיה זו הוא השימוש בפלטפורמת IC-FPOP אוטומטית מבוססת שש בארות המאפשרת לגדל תאים ולבצע מחקרי FPOP בתאים ממש בלייזר.
שיטה זו יכולה לשמש בתעשיות התרופות והביוטכנולוגיה, כמו גם במכוני מחקר אקדמיים וקליניים גדולים, במיוחד על ידי חוקרים ביולוגיים באוניברסיטאות החוקרות דינמיקה של חלבונים. כדי להתחיל, פתח את חממת האסדה משלב המיקום ונתק את קווי הטמפרטורה, הגז ומכשיר האדים. מרססים את האינקובטור ב-70% אתנול ומניחים אותו במכסה המנוע של תרבות התאים.
הסר את צלחת שש באר מן החממה פלטפורמה, לאבטח את המכסה המקורי של הצלחת, ולאשר מפגש התא באמצעות מיקרוסקופ, ולאחר מכן למקם את צלחת שש באר עם תאים confluent בחזרה באינקובטור פלטפורמה בתוך מכסה המנוע תרבות התא. הכנס שלושה צינורות Tygon לחתוך מראש בכל באר דרך היציאות מוטבע על ידי שטיפת הצינורות אל קירות הבאר ולאבטח אותם עם טבעות מודפסות 3D מותאם אישית. הכן סקריפט תוכנת אינטגרציה לנסיגת משאבה.
השתמש במשאבה פריסטלית אחת כדי להסיר לחלוטין את מדיית התא מכל שש הבארות. ממיסים ראשוניים בכל ערוץ של שלוש המשאבות הפריאסטליות האחרות, ואז להחדיר מי חמצן ומאגר Quench בצינורות לסירוגין שלהם בהתאמה עד ריאגנטים להגיע ליציאות האינקובטור. ודא שקרן הלייזר זוויתית כראוי ומגיעה לאינקובטור ללא מעצורים.
בדוק אנרגיית לייזר באמצעות חיישן חיצוני. הכינו את סקריפט תוכנת האינטגרציה לעירוי משאבה לאחר אישור יישור הקרן. להחדיר 200 מי חמצן מילימולארי ב 35 מיליליטר לדקה לתוך הבאר הראשונה.
לחץ על לחצן 'התחל' בתוכנת הלייזר בסימן חמש השניות כדי להפעיל את הדופק בסימן 11 השניות על שעון העצר. להחדיר 125 מילימולאר Quench פתרון ב 35 מיליליטר לדקה לתוך הבאר הראשונה מיד לאחר פולס לייזר. הזז ידנית את שלב המיקום כדי ליישר את הבאר הבאה עם קרן הלייזר ולחזור על התהליך עבור כל הבארות.
במכסה המנוע של תרבות התא, השתמש במגרד תאים כדי להעביר את התאים מכל באר לצינורות חרוטים בודדים של 15 מיליליטר. תאי צנטריפוגה ב 1, 200 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של מאגר תמוגה RIPA.
להעביר תאים בודדים 1.2 מיליליטר פוליפרופילן צינורות. פלאש להקפיא את כל הדגימות חנקן נוזלי ומניחים אותם במקפיא מינוס 80 מעלות עד השימוש. כדי להתאים שינויים FPOP, לנתח את lysate התא מתעכל באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית, ולאחר מכן לחשב את היקף השינוי.
כדי לאשר שתנאי החממה של הפלטפורמה מספיקים לתרבות התאים בפלטפורמת הלייזר, GCaMP2 הוחלף באופן ארעי לתוך HEK293T ויעילות transfection עבור שני הלוחות הוערכה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. בוצעה בדיקת לוציפראז לכמות יעילות ההעתקה. שינויים FPOP בתאי HEK293T שכותרתו במערכת הזרימה הושוו לאלה המסומנים בחממה פלטפורמה.
חממת הפלטפורמה עלתה על מערכת הזרימה הן במספר החלבונים ששונו והן בכיסוי FPOP הכולל בחלבונים אלה. במערכת הזרימה זוהו שני פפטידים ששונו, המספקים מידע מבני מוגבל. עם זאת, חמישה פפטידים מותאמים המשתרעים על רצף האקטין זוהו באינקובטור הפלטפורמה.
ספקטרום טנדם MS של actin עם פרולין שונה בשתי המערכות ופפטיד actin ללא שינוי מוצגים כאן. שאריות FPOP ששונו בדגימות החממה של הפלטפורמה הכילו 12 שאריות ששונו, שלוש שאריות ששונו במערכת הזרימה ושאריות שונה חופפות. ניתוח LC-MS MS גילה כי 792 חלבונים שונו על ידי in vivo FPOP בחממת הפלטפורמה בהשוואה ל-545 החלבונים ששונו עם מערכת הזרימה.
זה הכרחי כדי לשמור על תאים בתנאים סטריליים. תמיד להביא את החממה פלטפורמה לתוך מכסה המנוע תרבות התא סטרילי להכניס את כל צלחות שש באר הדרושים, צינורות, וטבעות. זה מבטיח את שלמות הניסוי.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מתקדם לחמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים בתוך התא (FPOP) באמצעות פלטפורמה אוטומטית מבוססת פלטה של שישה בארות (PIXY) המשולבת עם ספקטרומטריית מסות (MS). שיטה זו מאפשרת מיפוי (footprinting) מהיר ובעוצמה גבוהה של חלבונים בתרביות של תאים חיים, ובכך מקלה על חקר אינטראקציות בין חלבונים, דינמיקה קונפורמציונית ושינויים מבניים בתוך הסביבה התאית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פרוטאומיקה מבנית
- כימיה של חלבונים
- ביולוגיה של התא
- ספקטרומטריית מסות
רקע
- FPOP היא טכניקה של טביעת רגל של חלבונים באמצעות רדיקלי הידרוקסיל המשמשת לחקר מבנה חלבונים ואינטראקציות ביניהם.
- שיטות FPOP מסורתיות הן גוזלות זמן ולעיתים קרובות מוגבלות למחקרים in vitro.
- התקדמויות אחרונות אפשרו סימון חלבונים בתאים חיים, דבר המספק תובנות על התנהגות חלבונים בהקשרים תאיים מורכבים.
- אוטומציה ומזעור יכולים להגביר משמעותית את התפוקה ואת השחזוריות.
מטרת המחקר
- פיתוח ותיקוף של פלטפורמת FPOP מהירה ואוטומטית בתוך תאים, תוך שימוש במערכת של פלטה עם שישה בארות.
- השוואת היעילות והכיסוי של אינקובטור הפלטפורמה החדשה אל מול מערכות FPOP מסורתיות מבוססות זרימה.
- מתן אפשרות למחקרים בעלי רזולוציית זמן של דינמיקה ואינטראקציות של חלבונים בתאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית תאים וטרנספקציה זמנית בדגרה מבית אחת עם בקרת טמפרטורה, CO2 ולחות.
- הגשה אוטומטית של ריאגנטים באמצעות משאבות פריסטלטיות וצינוריות מותאמות בפורמט של פלטה בעלת שש בארות.
- יצירת רדיקלי הידרוקסיל באמצעות פולס לייזר בודד (לייזר אקסימר KrF ב-248 nm) עבור כל בארה.
- ניתוח מודיפיקציות של חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ומספקטורומטריה תנשומית של מסות (LC-MS/MS).
תוצאות עיקריות
- אינקובטור הפלטפורמה אפשר ניתוח FPOP תוך 20 שניות לדגימה, הפחתה של פי 60 בזמן בהשוואה למערכות זרימה.
- באמצעות אינקובטור הפלטפורמה זוהו יותר חלבונים ושיירים משוכתים מאשר במערכת הזרימה (792 לעומת 545 חלבונים; 12 לעומת 3 שיירים משוכתבים באקטין).
- כיסוי פפטידי ומידע מבני משופרים הושגו באינקובטור הפלטפורמה.
- יעילות הטרנספקציה והחיוניות התאית נשמרו בתנאי אינקובטור הפלטפורמה.
מסקנות
- פלטפורמת ה-IC-FPOP האוטומטית המבוססת על פלטת שישה בארות משפרת משמעותית את תפוקת העבודה ואת איכות הנתונים עבור מיפוי טביעות חלבון בתוך תאים.
- שיטה זו מאפשרת מחקרים מפורטים בעת רב (time-resolved) של מבנה חלבונים ואינטראקציות בתאים חיים.
- הפלטפורמה מתאימה ליישומים מגוונים במסגרות מחקר אקדמיות, קליניות ותעשייתיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמת ה-PIXY מאפשרת ביצוע מהיר ובספיקה גבוהה של בדיקת טביעות חלבון (protein footprinting) בתוך התא, ובכך היא תומכת ישירות בחקר מבנה חלבונים ואינטראקציות ביניהם בשלבי הגילוי, בסביבות רלוונטיות פיזיולוגית. על ידי קיצור זמן הניתוח מ-20 דקות ל-20 שניות לדגימה, מערכת זו מאיצה את הפחתת הסיכונים המכניסטיים ומגבירה את הביטחון החזוי לאישור מטרות (target validation) וסינון מובילים (lead triage). השילוב של אוטומציה ותאימות לתאים חיים הופך את הפלטפורמה לנכס רב-שימושי עבור פרוטאומיקה מבנית בקנה מידה ארגוני ומחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של אינטראקציות בין חלבון לליגנד ובין חלבון לחלבון בתאים חיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מיפוי שינויים קונפורמציונליים ואתרי אינטראקציה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות נתונים מבניים ברזולוציה גבוהה ובניתוח של תהליכים תלויי-זמן.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור קידום מטרות בתוך פורטפוליו הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות מתוקפות ורלוונטיות פיזיולוגית עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מספק נתוני מודיפיקציה סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וכמותיים עבור פיתוח בדיקות.
- מאפשר ניתוח מקבילי מהיר על פני תנאים או תרכובים מרובים.
- תומך בהערכה מהימנה של שינויים מבניים המושרים על ידי תרכובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה תובנות מבניות של חלבונים להקשרים תאיים הרלוונטיים למחלה.
- מספקת רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור מחקרים בתוך התא.
- מפחיתה סיכון תרגומי על ידי לכידה של דינמיקה של חלבונים התלויה בהקשר.
- תומכת בגילוי סמנים ביולוגיים באמצעות מיפוי מקיף של מודיפיקציות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פלטפורמת PIXY ממוקמת בנקודת המפגש בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר תרגומי, מה שמאפשר מעבר חלק מבדיקת השערות ועד לתיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: מאיצה את בדיקת ההיפותזות ואת הבהרת המסלולים על ידי מתן אפשרות לחקירה מבנית מהירה בתוך התא.
- סריקה: מספקת תוצריים כמותיים, הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתונים רחבי-תוכן על מודיפיקציות לצורך השוואה סטטיסטית חזקה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים על ידי תמיכה במחקרים במערכות חיות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ברמת הארגון: מציעה פלטפורמה אוטומטית הניתנת להרחבה ומותאמת למטרות חלבון שונות ולמודלים תאיים מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה, משפר את השחזוריות ומאפשר סקילביליות של תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים מהירים וניתנים ליישום.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, ספקטרומטריית מסות וסימון פוטוכימי של חלבונים.
- נדרשת גישה לאינקובטור פלטפורמה עם בקרות סביבתיות ואופטיקה לייזר מובנית.
- התהליך דורש טכניקת סטריליזציה קפדנית וסטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לקווי תאים וליעדי חלבון שונים באמצעות התאמות מאושרות.
- הספק והאוטומציה תלויים בשילוב של משאבות, תוכנה וכיול אופטי.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Platform Incubator for IC-FPOP
2:08
IC-FPOP in the Platform Incubator
3:41
Results: Analysis of Cell Transfection Efficiency, Proteins Modified in Single Cell Flow-System and PIXY, and Localization of IC-FPOP Modifications
5:22
Conclusion
