Name: הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: חקור את השפעות הנזק החמצוני על מיטוכונדריה וחלקיקי Clu בתאי ביצה של Drosophila melanogaster באמצעות הדמיה חיה. פרוטוקול זה מספק בקרה להבחנה בין מתח תאי כללי לטיפולים ניסיוניים ספציפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר ג'רמי סמית על תמיכת ההדמיה ולאן סי שנק על האיורים, ההפקה והווידאוגרפיה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (1R01GM127938 כדי R.T.C.).

1. הכנת מדיית ניתוח והדמיה
הערה: המדיה המתאימה ביותר לניסוי הדמיה חיה זה מכילה את המדיה Drosophila של שניידר המכילה 15% חום מומת סרום שור עוברי, 0.6x עט סטרפטוקוקוס, ו 200 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין שור, להלן המכונה המדיה של שניידר שלם.
<ol><li>בצע את ההכנה התקשורתית בתנאים סטריליים כדי להבטיח שהיא לא תזוהם. התקשורת פותחה כדי לתמוך Drosophila ovarioles לתקופות ממושכות של זמן9.</li>
	<li>הוסיפו 15% סרום שור עוברי מומת בחום, 0.6x Pen-Strep ואינסולין בקר 200 מיקרוגרם/מ"ל למדיה של שניידר.</li>
	<li>מערבבים היטב את התוכן ומאחסנים ב 4 מעלות צלזיוס לילה. הערה: האינסולין אינו מתמוסס לחלוטין במדיה המלאה של שניידר, ותבחינו במשקע המתיישב בתחתית הצינור.</li>
	<li>הפוך aliquots של התקשורת, להיות בטוח לעזוב את המשקעים כפי שהוא יפריע הדמיה. הערה: פתרון זה עשוי לשמש בתוך חודש אם מאוחסן aliquots ב 4 °C (69 °F).</li>
</ol>2. אוסף דרוזופילה לניתוח
הערה: ניתן למצוא גם נהלי איסוף וניתוק מפורטים של Drosophila בוייל ואח'10 ופרקר ואח'11.
<ol><li>להדמיה אופטימלית של תאי נבט נשיים, הכינו תחילה בקבוקון המכיל מזון זבוב קמח תירס סטנדרטי וקצת משחת שמרים רטובה שהיא עקביות של חמאת בוטנים. פעולה זו מבטיחה שהזבובים הנשיים יוזנו היטב וייצרו את כל שלבי התפתחות הזקיק להדמיה.</li>
	<li>עבור זבובים בריאים אופטימלית, לאסוף נקבות 0-1 יום והעברה עם זכרים לתוך בקבוקון מזון זבוב המכיל הדבק שמרים רטובים. הערה: ודא זבובים ישנים לא ליצור קשר עם הדבק שמרים כפי שהם יכולים לדבוק בו.</li>
	<li>להאכיל את הזבובים 3-7 ימים, שינוי הבקבוקון ואת הדבק שמרים מדי יום. הערה: ודא את הדבק שמרים קשר מזון לטוס כך שהוא לא להתייבש.</li>
</ol>3. ניתוח שחלות דרוזופילה
הערה: חשוב להכין את פתרונות המדיה טריים כי מי חמצן רגישים חמצון TMRE משפיל לאורך זמן.
<ol><li>ממש לפני הניתוח, במדיה של שלם שניידר, להכין aliquot טרי של 2 μM H2O2 פתרון, aliquot טרי של 46 nM tetramethylrhodamine, אתיל אסתר (TMRE), ו aliquot טרי של פתרון 46 nM TMRE המכיל 2 מיקרומטר H2O2.
</li>
	<li>לניתוח השחלות, השתמשו בשני זוגות מלקחיים עדינים וזוג מחטי טונגסטן מחודדות אלקטרוליטיות12. כדי לנתח את השחלות, מלאו 2-3 בארות של צלחת ניתוח תחתית זכוכית (זכוכית שעון) עם שלם שניידר שהתחמם לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הרדמה של בקבוקון של זבובים משומנים עם פחמן דו חמצני ולהפריד את המספר הרצוי של זבובים נקבה להיות מנותח. מקם זבוב בודד במדיה באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מנתח, בעדינות לתפוס את הזבוב על ידי בית החזה באמצעות זוג אחד של מלקחיים עדינים. עם זוג מלקחיים אחרים, לתפוס את האחורי, בעדינות למשוך כדי להסיר את השחלות. הערה: אם השחלות אינן יוצאות בצורה חלקה בשיטה זו, ניתן גם להסיר את הבטן כולה מהעף, ואת השחלות ניתן לסחוט בעדינות משני קצה הבטן באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>הסר כל קוטיקולה או רקמה חוץ גופית, ולאחר מכן להעביר את השחלות לבאר חדשה המכילה מדיה טרייה. השחלות עדיין צריכות לנוע ממעטפת השרירים שמסביב.</li>
</ol>4. הכנת אובריול להדמיה
<ol><li>באמצעות מחטי טונגסטן מחודדות, להקניט בעדינות את ovarioles לגזרים, מקפיד להסיר את נדן השריר שמסביב (איור 1).</li>
	<li>להקניט בעדינות את כל נדן השרירים וסיבי העצב המחוברים לאובריולס המבודדים(איור 2). הערה: אם נדן השריר אינו מוסר, ovariole יהיה עווית ולזוז, גרימת בעיות עם רכישת תמונה (וידאו 1).</li>
	<li>אם המבנים התת-תאיים בעלי העניין מסומנים באופן אנדוגני, המשך לשלב 4.4. אם מבני העניין יסומנו בצבע פלואורסצנטי, המשך לסעיף 5.</li>
	<li>לאחר ovarioles כבר נותחו בצורה נקייה, באמצעות micropipette, להעביר אותם טיפה 100 μL של מדיה הדמיה של מלא שניידר לתוך דיכאון זכוכית של צלחת תחתית זכוכית. ovarioles בודדים ישקע לתחתית הטרופ.</li>
	<li>המשך לסעיף 6 להדמיה. הערה: להדמיית חלקיקי מיטוכונדריה וקלו, לא יותר מחמש-עשר דקות אמורות לחלוף מתחילת הניתוח ועד להדמיה.</li>
</ol>5. מיטוכונדריה מכתימה עם TMRE
הערה: נהלים מפורטים נוספים על כתמים חיים של המיטוכונדריה עם צבעים פלואורסצנטיים ניתן למצוא פארקר ואח '. 2017.
<ol><li>לאחר שלב 4.3, להעביר את ovarioles מבודד טיפה 100 μL של 46 nM TMRE מדיה לתוך דיכאון זכוכית של צלחת תחתית זכוכית. ovarioles בודדים ישקע לתחתית הטרופ.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. מניחים את המכסה על צלחת תחתית הזכוכית ומניחים את המנה בקופסה מכוסה למשך הניסוי כדי להגן מפני אור. הערה: לאחר הדגירה, ניתן לדמיין דגימות ישירות ללא שטיפות.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.1-5.2 כדי להכין לפחות שתי מנות של ovarioles שכותרתו TMRE, אחד לשמש כקבוצה ניסיונית ואחד לשמש שליטה.</li>
</ol>6. רכישת תמונה חיה
<ol><li>לאחר ovarioles מותקן, מניחים את אחת הכלים התחתונים זכוכית על המיקרוסקופ ולהגדיר את הפרמטרים הדמיה לפי הצורך. אורכי הגל האופטימליים של עירור/פליטה עבור TMRE המשמשים כאן הם 549 ננומטר/574 ננומטר.</li>
	<li>לאחר איתור שדה הראייה הרצוי, לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים של ovarioles אחד או יותר לפי הצורך כמו תיעוד של תנאים טרום טיפול.</li>
</ol>7. תוספת של מי חמצן במהלך ההדמיה
<ol><li>השהה הדמיה חיה, הסר את המכסה מהתבנית התחתונה של הזכוכית, והוסף בזהירות 100 μL של 2 μM H2O2 פתרון לצלחת באמצעות micropipette אם הדמיה מבנים מסומנים אנדוגני. אם הדמיה המיטוכונדריה, בזהירות להוסיף 100 μL של 46 nM TMRE עם 2 μM H2O2 פתרון לצלחת באמצעות micropipette (וידאו 2).<ol>
<li>הימנע משבירת פני השטח של טיפת המדיה הקיימת או הוספת הפתרון מהר מדי כדי לא לעקור את ovarioles נח על החלק התחתון של המנה (וידאו 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>החליפו את מכסה המנה (כיסוי כלים), החליפו מחדש את שדה הראייה הרצוי ומיקדו אותו מחדש במידת הצורך, וחידשו את ההדמיה (וידאו 3, וידאו 4, איור 3, איור 4).<ol>
<li>יש להקפיד לחדש את ההדמיה במהירות האפשרית לאחר תוספת H2O2 מכיוון שהטיפול הניסיוני רגיש לזמן (וידאו 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים של ovarioles אחד או יותר לפי הצורך. זה ישמש כתיעוד של תנאים שלאחר הטיפול.</li>
	<li>לשליטה, מניחים את צלחת תחתית הזכוכית השנייה על המיקרוסקופ וחוזרים על סעיף 6.</li>
	<li>חזור על שלב 7.1, הפעם הוספת 100 μL של מדיה TMRE בלבד למנה. אם דימות מבנים המסומנים באופן אנדוגני, הוסף 100 μL של פתרון המדיה בלבד של המלאי שניידר.</li>
	<li>חזור על שלבים 7.2 ו- 7.3 כדי להשיג נתונים עבור קבוצת הביקורת. הערה: להדמיית חלקיקי מיטוכונדריה וקלו, לא יותר משלוש-חמש דקות אמורות לחלוף מהתוספת של מי חמצן להדמיה.</li>
</ol>

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+iron+and+hydrogen+peroxide%3A+the+Fenton+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction.</a> Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless%2C+a+conserved+Drosophila+gene+required+for+mitochondrial+subcellular+localization%2C+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin.</a> Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).</li>
<li>Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless%2C+a+protein+required+for+mitochondrial+function%2C+interacts+with+the+PINK1-Parkin+complex+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).</li>
<li>Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless+forms+dynamic%2C+insulin-responsive+bliss+particles+sensitive+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress.</a> Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).</li>
<li>Sen, A., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless+is+a+conserved+ribonucleoprotein+that+binds+the+ribosome+at+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane.</a> Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+egg+chambers+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila egg chambers for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402(2010).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Mitochondrial+Structure+and+Function+in+Drosophila+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54989(2017).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).</li>
<li>Wang, S., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+for+bcd+mRNA+localization+from+spatial+distribution+of+exu+protein+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis.</a> Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה יכול להיות תוספת שימושית כפקד עבור חפצים עקב ניתוח השחלות ודגרת רקמות עבור כל ניסוי הדמיה חיה. השלבים הקריטיים דומים לאלה שנמצאו עבור פרוטוקולי הדמיה חיים אחרים. ללמוד כיצד לנתח שחלות Drosophila שלמות לוקח בפועל; עם זאת, מיומנות זו בדרך כלל ניתן ללמוד די מהר עם כלי הניתוח המתאימים. קשה יותר לשלוט הוא הסרת השריר עוטף את השחלות וכל ovariole13. יש לעשות זאת כדי להבטיח שהתכווצויות שרירים לא יפריעו לרכישת התמונה. אם באמצעות מחטי טונגסטן מחודד לעשות זאת אינו מוכיח מוצלח, germarium בקצה ovariole ניתן לתפוס עם מלקחיים ovariole משך מן נדן השריר. עם זאת, טכניקה זו היא בעייתית אם השלבים ההתפתחותיים המוקדמים ביותר ייבחנו כי הם יכולים להיפגע. צעד מפתח נוסף הוא לא לעקור את ovarioles נח על החלק התחתון של המנה בעת הוספת H2O2. היבט חשוב נוסף משותף לכל ההדמיה החיה: על החוקר לוודא שמבנה העניין מתויג היטב לפני הטיפול. המנות המשמשות כאן(שולחן החומרים)משמשות בדרך כלל להדמיה חיה; עם זאת, כל מנה או שקופית עם כיסוי זכוכית בתחתית או אפילו כיסוי זכוכית גדול צריך לעבוד כל עוד טיפת המדיה יכולה להיות מכוסה כדי למנוע אידוי מדיה. בעוד אנו משתמשים במיקרוסקופ מסוים, כל מיקרוסקופ הפוך עם מטרה של הגדלה מספקת כדי לראות את המבנה התת-תאי המדובר ומצלמה מחוברת בעלת רזולוציה מספקת וקצב לכידת תמונה אמורים לעבוד.
בעוד המעבדה שלנו מתעניינת בעיקר בתפקוד המיטוכונדריאלי, שיטה זו יכולה להיות מועילה בבחינת הדינמיקה והלוקליזציה של כל מבנה תת תאי או organelle, כגון הגרעין, ציטוסקלטון או רשתית אנדופלזמית. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות. על מנת להוסיף מי חמצן, הרקמה חייבת להיות במדיה מימית. שיטה חלופית להדמיה חיה היא להשתמש בשמן halocarbon, אשר סייע בתיאור תהליכים חשובים רבים ב Drosophila ovarioles כולל הדוגמה הראשונה של תנועה דינמית של GFP באורגניזם מודל7,14. בנוסף, הוספת מי חמצן לתקשורת גורמת לנזק חמצוני רחב אשר עשוי להיות עלבון כללי מדי לרקמה כדי להיות אינפורמטיבי עבור תהליך הסלולר של עניין, במיוחד עבור ניסויים ארוכים יותר בוחן פיתוח. למרות שזה לא יכול להיות ריאלי לבצע ניסויים הדורשים לדמיין את התא על פני תקופות זמן ארוכות בשל זה נזק חמצוני מהיר, נרחב, וסביר להניח בלתי הפיך, ראינו כי טיפול מי חמצן חריף שתיארנו ישים ברוב שלבי oogenesis כפי שאנו מסוגלים לראות את אותן השפעות ברוב השלבים בתוך תקופת זמן ההדמיה. בהתחשב בעלות ובקלות הנמוכה של הפרוטוקול, זה עשוי להיות שליטה שימושית לנזק והוא יכול לשמש כטיפול לפני קיבעון ותיוג נוגדנים גם כן.
בידיים שלנו, טיפול H2O2 מחקה את השינויים ב mislocalization המיטוכונדריה ופיזור חלקיקי אושר Clu שאנו רואים מוטציות Drosophila שונים. זה גם מחקה תוצאות שאנו רואים עבור חוקרים חדשים בטכניקות ניתוח למידה במעבדה. לכן, שיטה זו חשפה בבירור כי הכנת מדגם ומתח תאי כללי יכול להוביל לשינויים בלתי צפויים ובלתי מוסברים בעבר mislocalization המיטוכונדריה ואת נוכחותם של חלקיקי אושר. הזזת טכניקה זו קדימה, ריכוזי מי חמצן יכול להיות מווסת באמצעות ריכוז גבוה או נמוך יותר. אם אפקט תאי נראה באמצעות ריכוז נמוך יותר, ייתכן כי פנוטיפ הלחץ עשוי להיות הפיך על ידי החלפת המדיה ב- Complete Schneider's. גורמי לחץ שונים של תאים כגון קרבוניל ציאניד m-כלורופניל הידראזון (CCCP), ארסניט או הלם חום פשוט עשויים להיות שימושיים ללחץ תאי כללי עבור מבנים תת-תאיים אחרים. מאז הדמיה חיה של רקמות ex vivo דורש מניפולציה ידנית דגירה במדיה שונה, שליטה זו צריכה להיות תוספת שימושית כדי להבטיח כל תצפיות קרובים לפיזיולוגיה נורמלית ככל האפשר.

גורמי לחץ תאיים שונים רבים עשויים להתעורר במהלך התרבות הניסיונית ומניפולציה של רקמות ex vivo, כולל הלם חום, מתח חמצוני, מתח אוסמוטי, מתח תזונתי, ותנאי רעילות. הדמיה חיה היא כלי רב עוצמה המשמש לדמיין שינויים בזמן אמת ברקמות ex vivo לאחר טיפול ניסיוני ומניפולציה. ניתוחי רקמות עדינים ומניפולציה דורשים תרגול, וכמות הזמן מניתוח להדמיה יכולה להשתנות בהתאם לניסיון. הרציונל לפיתוח שיטה זו מבוסס על החשש כי הכנת רקמה להדמיה חיה עלולה לגרום ללחץ תאי במהלך ניתוח והכנת הדמיה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד עבור תהליכים רגישים לשינויים בחילוף החומרים הסלולר ורמות החמצן הזמינות, כגון תפקוד המיטוכונדריה. בעוד שיש מדגם סוג פראי מקביל הוא שליטה חשובה, עדיין קיימת האפשרות כי חלק או כל השינויים שנצפו במבנים תת תאיים יכול להיות בגלל נזק או מתח התא מניתוק ואינם משקפים פיזיולוגיה נורמלית או טיפול או מוטציה הנחקרים.
כדי לטפל בבעיה פוטנציאלית זו, אנו משתמשים בתוספת מי חמצן במהלך הדמיה חיה על מנת לגרום נזק חמצוני הסלולר1. מטרת שיטה זו היא לגרום נזק לרקמות על מנת לפקח על ההשפעה על מבנים תת תאיים. פרוטוקול זה שימושי לשתי מטרות: 1) הקובע אם שינויים בלוקליזציה תת-תאית של מבנה העניין נובעים מהלחץ שנגרם על ידי ניתוח לא מנוסה ו -2) ברגע שהמתו החוקר בטוח בטכניקות הניתוח המתוארות כדי לפקח על השפעת הלחץ המבוקר על מבנה העניין. כאן אנו מראים שתי דוגמאות של איך נזק חמצוני מוגבר גורם לשינויים בשני מבנים תת תאיים, מיטוכונדריה וחלקיקי אושר קלו. כדי לעשות זאת, אנו משתמשים בשחלת דרוזופילה שהיא מודל נפוץ למחקרי הדמיה חיה. הדוגמה הראשונה בוחנת לוקליזציה מיטוכונדרית. מניסיוננו, לוקליזציה מיטוכונדרית נורמלית בתאי נבט נקבה רגישה מאוד להפרעות ויכולה לשמש כמבשרת של מתח תאי. המיטוכונדריה בתאי הנבט הנשיים של דרוזופילה מפוזרים בדרך כלל באופן שווה לאורך הציטופלסמה2. תוספת מי חמצן גורמת אברונים במהירות mislocalize ו cluster באופן דומה מוטציות שונות3,4,5. הדוגמה השנייה היא חלקיקי אושר שנוצרו על ידי Clueless (קלו). קלו הוא ריבונוקלאופרוטאין מפוזר לאורך הציטופלסמה; עם זאת, הוא גם יוצר חלקיקים הקשורים המיטוכונדריה בתנאים תאיים אופטימליים5. מכיוון שנוכחותם של חלקיקי קלו תלויה בתנאים תאיים בריאים, כינו אותם חלקיקי "אושר"3,5,6. תוספת של מי חמצן גורמת לחלקיקים אלה להתפזר במהירות ולהיות הומוגניים בציטופלסמה5. במהלך המחקרים שלנו, ראינו שינויים בלוקליזציה של שני מבנים תת-תאיים אלה, אך רק לאחר ביצוע מחקרי הדמיה חיים נוכל להעריך באופן מלא את ההשפעה של מתח תאי ונזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של חלקיקי מיטוכונדריה ואושר.
התועלת של פרוטוקול זה כתוספת לשיטות שכבר הוקמו או חלופיות תלויה במספר גורמים. ראשית, פרוטוקול ההדמיה חייב להיות נוח לתוספת סמים. אם המדגם מותקן תחת כריכה ובשמן הלוקרבון, שיטה זו לא תהיה אפשרית7. H2O 2 תוספתגורמת לעלייה מהירה בנזק חמצוני, ולכן, ציר זמן זה לא יכול להיות מתאים. נזק חמצוני עשוי להיחשב פרוקסי עבור היפוקסיה; עם זאת, זה עשוי להיות קשה מדי או כללי מדי לתפקד כפקד מתאים לנזק עבור רכיבים תת תאיים מסוימים. לבסוף, עבור ניסויי הדמיה שנמשכים שעות כגון אלה הבאיםתהליךהתפתחותי, תוספת H 2 O2 עשוי להיות חזק מדי (למשל8). בדיקת עקומת ריכוז עשויה להתגבר על מגבלה זו.

<table><tbody><tr><td>שמרים יבשים פעילים</td><td>Red Star&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גז CO2 99.9</td><td></td><td></td><td>% טוהר</td></tr><tr><td>CO2 כרית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח, Nikon SMZ645 דגם</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטי חיתוך - מחטי PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305165</td><td>B-D 21G1</td></tr><tr><td>מחטי חיתוך - מזרקי PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>309657</td><td>קצה Luer-Lok, גודל 3 מ"ל</td></tr><tr><td>מחטי חיתוך - חוט טונגסטן</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>73800</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים (2 זוגות)</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11251-10</td><td></td></tr><tr><td>NI-150 תאורה בעוצמה גבוהה</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי של Gibco, Fisher Scientific מומת בחום</td><td></td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Schneider's Drosophila Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן, 30% (w/w) ב-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>דיסק מסתובב מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td></td><td>ניתן להשתמש גם בטווחים מקבילים</td></tr><tr><td>לונזה ביו-ויטאקר אנטיביוטיקה: תערובות פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>MatTek Corporation כלי תחתית זכוכית, 35 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>NC9344527 מיקרופיפטות וקצות בגודל מתאים</td> צינורות <td>מיקרוצנטריפוגה של אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1.7 מ"ל</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>טטרמתילרודמין, אתיל אסתר, פרכלורט (TMRE)</td><td>AnaSpec</td><td>AS-88061</td><td></td></tr><tr><td>w[1118]</td><td>מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה</td><td>5905</td><td>זבובים מסוג בר</td></tr><tr><td>y w; clu[CA06604]</td><td></td><td>זמין על פי בקשה.</td><td>Clu::GFP מלכודת זבובים</td></tr></tbody></table>

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה drosophila באמצעות הדמיה חיה

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

הדמיה חיה של שחלות Drosophila melanogaster סייעה בהבנת מגוון תהליכים תאיים בסיסיים במהלך הפיתוח, כולל תנועת חלקיקי ריבונוקלאופרוטאין, לוקליזציה של mRNA, תנועת ארגון ודינמיקה ציטוסלטלית. קיימות מספר שיטות להדמיה חיה שפותחו. בשל העובדה כי כל שיטה כרוכה בניתוח ovarioles בודדים להציב מדיה או שמן halocarbon, נזק הסלולר עקב היפוקסיה ו / או מניפולציה פיזית בהכרח יתרחש לאורך זמן. השפעה אחת במורד הזרם של היפוקסיה היא להגדיל את הנזק החמצוני בתאים. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בהדמיה חיה כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלות Drosophila לאחר אינדוקציה של נזק תאי מבוקר. כאן, אנו משתמשים במי חמצן כדי לגרום נזק חמצוני הסלולר ולתת דוגמאות של ההשפעות של נזק כזה על שני מבנים תת תאיים, מיטוכונדריה ו Clu bliss חלקיקים. עם זאת, שיטה זו ישימה לכל מבנה תת-תאי. המגבלות הן כי מי חמצן ניתן להוסיף רק למדיה מימית ולא יעבוד עבור הדמיה המשתמשת בשמן halocarbon. היתרונות הם כי מי חמצן זמין וזול, פועל במהירות, הריכוזים שלה ניתן לווסת, נזק חמצוני הוא קירוב טוב של נזק שנגרם על ידי היפוקסיה, כמו גם נזק כללי לרקמות עקב מניפולציה.

הפרוטוקולים המתוארים יכולים לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של מי חמצן במהלך הדמיה חיה של שחלות Drosophila. כפי שמוצג באיור 3, איור 4, וידאו 3 ווידאו 4, הליך זה מספק אמצעי יעיל להמחשה של שינויים ברקמות ודינמיקה לאחר טיפול ניסיוני בזמן אמת. חשוב לציין, פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תוספת של H2O2 כדי ovarioles בעת הדמיה; עם זאת, זה עשוי להיות מותאם עבור תוספת אקסוגני של תרופות אחרות או ריאגנטים של עניין. בנוסף, זקיקים עשויים להיות מסומנים עם כל צבעים פלואורסצנטיים של עניין (למשל, tetramethylrhodamine (TMRE), LysoTracker) לפני ההדמיה (וידאו 3). השלבים הקריטיים ביותר להשגת תוצאות הדמיה ברורות הם 1) הניתוח והבידוד הנכונים של אובריולים בודדים עם כל האלמנטים המתכווצים שהוסרו(איור 1 ואיור 2) ו-2)המהירות שבה ההדמיה מופעלת מחדש לאחר תוספת מי חמצן. וידאו 4 הוא איור של זקיק מנותח כראוי שנשאר יציב לאורך כל משך ההדמיה בהשוואה לסרטון 1, הממחיש זקיק מנותח בצורה גרועה היוצא משדה הראייה במהלך ההדמיה. וידאו 5 הוא איור שבו ההשפעות H2O2 על המיטוכונדריה שכותרתו TMRE כבר התקדמו לפני תחילת ההדמיה כתוצאה של זמן חולף מדי. בהשוואה וידאו 3 שבו ההדמיה הופעלה מחדש מיד לאחר תוספת מי חמצן (זמן 0) ושלמים, מיטוכונדריה מפוזרת עדיין גלויים, המיטוכונדריה בווידאו 5 כבר החלו להתקבץ באופן ניכר ולאבד את פוטנציאל הממברנה שלהם עם ההפעלה מחדש של ההדמיה. בעיה זו מיוחסת בעיקר שיבוש עמדות המדגם במהלך H2O2 תוספת וניתן להקל על ידי ביצוע הטכניקה כדי לשמור על מדיה הדמיה ומיקום מדגם שלם (וידאו 2). יש לציין, בניסויי בקרה שבוצעו ללא H2O2 הוסיף לתקשורת, המיטוכונדריה בזקיקים נשאר מפוזר כראוי, ואת צבע TMRE נשאר מבודד המיטוכונדריה.
<img alt="דיאגרמת אנטומיה של ביציות ותמונות מיקרוסקופ; מבנה השחלות ומעטפת השרירים מחקר מפורט." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: בידוד של אובריולים בודדים מהשחלות של דרוסופילה. (A) קריקטורה המציינת זוג שחלות, אובריולה אחת (חץ) עם הגרמריום בקצה (ראש חץ) ושני נדן השרירים המקיפים את האובריולה (חום, אפיתל) והשחלה (חום, הצפק). (ב)ניתח את השחלה דרוזופילה. (ג)הפרדה עוקבת של השחלה הקניט לתוך ovarioles בודדים (חץ). סרגל קנה מידה = 100 אום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="השוואת מורפולוגיה של תאי שמרים, תמונת מיקרוסקופ, שני לוחות, ניתוח תקינות דופן התא." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: הסרת סיבי עצב ואלמנטים מתכווצים מאובריול יחיד. (A) אובריולה אחת עם שרידים של רקמת עצב ומעטפת השרירים עדיין מחוברת (חץ). (B)הסרה עדינה של כל הרקמות הנותרות המחוברות לאובריולה ב- A (חץ). סרגל קנה מידה = 100 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig02large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
<img alt="השפעת מי חמצן על הרקמה לאורך זמן; סדרת תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ניתוח תגובה חמצונית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: H2O2 גורם לאי-לוקליזציה מיטוכונדרית. (A-A") תמונות סטילס של cluCA06604 (Clu::GFP זבובים) זקיק. תוספת של H2O2 גורמת למיטוכונדריה להתקבץ לאורך זמן ההדמיה. תיוג TMRE של המיטוכונדריה מציין כי המיטוכונדריה מפוזרים בתחילה בזמן 0 (A), וכי המיטוכונדריה מתחילים להתקבץ לאחר H2O2 תוספת (A′) בנקודת זמן מאוחרת יותר, תיוג TMRE הופך ספוט עקב המיטוכונדריה לאבד את פוטנציאל הממברנה שלהם ולכן היכולת שלהם לבודד את הצבע (A"). לבן = TMRE(A-A").). סרגלי קנה מידה: 10 מיקרומטר ב (A) עבור A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="מיקרוסקופ זמן-lapse של תאים עם טיפול ב-H2O2 המראה מתח חמצוני במשך 10 דקות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: H2O2 מפזר את קלו. (A-A") תמונות סטילס של זקיק קלוCA06604 מוזן היטב. תוספת של H2O2 גורמת לחלקיקים להתפזר ולהיות הומוגניים בציטופלסמה לאורך זמן ההדמיה. לבן = Clu::GFP (A-A"). סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר ב (A) עבור A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: זקיק מנקבת קלו CA06604. כפי שמתואר באיור 2, כישלון בהסרת סיבי עצב אלמנטים מתכווצים מאובריול יחיד יגרום לסחף ותנועה מסומנים של האובריולס במהלך ההדמיה וחוסר היכולת לנתח נתוני הדמיה. לבן = קלו::GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%201%20-%20Failure%20to%20remove%20contractile%20elements.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
וידאו 2: תוספת נכונה של H2O2 לדגום צלחת. מי חמצן יש להוסיף את צלחת המדגם באמצעות micropipette בגודל מתאים. מחלק H2O2 מבלי לשבור את משטח התקשורת. טיפול נלקח כדי למנוע שבירת פני השטח של מדיית ההדמיה כדי למזער את ה דגימת להיסחף במהלך תוספת מי חמצן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%202%20-%20Proper%20Addition%20of%20H2O2%20to%20Sample%20Dish.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
וידאו 3: H2O2 תוספת במהלך הדמיה של זקיקים שכותרתו TMRE. זקיק מנקבה קלוCA06604 מוכתמת ב- TMRE. H2O2 גורם אי-תיאום מיטוכונדריאלי זקיקי דרוזופילה. לבן = צבע TMRE. תמונה מסגרת אחת לכל 15 שניות במשך 20 דקות, והסרטון הוא 10 מסגרות לשנייה5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%203%20-%20H2O2%20stresses%20mitochondria.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
וידאו 4: H2O2 תוספת במהלך הדמיה של Clu::זקיקים GFP. זקיק מנקבת קלו CA06604. H2O2 מפזר חלקיקי קלו כמתואר באיור 4. לבן = קלו::GFP. תמונה מסגרת אחת לכל 15 שניות במשך 15 דקות, והסרטון הוא 10 מסגרות לשנייה. 5<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%204%20-%20H2O2%20disperses%20particles.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a> 
וידאו 5: הדמיה מושהית לאחר תוספת H2O2. זקיק מנקבת קלו CA06604. תוספת של מי חמצן לזקיקים היא טיפול רגיש לזמן. ההפעלה מחדש של ההדמיה התעכבה בסרטון זה כתוצאה מהעתקת מדגם במהלך תוספת H2O2. המיטוכונדריה כבר החלה להתקבץ באופן ניכר ולאבד את פוטנציאל הממברנה שלהם עם הפעלה מחדש של ההדמיה בזמן 0 (לעומת זמן 0 בסרטון 3). אי חידוש ההדמיה במהירות לאחר הטיפול יגרום לתוצאות לא מדויקות ובלתי שמיש שכן ההשפעות הניסיוניות המוקדמות יחסרו לפני ההדמיה. לבן = TMRE. תמונה מסגרת אחת לכל 15 שניות במשך 20 דקות, והסרטון הוא 10 מסגרות לשנייה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%205%20-%20Delayed%20imaging%20after%20H2O2%20addition.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בהדמיה חיה כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלות Drosophila.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

המעבדה שלנו משתמשת במלנוגאסטר Drosophila כדי לזהות ולאפיין גנים ומסלולים המווסתים את תפקוד המיטוכונדריה במהלך התפתחות והומאוסטזיס פיזיולוגי. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בהדמיה חיה עם תוספת של מי חמצן כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלת Drosophila הבוגרת. לעתים קרובות אנו משתמשים בפרוטוקולי הדמיה כדי לחקור כיצד מוטציות משנות לוקליזציה מיטוכונדרית תקינה ותנועה בתאי נבט נקבה.במהלך המחקרים שלנו מצאנו כי מתח הציג על ידי ניתוח או לחצים אחרים התא היתה השפעה עמוקה על לוקליזציה מיטוכונדריאלי. כבקרה כדי לזהות אם מתח כללי, בניגוד לטיפול ניסיוני, הוא הגורם לשינויים בלוקליזציה או בהתנהגות של מבנים תת-תאיים. פיתחנו פרוטוקול זה כדי להציג מתח שליטה באמצעות מי חמצן.בסרטון זה, אנו נדגים כיצד מי חמצן המושרה נזק חמצוני משנה את ההפצה של המיטוכונדריה ואת ריבונוקלאופרוטאין Clu. אמצעי התקשורת המתאימים ביותר לטכניקת הדמיה חיה זו הכילו את מדיית דרוזופילה של שניידר שהכילה 15% סרום שור עוברי מומת בחום, 0.6 X Pen-Strep ו-200 מיקרוגרם לאינסולין שור מיקרוליטר, להלן מדיה שלמה של שניידר. ביצוע ההכנה התקשורתית בתנאים סטריליים יבטיח שהיא לא תזוהם.מערבבים היטב את התכולה ומאחסנים לילה בארבע מעלות. האינסולין אינו מתמוסס לחלוטין במדיה המלאה של שניידר ותבחינו במשקע המתיישב בתחתית הצינור. הפוך aliquots, להיות בטוח לעזוב את המשקעים כפי שהוא יפריע הדמיה.פתרון זה עשוי לשמש במשך חודש אחד אם מאוחסן aliquots בארבע מעלות. להדמיה אופטימלית של תאי נבט נשיים, הכינו תחילה בקבוקון המכיל טיפה של משחת שמרים רטובה שהיא עקביות של חמאת בוטנים. זה מבטיח שהנקבות מוזנות היטב וייצרו את כל שלבי התפתחות הזקיק להדמיה.עבור זבובים בריאים בצורה אופטימלית, לאסוף אפס עד יום אחד נקבות ישנות ולהעביר עם זכרים לתוך בקבוקון מזון זבוב המכיל הדבק שמרים רטובים. ודא זבובים ישנים לא ליצור קשר עם הדבק שמרים כפי שהם יכולים לדבוק בו. להאכיל את הזבובים שלושה עד שבעה ימים, שינוי הדבק שמרים מדי יום.ודא הדבק שמרים קשר עם מזון לטוס, כך שזה לא להתייבש. כדי לגרום נזק חמצוני, נשתמש בתמיסת מלאי של 30% מי חמצן כדי לדמיין מיטוכונדריה, נשתמש בתמיסת מלאי של 100 מילימולאר TMRE. חשוב להכין את פתרונות המדיה טריים כי מי חמצן רגישים חמצון TMRE משפיל לאורך זמן.רגע לפני הניתוח, במדיה המלאה של שניידר, הכינו אליגוט טרי של שני מי חמצן מיקרומולאריים, אליגוט טרי של 46 ננומולאר TMRE, ו aliquot טרי של 46 ננומולאר TMRE בתוספת שני מי חמצן מיקרומולארי. לניתוח השחלות תצטרך שני זוגות של מלקחיים עדינים וזוג מחטי טונגסטן מחודדות אלקטרוליטיות. כדי לנתח את השחלות למלא שעון עם מדיה מלאה של שניידר כי כבר מחומם לטמפרטורת החדר, ואז למקם זבוב אחד בתקשורת באמצעות מלקחיים.בעדינות לתפוס את הזבוב על ידי בית החזה באמצעות זוג אחד של מלקחיים עדינים. עם מלקחיים אחרים, לתפוס את האחורי בעדינות למשוך כדי להסיר את השחלות. הסר כל קוטיקולה או רקמה חוץ גופית, ולאחר מכן להעביר את השחלה לבאר חדשה המכילה מדיה טרייה.השחלות עדיין צריכות לנוע ממעטפת השרירים שמסביב. באמצעות מחטי טונגסטן מחודד, בעדינות להקניט לגזרים את ovarioles, מקפיד להסיר את נדן השריר שמסביב. אם נדן השריר לא יוסר, כפי שהוכח כאן, אובריה יהיה עווית, גרימת בעיות עם רכישת תמונה.לאחר ovarioles נותחו בצורה נקייה, להעביר אותם טיפה 100 מיקרוליטר של מדיה לצלחת MatTek אם לדמיין מבנים מסומנים אנדוגני. העבר את ovarioles בירידה 100 מיקרוליטר של מדיה TMRE לצלחת MatTek אם לדמיין מיטוכונדריה שכותרתו TMRE. ה"אובריולס" ישקעו לתחתית הטיפה.חשוב לתרגל ניתוחים על מנת להתחיל לדמיין את הרקמה מהר ככל האפשר. לאחר ovarioles מותקן, מניחים את המנה על מיקרוסקופ הפוך לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים כתיעוד של תנאי טיפול מקדים. ברגע שזה נעשה, להשהות את ההדמיה החיה, להסיר את המכסה, בזהירות להוסיף 100 microliters של שני פתרון מי חמצן מיקרומולאר מוכן.הימנע לשבור את פני השטח של טיפת התקשורת הקיימת או להוסיף את הפתרון מהר מדי, כדי לא לעקור את ovarioles נח על החלק התחתון. החלף את כיסוי המנה, העבר ומקד מחדש את ovariole הרצוי, ולחדש את ההדמיה. יש להקפיד לחדש את ההדמיה במהירות האפשרית, שכן הטיפול הניסיוני רגיש לזמן.מוצגים כאן תמונות סטילס מסרט, שצולמו לאחר טיפול מי חמצן. המיטוכונדריה ותאי הנבט הנשי מפוזרים לאורך הציטופלסמה כאשר הזבובים מוזנים היטב ובריאים. לאחר תוספת מי חמצן, הנזק החמצוני גורם מיטוכונדריה כדי clump, אשר ניתן לראות מהר כמו 10 דקות לאחר הטיפול.לאחר 20 דקות, הנזק גורם לפוטנציאל הקרום המיטוכונדריאלי להתפוגג. לכן, רוב המיטוכונדריה לדעוך. בסרט חי זה של התהליך, המיטוכונדריה ניתן לראות במהירות גושים ואת רוב המיטוכונדריה בסופו של דבר לדעוך.המצמוץ הפועם בציטופלסמה, במיוחד בתאי הזקיק שמסביב, נראה אופייני לתוספת TMRE. כפי שהוזכר קודם לכן, ההדמיה חייבת להתבצע במהירות לאחר תוספת מי חמצן. כפי שמוצג כאן, אם חלף זמן רב מדי, פוטנציאל הקרום המיטוכונדריאלי כבר אבד ותיוג TMRE מתפוגג, מה שהופך את הנתונים לבלתי ניתנים לפרשנות.בתמונות סטילס אלה וידאו, GFP שכותרתו אנדוגני חלקיקי Clu הם חזקים ושופע ב germplasm של נקבות ניזון היטב. לאחר תוספת מי חמצן, חלקיקי קלו להתפזר בתוך 10 דקות. זה בא לידי ביטוי בסרטון הנלווה.לאחר תוספת מי חמצן, חלקיקי אושר Clu להתפזר במהירות. מצאנו פרוטוקול זה להיות כלי שימושי כדי להבטיח הדמיה מדויקת של לוקליזציה מסוג פראי של חלקיקי מיטוכונדריה ואושר קלו בתאי נבט נקבה Drosophila. פרוטוקול זה צריך להיות ישים עבור מגוון רחב של מחקרי הדמיה חיה והוא יכול לשמש לטיפול ברקמות לפני הקיבעון גם כן.הצעדים החשובים ביותר הם לבודד ovarioles ללא נדן השריר, להוסיף בעדינות את מי חמצן, כדי לא לעקור את ovarioles, כדי תמונה במהירות לאחר תוספת מי חמצן. אנו מקווים שתמצאו את זה שליטה שימושית עבור הדמיה חיה מגוון רחב של מבנים תת תאיים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

visualizing-effects-oxidative-damage-on-drosophila-egg-chambers-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Anastasis הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לזהות ויוו כי התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים יכולים להראות מורפולוגית תאים בריאים נורמלי. כאן נתאר פרוטוקולים עבור זיהוי ומעקב אחר תאים עוברים anastasis בבעלי חיים באמצעות פיתח ויוו CaspaseTracker ביוסנסור המערכת שלנו.

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בשחלות דרוזופילה חיות וקבועות מתוארות ומודגמות במאמר זה.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה ידידותית למשתמש המבוססת על פיג'י, יחד עם הוראות ברורות המסבירות כיצד לנתח באופן אמין את התנהגות actomyosin בתאים בודדים ורקמות אפיתל מעוקל. כישורי תיכנות אינם נדרשים לבצע את הלימוד; כל השלבים מתבצעים באופן חצי אינטראקטיבי באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של פיג'י ותוספים משויכים.

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

חקור את השפעות הנזק החמצוני על מיטוכונדריה וחלקיקי Clu בתאי ביצה של Drosophila melanogaster באמצעות הדמיה חיה. פרוטוקול זה מספק בקרה להבחנה בין מתח תאי כללי לטיפולים ניסיוניים ספציפיים.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

גלה סרטונים נוספים