Name: פילוח RNA בכל מקום וריאקמה בדרוסופילים מלנוגאסטר באמצעות CRISPR/CasRx (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: למדו פרוטוקולים לפילוח RNA כללי ורקמתי ב-Drosophila melanogaster באמצעות CRISPR/CasRx. השיטה מאפשרת הפחתה יעילה של שעתוקי RNA עם הערכת תוצאות פנוטיפיות ומולקולריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מענק תוכנית הגנים הבטוחים של DARPA (HR0011-17-2-0047), ופרסים של NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) שהוענק ל- O.S.A.

<ol><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Communications%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nat Communications. 9, 1911(2018).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), 5573(2016).</li>
<li>East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Targeting+by+Functionally+Orthogonal+Type+VI-A+CRISPR-Cas+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes.</a> Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).</li>
<li>Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+Engineering+with+RNA-Targeting+Type+VI-D+CRISPR+Effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.</a> Cell. 173 (3), 665-676 (2018).</li>
<li>Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+Targeting+Using+CasRx+in+Flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies.</a> The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+Induces+Efficient+mRNA+Knockdown+in+Animal+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550, 280-284 (2017).</li>
<li>Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNAi%3A+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo RNAi: today and tomorrow.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640(2010).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature Methods. 8, 405-407 (2011).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+and+parameters+for+targeted+transgenic+RNA+interference+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5, 49-51 (2008).</li>
<li>Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+%28RNAi%29+Screening+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila.</a> Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+off-target+effects+associated+with+long+dsRNAs+in+Drosophila+melanogaster+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays.</a> Nature Methods. 3, 833-838 (2006).</li>
<li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li>
<li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+arising%3A+off-targets+and+genome-scale+RNAi+screens+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila.</a> Fly. 1 (1), 1-5 (2007).</li>
<li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).</li>
<li>Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheating+evolution%3A+engineering+gene+drives+to+manipulate+the+fate+of+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations.</a> Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103(2020).</li>
<li>Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-mediated+suppression+of+dengue+viruses+in+the+salivary+glands+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).</li>
<li>Franz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).</li>
<li>Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+miRNAs+induce+dual+arboviral-resistance+phenotypes+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> Communications Biology. 1, 11(2018).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li>
<li>Addgene. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/">https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/</a> (2020).</li>
<li>Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Addgene. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr/">https://www.addgene.org/protocols/pcr/</a> (2020).</li>
<li>Indiana University Bloomington. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL</a> (2020).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3Aultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).</li>
<li>Poe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+CRISPR%2FCas9-Mediated+Tissue-Specific+mutagenesis+reveals+gene+redundancy+and+perdurance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila.</a> Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).</li>
<li>Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+ger+mLine+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li>
<li>Yang, S., Li, S., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+the+Half-Life+of+Cas9+maintains+its+gene+editing+ability+and+reduces+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity.</a> Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).</li>
<li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> eLife. 9, 53865(2020).</li>
<li>Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+Effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264(2015).</li>
<li>Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolkit+for+CRISPR-Cas13-based+RNA+manipulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila.</a> Genome Biology. 21, 279(2020).</li>
</ol>

O.S.A הוא מייסד Agragene, Inc. , יש אינטרס הון עצמי, ומכהן בוועדה המדעית המייעצת של החברה. תנאי הסדר זה נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו בהתאם למדיניות ניגוד העניינים שלה. כל הסופרים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

עם שלושה עיצובי יישומים שונים של מערכת CasRx, עבודה זו הדגימה RNA לתכנות vivoprogramming בזבובים. האסטרטגיות השונות מספקות צרכי פרויקט שונים, כגון פילוח גנים אנדוגני לעומת אקסוגני ומיקוד RNA בכל מקום לעומת פילוח RNA ספציפי לרקמות. ההשפעות של פילוח RNA כללו שינויים פנוטיפיים ספציפיים לגן היעד, הפחתת תעתיק RNA היעד, ופנוטיפים קטלניות מדי פעם הקשורים לביטוי גבוה של חלבון CasRx ופעילות נלווית. בסך הכל, תוצאות אלה הראו כי מערכת CasRx מסוגלת למקד הפחתת תעתיק RNA ברמה האורגנית באופן ניתן לתכנות ויעיל.
אחד הגורמים העיקריים להתאמה אישית מוצלחת של מערכת CasRx הוא העיצוב של gRNAs. באופן ספציפי, העצה הבאה תהיה לשים לב: רצף היעד הוא סביב 30 נוקלאוטידים באורך, אורך מתיחות poly-U ברצף היעד הוא 4 זוגות בסיס או פחות, תוכן GC רצף היעד הוא בטווח של 30% - 70%, רצף היעד אינו צפוי ליצור מבני סיכת ראש RNA חזקים, ואת רצף היעד מכיל מבנה RNA משני או שלשלני חזוי מינימלי5.
בנוסף לתכנוני ה-gRNA, שלב הגנטיקה של הזבוב בכל פרוטוקול הוא קריטי גם ביישום מוצלח. נוכחות או היעדר פנוטיפים מוגדרים שהועברו מההורים בצאצאים חשובים לזיהוי וכימות פנוטיפים הנגרמים על ידי מערכת CasRx בצאצאי transheterozygous. כמו כן, הגדרת צלבי בקרה באמצעות זבובי dCasRx במקביל מועילים גם לפנוטיפים לא ספציפיים בצאצאי transheterozygous.
ראוי לציין כי תוצאות אלה חשפו בעיית רעילות שהוצגה על ידי הבעת CasRx וחלבון dCasRx בכל מקום בזבוב, מגבלה של מערכת CasRx. ביטוי בכל מקום של CasRx או dCasRx תחת מקדם Ubiq לבד, ללא gRNAs, הגיע עם עלויות כושר לא טריוויאלי, כמו לא זבובי Ubiq-CasRx ולא זבובי Ubiq-dCasRx יכול להיות מבוסס כמו קווי הומוזיגוס. להיפך, UASt-CasRx ו UASt-dCasRx זבובים ניתן לבסס כמו מניות הומוזיגוס בריא, אם כי בשל העיצוב של ערכת הצלב הם נשמרו כמו מלאי מאוזן כפול, עובדה התומכת בקיומה של רעילות הנגרמת על ידי ביטוי חלבון CasRx בכל מקום. ראיה תומכת נוספת היא כי בניסויי בקרה מעורבים dCasRx, אשר אינו פעיל מבחינה קטליטית, אחוזי הזבובים הנושאים הן dCasRx והן gRNA מבנים מתוך המספר הכולל של זבובים בדור F1 היו נמוכים בעקביות מ -50%, היחס הצפוי בהתבסס על גנטיקה מנדליאנית אם לא היה קיים רעילות הקשורה ל- dCasRx. זה הצביע על כך בכל מקום להביע dCasRx, יחד עם gRNAs, גורמים רעילות בזבוב, וכתוצאה מכך יחס ירושה פחות מהצפוי. יחסי הירושה של transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, זבובי GAL4 עקבו אחר הגנטיקה המנדליאנית, אשר שוב מרמז על הרעילות הנגרמת במיוחד על ידי ביטוי בכל מקום של חלבוני CasRx ו- dCasRx. רעילות במערכת CRISPR/Cas אינה חדשה. כמויות גבוהות של חלבון Cas9 הוכח להיות רעיל במספר אורגניזמים, כולל זבובים 29,30,31,32. מחקר שנערך לאחרונה פיתח מערכת GAL4/UAS מותאמת אישית שיכולה לכוונן את כמות חלבון Cas9 המתבטאת בזבובים על ידי הוספת מסגרת קריאה פתוחה באורך משתנה בין רצף UAS לבין רצף Cas9 במבנה UAS-Cas933. לכן, כדאי לבחון דרכים להפחית רעילות הנגרמת על ידי CasRx על ידי כוונון רמת ביטוי חלבון CasRx.
מלבד הרעילות הנגרמת על ידי ביטוי בכל מקום של חלבוני CasRx ו- dCasRx, התוצאות הראו גם קטלניות הקשורה לאפקטים החוץ ספציפיים של מערכת CasRx, תכונה של מערכות CRISPR רבות1,2,7,34. בחלק מהזבובים CasRx ו- gRNA הגן הלא חיוני מבטאים זבובים כפולים או משולשים transheterozygous, למשל בעת מיקוד Notch, זבובי Transheterozygous CasRx יש רמות נמוכות משמעותית של שיעור הישרדות לעומת זבובי dCasRx transheterozgyous. בניתוח RNA-seq של זבובי הטרנסה-טרנס-ארק אלה ומבטאי gRNA, נצפו הן הפחתת רמות תעתיק גן היעד והן הפחתת תמלילי גנים שאינם מטרה. השפעות נלוות אלה היו תלויות CasRx ותלויות מטרה, שכן הן נצפו רק בזבובי טרנסהטרוזיגוס המבטאות הן את חלבון ה- CasRx והן את ה- gRNA. ראוי לציין כי אחד הגנים היעד, לבן, הראה רק ירידה מוגבלת, לא סטטיסטית משמעותית בתעתיקים כאשר הגן הלבן היה ממוקד על ידי CasRx, אשר היה בניגוד פנוטיפ הפחתת פיגמנט ברור. ההשערה היא כי ייתכן שהסיבה לכך היא ש- 1) התזמון של איסוף מדגם RNA-seq לא היה מיושר היטב עם התזמון כאשר הגן הלבן מגיע לביטוי השיא שלו במהלך ההתפתחות המוקדמת, ו -2) הביטוי המקומי של הגן הלבן בעיניים הופך אותו למאתגר לאסוף את הרקמות הרלוונטיות בשלב הפיתוח המוקדם כאשר רק איסוף מדגם של כל הגוף הוא אפשרי. כדי להפחית את הפעילות המשנית במערכת CasRx, מחקרים עתידיים נקראים להבין באופן מלא את המנגנונים שבבסיס מערכת התופעה מחוץ למטרה ברמה האורגנית.
מעניין, מחקר שנערך לאחרונה35 המתאר כלי Cas13 ממוקדי RNA בזבובים נראה כדי לשפר את הרעילות הכללית הקשורה ביטוי CasRx, מכמה סיבות אפשריות. ראשית, המחברים מקודדים מחדש את הטרנסג'נס Cas13 כדי לייעל את הביטוי בדרוסופילה והשתמשו במקדם חלש יותר (actin 5C) בהשוואה למקדם היוביקוויטין המשמש במחקר הנוכחי, מה שהוביל ככל הנראה לרמות נמוכות יותר של ביטוי Cas13 ובכך פחות רעילות. ואכן, זה נתמך על ידי התצפיות כי UAST מונע CasRx וביטוי dCasRx לא היה, כשלעצמו, רעיל, כמו מחקר זה (ואת המחברים ב 35) לא הבחין כל קטלניות ברורה זבובים UASt-CasRx. יתר על כן, מחברים אלה מקודדים gRNAs שלהם באופן שונה בהשוואה למחקר זה, אשר עשוי להשפיע על הביטוי שלהם והפחית את הרעילות של המערכת זבובי transheterozygous Cas13/gRNA. לדוגמה, במחקר שלהם שני gRNAs באו לידי ביטוי באמצעות מקדם U6:3 ומאוגף על ידי tRNAs כדי לאפשר עיבוד gRNA על התבגרות tRNA ללא צורך CasRx35. לעומת זאת, במחקר זה, gRNAs קודדו כערכים המתמקדים עד 4 מיקומים לכל גן ומחקים את מבנה מערך Cas13 אנדוגני שנמצא בחיידקים, אשר דורש את האנזים Cas13 לעבד כל gRNA. גישות שונות אלה עשויות להוביל להבדלים ברמות ביטוי gRNA וגורמים אחרים שעשויים להיות להם השפעות מובנות על הרעילות של המערכת כולה. לבסוף, Huynh ואח ' ממוקד גנים שונים מאלה ממוקדים במחקר הנוכחי, אשר לגרום הבדלים באינטראקציה היעד-Cas / gRNA ופעילות בטחונות ועשויים להיות השפעות על רמות הנצפות של קטלניות. הבדלים אלה ברעילות שנצפתה מצדיקים חקירה נוספת כדי לזהות דרכים שבהן ניתן לשפר את המערכות הכוללות.
בסך הכל, מחקר זה הוא ההדגמה הראשונה של מערכת Cas ממוקדת גנטית פונקציונלית לתכנות ב- D. melanogaster, אם כי אופטימיזציה נוספת של מערכת CasRx (בהתאם למה שדווח35) תידרש להפחית עוד יותר את הקטלניות הקשורה למטרה ולהגדיל את היעילות של מחשוף CasRx על היעד. פילוח RNA עם אנזימי Cas הוא תחום המתפתח במהירות עם יישומים פוטנציאליים רבים החל בקרה וקטור חרקים לשימושים טיפוליים1,2,3,4,5,6,7, ופרוטוקול זה מציע חבילת התחלה לכל מי שמעוניין לעצב את מערכת CasRx הראשונה שלהם בזבובים, תוך התאמה להתאמה אישית ואופטימיזציה נוספת של המערכת. הדוגמאות המוצגות כאן מדגימים מגוון תוצאות שניתן להיתקל בהן במהלך יישום מערכת זו ב- vivo ועשויות לשמש אמות מידה עבור משתמשים אחרים בהערכת הביצועים של מערכת CasRx ביישומים שלהם.

מאז הופעתן של טכנולוגיות פלינדרומיות קצרות (CRISPR), רוב המיקוד בתחום זה היה בעריכת דנ"א, המציע יישומים טרנספורמטיביים ברפואה וביוטכנולוגיה1. שינוי קבוע של רצפי DNA, עם זאת, לא תמיד רצוי משיקולים אתיים. לאור זאת, מחקרים שנערכו לאחרונה החלו לפתח כלים מבוססי CRISPR למיקוד RNA והוכיחו כי אכן ניתן להשתמש בטכנולוגיות CRISPR למיקוד RNA במגוון מערכות ביולוגיות2,3,4,5,6,7. ברבות מהמערכות הללו שנבדקו, הגישה הנפוצה כיום למיקוד RNA והפחתת תמלילים היא הפרעות RNA (RNAi), אשר רחוק מלהיות מושלם, לעתים קרובות מציג יעילות מגוונת ופעילות גבוהה מחוץ למטרה כאשר נעשה שימוש vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . לכן, בהתחשב במצב של טכנולוגיות אלה, כדאי לבחון עוד יותר את הפוטנציאלים של כלים מבוססי CRISPR עבור פילוח RNA.
מחקר אחד בולט שנערך לאחרונה דיווח כי ריבונוקלאז CasRx, חבר בכיתת Cas13d, יכול להפחית ביעילות את רמות תעתיק הגנים בתרבות התאים האנושיים ובעל פרופיל אטרקטיבי מחוץ למטרה4. ממצא זה הוביל לשאלה אם ריבונוקלאז חדש זה יכול לשמור על יעילותו ושיעור נמוך מחוץ למטרה עבור RNA מיקוד ברמה האורגנית. מחקר שנערך לאחרונה התייחס לשאלה זו על ידי מראה כי מערכת CasRx ניתן להשתמש כדי להשיג בכל מקום ורקמות ספציפי תעתיק תעתיק Drosophila melanogaster5.
כדי לייעל את השימושיות של גישה זו שפורסמה לאחרונה, פרוטוקול זה מפרט את השיטות מעבודה זו לאחרונה, המורכבת משלושה חלקים עיקריים: 1) הנמצאים בכל מקום במיקוד RNA של vivo באמצעות מערכת CasRx בעלת שני רכיבים; 2) בכל מקום ב- vivo אקסוגני RNA מיקוד באמצעות מערכת CasRx שלושה רכיבים; ו-3) פילוח RNA ספציפי לרקמות באמצעות מערכת CasRx בעלת שלושה רכיבים.
מדריך RNAs (gRNA) מיקוד גנים יעד שונים תחת שליטתו של מקדם בכל מקום תוכננו וקווי זבוב המבטאים מבנים המכילים gRNA אלה נוצרו. מבנים CasRx תחת שליטתו של מקדם בכל מקום, או מקדם רצף הפעלה במעלה הזרם מותנה (UASt) הניתן להפעלה על ידי גורם התמלול GAL4, תוכננו גם הם וקווים מעופפים המטפחים מבנים המכילים CasRx אלה שנוצרו. מבנים CasRx לא פעילים קטליטית, dCasRx, תוכננו ושימשו כפקדים שליליים. RNA בכל מקום מיקוד זבובים מושגת על ידי חציית קווי זבובים ביטוי gRNA עם קווי זבובים בכל מקום CasRx ביטוי. האבן המבטאת הן את מבנה ה- gRNA המתמקד בתעתיק גנים מסוים והן בחלבון CasRx יש הפחתה בכל מקום של תמלילי גנים ממוקדים. RNA ספציפי לרקמות הממוקד בזבובים מושג על ידי חציית זבובים הראשונים המביעים GRNA עם UASt-CasRx המבטאים זבובים, המשיגים זבובים טרנסהטרוזיגוס הנושאים מבנים GRNA ו- UASt-CasRx. זבובים כאלה בתורם חוצים עם זבובים ספציפיים לרקמות GAL4 ביטוי, וכתוצאה מכך ייצור של ביטוי CasRx ספציפי לרקמות ומיקוד RNA בזבובים.
האופי הניתן לתכנות של מערכת CasRx מציע אפשרות להתאמה אישית ואופטימיזציה כדי לסייע בהשגת יעילות גבוהה ופעילות נמוכה מחוץ ליעד עבור פילוח RNA של vivo. יישומים פוטנציאליים של פילוח RNA מבוסס CRISPR הם רבים, כולל החלפת RNAi במעבדה ותרומת בקרת וקטור חרקים בטבע. של האחרון, אחד הצרכים העולמיים ללא מענה הוא פיתוח כלים יעילים כדי להילחם בזיהומים של וירוסי RNA המועברים באמצעות יתושים. נגיפי RNA רבים, כגון דנגי, זיקה ווירוס צ'יקונגוניה, מועברים באמצעות יתושים, המשפיעים על בריאות האדם ותורמת לתמותה. הצעות רבות להנדסת אוכלוסיות יתושים עם עמידות לנגיף למניעת מחלות הובאו; עם זאת, אף טכנולוגיה נוכחית אינה מסוגלת להפוך יתושים לעמידים בו זמנית בפני כל נגיפי ה- RNA המשמעותיים18,19,20,21,22,23. מערכות Cas המיועדות ל-RNA עשויות לספק נקודת התחלה לטכנולוגיה כזו על-ידי הפעלת פלטפורמה ניתנת לתכנות למיקוד כל נגיפי הרנ"א המועברים על ידי יתושים.

<table><tbody><tr><td>100% מיץ ענבים</td><td>וולש פודס בע"מ</td><td>N/A שמרים יבשים פעילים</td><td></td></tr><tr><td>(908 גרם)</td><td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה צבעונית DMC4500</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בדיקת Dual-Luciferase Reporter</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק</td><td>סנטר 29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 20/20 לומינומטר</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500</td><td>Sequencer Illumina, Inc.</td><td>HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop OneC ספקטרופוטומטר UV-vis</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA ספריית ערכת הכנה ניו</td><td>אינגלנד Biolabs, Inc.</td><td>פלסמיד E7770</td><td></td></tr><tr><td># 112686</td><td>פלסמיד 112686</td><td></td><td></td>Addgene</tr><tr><td># 112688</td><td>Addgene</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132416</td><td>Addgene</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132417</td><td>Addgene</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132419</td><td>Addgene</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132420</td><td>Addgene</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132421</td><td>Addgene</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132422</td><td>Addgene</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאזות הגבלה AscI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאזות הגבלה NotI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאזות הגבלה PacI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאזות הגבלה PstI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאזות הגבלה SwaI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאזות הגבלה XbaI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ</td><td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit עבור Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-Fluc זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק</td><td>סנטר 84986</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-N טסים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק</td><td>סנטר 84122</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-w טסים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-y טסים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק</td><td>סנטר 84123</td><td></td></tr><tr><td>UASt-CasRx טסים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla זבובים</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>ערכות ג'ל לשחזור DNA של Zymoclean</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

פילוח rna בכל מקום וריאקמה בדרוסופילים מלנוגאסטר באמצעות crispr/casrx

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, חברה במשפחת Cas13 הממוקדת ברנ"א, היא תוספת חדשה ומבטיחה של טכנולוגיות CRISPR/Cas בהפחתת תמליל גנים יעילה עם פרופיל אטרקטיבי מחוץ למטרה הן ברמה התאית והן ברמה האורגנית. לאחרונה דווח כי מערכת CRISPR/CasRx יכולה לשמש להשגת הפחתת תעתיק גנים בכל מקום ורקמות ספציפית לדרוסופיל מלנוגאסטר. מאמר זה מפרט את השיטות מהעבודה האחרונה, המורכבת משלושה חלקים: 1) בכל מקום ב- vivo אנדוגני RNA פילוח באמצעות מערכת CasRx שני רכיבים; 2) בכל מקום ב- vivo אקסוגני RNA מיקוד באמצעות מערכת CasRx שלושה רכיבים; ו-3) פילוח RNA ספציפי לרקמות באמצעות מערכת CasRx בעלת שלושה רכיבים. ההשפעות של פילוח RNA שנצפו כוללות שינויים פנוטיפיים ספציפיים לגנים ממוקדים, הפחתת תעתיק RNA ממוקדת, ופנוטיפים קטלניים מדי פעם הקשורים לביטוי גבוה של חלבון CasRx ופעילות נלווית. בסך הכל, תוצאות אלה הראו כי מערכת CasRx מסוגלת למקד הפחתת תעתיק RNA ברמה האורגנית באופן ניתן לתכנות ויעיל, המוכיח כי ב- vivo transcriptome פילוח, והנדסה היא אפשרית ומניחה את הבסיס לטכנולוגיות פילוח RNA מבוססות VIVO CRISPR.

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש באנזים Cas13D הממוקד ברנ"א (RfxCas13D) בזבובים.

פילוח RNA בכל מקום וריאקמה בדרוסופילים מלנוגאסטר באמצעות CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

כפי שהפרוטוקול שלנו מראה, ניתן להשתמש בטכנולוגיות CRISPR CasRx כדי להשיג הפחתות תעתיק גנים בכל מקום ורקמות ספציפיות לזבובי פירות. הטכניקה שלנו מציעה חבילת מנות ראשונות לכל מי שמעוניין להשתמש בהפחתת תמליל גנים מבוססי CRISPR בזבובי פירות תוך התאמה להתאמה אישית ואופטימיזציה נוספות. כדי להגדיר מיקוד RNA בכל מקום ב- vivo באמצעות מערכת CasRx שני רכיבים, לאסוף 10 זבובים נקבה בוגרת בתולה מקו ה- gRNA הומוזיגוס וחמישה זבובים זכרים בוגרים מן הטרוזיגוס מאוזן Ubiq CasRx CurlyO.מניחים את זבובי ההורים לתוך בקבוקון בתוספת 100 מיקרוגרם של אבקת שמרים יבשים ומניחים את הבקבוקונים במשך 48 שעות ב 26 מעלות צלזיוס. שימו לב לבקבוקונים כל יום כדי לראות אם צאצאים בוגרים חדשים יצאו מהערווה של דור ה-F1 והרדים מישהו מהמבוגרים עם פחמן דו חמצני במשך 10 שניות. ברגע שהזבובים הופכים לרוקנים את הנקניקון על משטח זבוב המחובר למיכל הפחמן הדו-חמצני עם דו תחמוצת הפחמן המתמדת ומשתמשים במצלמת צבע המחוברת למיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי כדי להבקיע ולדמות את הפנוטיפים של הזבובים.ואז לספור את המספרים של צאצאים עם פנוטיפים שונים, על פי ביטוי האות פלואורסצנטי. בהתבסס על גנטיקה מנדליאנית, 50% מה הצאצאים צפויים לבטא את הרנ"א הממוקד. שים לב כי רעילות של מערכת Ubiq CasRx עשויה להפחית את היחס בין RNA ממוקד מבטא צאצאים לפחות מ -50%כדי להגדיר בכל מקום ב- vivo אקסוגני RNA מיקוד באמצעות מערכת CasRx שלושה רכיבים, לאסוף שמונה עד 10 זבובים נקבה בוגרת בתולה מקו ביטוי לוציפראז כפול וארבעה עד חמישה זבובים זכרים בוגרים מן הטרוזיגוס המאוזן Ubiq CasRx קרלי פלוס TM6, קו STB המציג עיניים לבנות, כנפיים מתולתלות, ו- ds פלואורסצנטיות אדומה בו זמנית.מניחים את שלב ההורה אחד מוצלב במין בתוספת 100 מיקרוגרם של אבקת שמרים יבשים ומניחים את הצלב הזה במשך 48 שעות ב 26 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להסיר את כל זבובי ההורים מכל בקבוקון ולהחזיר את הבקבוקונים לחממה 26 מעלות צלזיוס לפחות 14 ימים. במהלך 14 ימים, כאמור לאסוף שמונה עד 10 בתולות נקבה מן הומוזיגוס גחלילית לוציפראז מיקוד קו gRNA שלוש פעמים.שים לב לשלב אחד לחצות בקבוקונים כל יום כדי לראות אם כל צאצאים בוגרים חדשים יצאו מן הגולם, מרדים עם פחמן דו חמצני כדי לאפשר איסוף של ארבעה עד חמישה זבובים זכרים מבטאים הן את Ubiq CasRx ואת כתב לוציפראז כפול כפי זמין. מניחים את הזבובים לתוך ביון חדש עם 10 נקבות בתולה מן זבוב הפירות לוציפראז מיקוד קו gRNA, ומניחים אלה שלב שני צלבים ב 26 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לאסוף עוד חמישה גברים בני יום אחד מבטאים הן את Ubiq CasRx וכתב לוציפראז כפול מן השלב הראשון לחצות בקבוקונים ודגורת הזבובים במשך יומיים עד ארבעה ימים לבד ב 26 מעלות צלזיוס לפני העברתם לתוך צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.בסוף הדגירה, הסר את כל הבקבוקונים ההוריים מכל אחד מהשלב השני של בקבוקונים חוצים. ולהחזיר את הבקבוקונים לחממה של 26 מעלות צלזיוס למשך 20 יום לפחות. שימו לב לשלב השני של בקבוקונים חוצים מדי יום כדי לראות אם צאצאים בוגרים חדשים יצאו מהערווה, מרדים את הזבובים עם פחמן דו חמצני כשהם הופכים לזמינים, ומבקיעים ומדמימים את הפנוטיפים שלהם כפי שהודגם.הגנטיקה של מנדליה מצביעה על כך שאם כל הזבובים הם ברי קיימא, 25% מהצוידים צריכים לבטא את הרנ"א הממוקד. כדי לבצע צ'ייז לוציפראז, ליצור את זבובי הטרנס הטרוזיגוס המשולשים, כמו גם את זבובי הבקרה כפי שהודגם. איסוף הזבובים הזכרים בלידה, והזדקנותם עד גיל שלושה ימים.העבר את זבובים בן שלושה ימים לתוך צינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר, ולזר אותם באמצעות חוצץ במאגר תמוגה לוציפראז מערכת בדיקת לוציפראז זמין מסחרית. לאחר מכן להשתמש חמישה microliters של רקמה lysed מכל מדגם ו luminometer כדי למדוד הן זבובי פירות ופעילות לוציפראז, על פי פרוטוקולי בדיקת לוציפראז סטנדרטיים. F1, טרנס הטרוזיגוס CasRx, יש שיעורי הישרדות נמוכים באופן משמעותי בהשוואה זבובי הטרנס heterozygous dCasRx.אישור הרעילות של מערכת Ubiq CasRx של שלושת הגנים היעד, זבובי U6 gRNA Y הטרוזיגוס אינם ניתנים להפעלה ואינם גדלים מעבר לשלב הזחל השני. זבובי ההטרוזיגוס של אואבק קסקס ו-U6 gRNA W, מדגימים פנוטיפ ברור של עיניים רחבות. בנוסף, נצפתה גם הפחתה משמעותית של תמלילי גנים ממוקדים לשלושה גנים ממוקדים.ראיות לפעילות מחוץ למטרה הנגרמת על ידי CasRx נצפות גם כאשר מושוים תמלילים דיפרנציאליים בין דגימות מ- CasRx המבטאים זבובים ודגימות מ- dCasRx המבטאים זבובים. בשני השלבים, רק השילוב של כל שלושת הגנים הטרנסג'נדרים גורם ל-100% קטלניות. כאשר משתמשים בפילוח RNA ספציפי לרקמות באמצעות עיצוב מערכת CasRx שלושה רכיבים, רמת הרעילות מופחתת כאשר הביטוי הכללי CasRx יורד באמצעות מקדם UAST בהשוואה לזה של מקדם Ubiq.חשוב להגדיר את התהליך הגנטי כראוי באמצעות זבובים של מגדר נכון פנוטיפים נכונים.

ubiquitous-tissue-specific-rna-targeting-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי החלפת את אקסון קידוד הראשון של גנים עם מנהלי התקנים של שעתוק. השיטה מבוססת על CRISPR/Cas9 ממקם את רצף transactivator תחת ויסות גנים הוחלף אנדוגני, כתוצאה מכך ומקילה על ההתבטאות transctivator באופן בלעדי בדפוסי ייתכן גנים ספציפיים.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

מוצג כאן הוא פרוטוקול להשתמש במערכת CRISPR-Cas9 להפחתת הייצור של חלבון במוח דבורת דבש למבוגרים כדי לבדוק ספציפיות נוגדנים.

Anti-RDL ו Anti-mGlutR1 קולטנים נוגדן בדיקות בסעיפים המוח הונאיבי באמצעות CRISPR-Cas9

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.

אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

למדו פרוטוקולים לפילוח RNA כללי ורקמתי ב-Drosophila melanogaster באמצעות CRISPR/CasRx. השיטה מאפשרת הפחתה יעילה של שעתוקי RNA עם הערכת תוצאות פנוטיפיות ומולקולריות.

פילוח RNA בכל מקום וריאקמה בדרוסופילים מלנוגאסטר באמצעות CRISPR/CasRx

גלה סרטונים נוספים