Name: ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למד פרוטוקול לניתוק תאים בודדים באיכות גבוהה מאפיתל ומזנכימה של לשון עכברים. השיטה מייצרת תאים בריאים לריצוף RNA ותרביות אורגנואידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק R01DC012308 ו R21DC018089 ל- HXL. אנו מודים לברט מרשל (אוניברסיטת ג'ורג'יה, אתונה, GA) ואגון רנגיני (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) על סיוע טכני וייעוץ לגבי ניתוק התא; כדי פרנסיסקו גיבסון ברנלי (אוניברסיטת ג'ורג'יה, אתונה, GA) לעריכה אנגלית.

שימוש בבעלי חיים (עכברי C57BL/6 לאורך כל המחקר) אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ורג'יה והיה בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים למחקר.
1. שימוש בבעלי חיים
הערה: עכברים גודלו ומתוחזקים במתקן בעלי החיים של המחלקה למדעי בעלי חיים ומוצרי חלב באוניברסיטת ג'ורג'יה ב 22 °C (70 °F) תחת 12 שעות יום / לילה מחזורים.
<ol><li>לייעד את הצהריים של היום של זיהוי תקע הנרתיק בעכברים כמו עוברי (E) יום 0.5. השתמש בעוברים ב- E12.5 ובעכברים לאחר לידה בגיל 8 שבועות לניסויים הבאים.</li>
</ol>2. הכנה לפני הניסוי
הערה: המכשירים הדרושים לפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.
<ol><li>מכשירי אוטוקלאב לפני הניסוי. לעקר מכשירים באמצעות מעקר חרוזים במהלך הניסוי.</li>
	<li>נקו את האזור הכירורגי, את המיקרוסקופ הנותח ואת ארון האבטחה הביולוגית באמצעות מגבוני אתנול 70%. הפעל את אור UV של ארון biosafety ולשמור אותו על במשך 20 דקות לפני ההליך הניסיוני.</li>
	<li>הכן תערובת אנזימים של 1:1 dispase (5.0 מ"ג / מ"ל) וקולאזנאז (2.0 מ"ג / מ"ל) לריכוז סופי של 2.5 ו 1.0 מ"ג / מ"ל בהתאמה, ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר7.<ol>
<li>הכן 1 מ"ל של תערובת אנזימים ללשון בוגרת או 0.5 מ"ל לאזור מסוים של הלשון (למשל, לשון אחורית או לשון 100 מטר).</li>
		<li>מכינים 2 מ"ל של תערובת אנזימים לשונות עובריות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפוך 10 מ"ל של 2.5% BSA ב 0.1 M PBS ולסנן את הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל ו 0.22 מיקרומטר מזרק מסנן.</li>
	<li>הפוך 500 μL של 5% FBS ב DMEM / F12.</li>
	<li>הפוך 3 מ"ל של DMEM / F12 המכיל 10% FBS ו 1% BSA ולסנן את הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל ו 0.22 מיקרומטר מזרק מסנן.</li>
</ol>3. הפרדת אפיתל הלשון מרקמת החיבור mesenchyme/הבסיסית
<ol><li>הפרדת האפיתל מהמזנצ'ימה של לשון עכבר E12.5<ol>
<li>המתת חסד מתוזמן עכברים נקבה בהריון נושאת E12.5 עוברים על ידי הצבת אותו בתא CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. הערה: עוברי עכבר ב E12.5 נאספים לאחר 12:00 (אחר הצהריים) ביום ה -12 לאחר גילוי של תקע הנרתיק בעכברים הנשיים בהריון.</li>
		<li>העבר עכברים לאזור הכירורגי. הרטב את בטן העכבר באמצעות 70% אתנול כדי למנוע פרווה מלהיכנס לאתר ההפעלה.</li>
		<li>פתח את הבטן באמצעות מספריים מנתחים כדי לחשוף את קרני הרחם הנושאות עוברים. לנתח את קרני הרחם באמצעות מספריים מנתחים ולהעביר אותו 15 מ"ל של הפתרון של Tyrode טרי בצלחת תרבות 100 מ"מ.</li>
		<li>לנתח את העוברים (איור 1A1) מקרני הרחם תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מספריים מיני מלקחיים עדינים.</li>
		<li>פתחו בזהירות את חלל הפה לרווחה באמצעות מלקחיים עדינים ונתחו את הלשון מהלסת התחתונה באמצעות מספריים קטנים(איור 1A2).</li>
		<li>לשטוף את הלשונות באמצעות 15 מ"ל של פתרון טרי סטרילי Tyrode בצלחת תרבות 100 מ"מ.</li>
		<li>מעבירים את הרקמות ל-2 מ"ל של תערובת אנזימים של פירוק (2.5 מ"ג/מ"ל) וקולאזנאז (1.0 מ"ג/מ"ל) בצלחת תרבות של 35 מ"מ עם מרית ומלקחיים עדינים בארון ביו-רוויה. דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>מעבירים את הלשונות ל-15 מ"ל של פתרון Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות של 100 מ"מ ומסירים בעדינות את המזנצ'ימה מהאפיתל מהצד הגחוני באמצעות מלקחיים עדינים. הערה: יריעות אפיתל ניתן להפריד ללא כוח מכני במהלך הדגירה.</li>
		<li>שטפו את האפיתליה המופרדת ואת mesenchyme פעמיים ב 15 מ"ל של פתרון Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות 100 מ"מ. הערה: הפעילויות של dispase ו קולגנאז יהיה מעוכב על ידי EDTA בהליך ניתוק התא (שלב 4.1).</li>
	</ol></li>
	<li>הפרדת אפיתל הלשון מרקמת החיבור הבסיסית של עכברים בוגרים<ol>
<li>המתת עכבר בגיל 8 שבועות על ידי הצבתו בתא CO2. ודא שהעכבר מורדם ללא נשימות ותגובת צביטה מראש.</li>
		<li>העבר את העכברים לאזור הכירורגי. הרטב את ראש העכבר באמצעות 70% אתנול כדי למנוע פרווה מלהיכנס לחלל הפה.</li>
		<li>חותכים את פינות הפה לאורך הלחי באמצעות מספריים מנתחים כדי לפתוח את חלל הפה. לנתח את הלשון עם הלסת התחתונה (איור 1B1) ומניחים אותה בצלחת פלסטיק עם שכבה של ניילון נצמד.</li>
		<li>באמצעות מלקחיים כירורגיים כדי להחזיק את הלשון תחת מיקרוסקופ מנתח, להזריק את תערובת האנזים של dispase (2.5 מ"ג / מ"ל) וקולאזנאז (1.0 מ"ג / מ"ל) בחלל תת אפיתל של הלשון דרך חוד החנית (איור 1B1, חצים) של הלשון האחורית.<ol>
<li>להזריק 1 מ"ל של תערובת אנזימים באופן שווה לכל הלשון לאיסוף רקמות הן מהלשון הצדדית והן מהלשון האחורית.</li>
			<li>להזריק 0.5 מ"ל של תערובת אנזימים מקומית ללשון הקדמונית לאיסוף רקמות מקצה הלשון או ללשון האחורית לאיסוף רקמת פפילה circumvallate. הערה: הלשון תתנפח ככל שהאנזים יצטבר (איור 1B2). הזרקה עדינה של האנזים יכולה למנוע לחץ מפגיעה באפיתל ולשמור כמה שיותר אנזים בלשון.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עוטפים את הלשון בניילון נצמד ומדגרים את הלשון במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>השתמש במספריים מיני כדי לנתח את קצה הלשון ו / או circumvallate papilla, ולהשתמש מרית מלקחיים עדינים להעביר רקמה ל 15 מ"ל של פתרון של Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות 100 מ"מ.</li>
		<li>הפרד את האפיתל מרקמת החיבור הבסיסית בחלל התת-אפיתל המתעכל באמצעות מספריים קטנים. לקצץ את הרקמות לגודל הנכון על פי הדרישה של ניסויים במורד הזרם.</li>
		<li>שטפו את האפיתל המופרד ואת רקמת החיבור הבסיסית פעמיים ב-15 מ"ל של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות של 100 מ"מ. הערה: הפעילויות של dispase ו קולגנאז יהיה מעוכב על ידי EDTA בהליך ניתוק התא (שלב 4.1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוק תאים
הערה: פרוטוקול ניתוק התא המתואר כאן יכול להיות מיושם על אפיתל הלשון ו mesenchyme / רקמת חיבור הן E12.5 עוברי ו 8 שבועות בן עכברים. כדי להפחית את אובדן התא במהלך עצבנות והעברת השעיית תאים, השתמש בטיפים מסחריים בעלי החזקה נמוכה של פיפטה או בטיפים מצופים מראש עם 2.5% BSA ב- 0.1 M PBS ב- pH 7.48.
<ol><li>מעבירים את הרקמות באמצעות מרית ומלקחיים עדינים ל-3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA בצלחת תרבות חדשה של 35 מ"מ למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בעדינות להתסיס רקמות כל 5 דקות עם טיפים פיפטה 1 מ"ל. הערה: אין לחתוך את קצה הפיפטה, שכן חוד החנית עלול לגרום נזק פיזי לתאים המנותקים.</li>
	<li>הוסף 500 μL של 5% FBS ב DMEM / F12 כדי לעצור את התגובה ולהעביר את המדיום לצינור צנטריפוגה מחייב נמוך 5 מ"ל.</li>
	<li>השעיית תא צנטריפוגה ב 200 x g במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>בעדינות להשעות מחדש תאים 3 מ"ל של DMEM / F12 המכיל 10% FBS ו 1% BSA באמצעות טיפים פיפטה 1 מ"ל ולסנן את התאים באמצעות מסננת תאים 70 מיקרומטר, ואחריו מסננת תאים 35 מיקרומטר.</li>
	<li>השעיית תא צנטריפוגה ב 200 x g במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את רוב המדיום ולהשאיר 50-300 μL כאמצעי האחסון הסופי כדי להשעות מחדש את התאים. הערה: התאם את ריכוז התאים בהתאם לדרישות הניסויים במורד הזרם על-ידי שינוי הנפח הסופי של השעיית תא יחיד.</li>
</ol>5. בדיקת ספירת תאים וכדאיות באמצעות המוציטרומטר
הערה: כדי לשפר את דיוק המדידה, מומלץ לבצע 3 משכפלים טכניים עבור כל דגימה.
<ol><li>מערבבים בעדינות 5-10 μL של המתלה תא יחיד עם נפח שווה של כחול Trypan ולהוסיף על המוציטרומטר. הערה: יש לנקות את המוציטרומטר ביסודיות באמצעות 70% אתנול לפני השימוש. חלקיקי אבק על המוציטרומטר יהיו מוכתמים בכחול כהה וישפיעו על הדיוק של בדיקת הכדאיות. בדוק את המוציטרומטר תחת מיקרוסקופ.</li>
	<li>ספור את מספר התא הכולל, את מספר התאים החיים (לבנים) ואת מספר התאים המתים (כחול כהה) המוכתמים בכחול Trypan(איור 2, חצים) בהתאמה ב- 4 ריבועים עם 16 רשתות (איור 2)באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מערכת דימות.</li>
	<li>חשב את ריכוז התא: ריכוז תאים = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq01v2.jpg"><ol>
<li>חשב את הכדאיות: כדאיות = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grada, A., Weinbrecht, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing%3A+methodology+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing: methodology and application.</a> The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).</li>
<li>Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+methodology+and+clinical+applications+of+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).</li>
<li>Schaum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%3A+The+Tabula+Muris+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Sukumaran, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+profiling+of+taste+bud+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome profiling of taste bud cells.</a> Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+labeling+in+whole+tongue+epithelial+sheet+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen-Ngoc%2C+K-V+%22Tissue+Morphogenesis%22">Tissue Morphogenesis</a>. , Springer. 135-162 (2015).</li>
<li>Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+mapping+of+taste+bud+cells+and+keratinocytes+in+the+mouse+tongue+and+soft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate.</a> Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).</li>
</ol>

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

עד כה, לא היה פרוטוקול מפורט זמין עבור ניתוק התא מאפיתל הלשון ואת המזנצ'ימה הבסיסית / רקמת חיבור. פרוטוקול ניתוק תאים נוכחי זה מספק הליך לשחזור כדי ליצור השעיית תא בודד עם כדאיות גבוהה של תאים (>90%) מרקמות לשון העכבר, כולל יריעות אפיתל ורקמות mesenchyme / חיבור בשלבים העובריים ולאחר הלידה למרות תאים מבודדים מ E12.5 ועכברים בוגרים שונים בגודלם. לדוגמה, תאים מבודדים מהאפיתל והמזנצ'ימה של לשונות העכבר E12.5 עקביים וקטנים בניגוד לשונות גדולה (מקטנה לגדולה) של תאים משפת עכבר בת 8 שבועות. עם היתרון של הכדאיות הגבוהה (>90%) של...

לשון היונקים היא איבר מורכב הקריטי לטעם, דיבור ועיבוד מזון. הוא מורכב מסוגים רבים של רקמות מאורגנות מאוד ממודר על ידי mesenchyme / רקמת חיבור מכוסה על ידי גיליון אפיתל מרובד המכיל פפיליה טעם בלוטות טעם. אוכלוסיות התאים הן באפיתל הלשון והן ברקמת mesenchyme/connective הן הטרוגניות. כדי להבין טוב יותר את הפונקציות ואת ההפצה של סוג מסוים של תאים בלשון, מחקרים באמצעות תאים מנותקים נחוצים. לדוגמה, רצף RNA של תא יחיד הוא שיטה רבת עוצמה ובעלת תפוקה גבוהה לפרופיל שעתוק בתאים בודדים, אשר נועדה להבין את התמלול של רקמה מורכבת ברזולוציה של תא יחיד1,2,3,4. תרבות התאים העיקרית הוכחה ככלי שימושי לחקר הפונקציה והבידול של תאי גזע / אב לבלוטות טעם5,6. מחקרים אלה דורשים כמות גדולה של אוכלוסיות תאים מבודדים באיכות גבוהה (למשל, מספר תאים כולל מספיק עם ריכוז תקין וכדאיות גבוהה).
לכן, יש צורך לבודד תאים מאזורים שונים של הרקמות הלשונית בשלבים התפתחותיים שונים. נכון לעכשיו, אין פרוטוקול מפורט זמין עבור ניתוק התא מאפיתל הלשון ואת הרקמה mesenchyme / חיבור הבסיסית. כאן, אנו מדווחים על שיטת ניתוק תאים ממוטבת כדי להכין תאים לניסויים הדורשים איכות גבוהה של תאים חיים כגון עבור רצף RNA של תא יחיד ותרביות תאי גזע ראשוניות. מצאנו כי מבחר של מאגר עיכול אנזימטי, pipetting עדין, מבחר של מדיום resuspension, זמן צנטריפוגה אופטימלי ומהירות חיוניים כדי ליצור כמויות גדולות אלה של תאים באיכות גבוהה.

<table><tbody><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>עכבר Gold Biotechnology</td><td>A-420-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 (C57BL/6J)</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז (קולגנאז A)</td>צלחת תרבית <td>10103586001</td><td></td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td></tr><tr><td>(קוטר 35 מ"מ)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103G</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית (קוטר 100 מ"מ)</td><td>Genesee מדעי</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>dispase (Dispase II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>מספריים</td> לניתוח 04942078001 <td></td></tr><tr><td>(מספריים עדינים לסטודנטים)</td><td>מצא כלי מדעי</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>מלקחיים</td> עדינים <td>C838U82</td><td></td>שיבוט</tr><tr><td>(Dumount #3 מלקחיים)</td><td>מצא כלי מדע</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך עם מערכת הדמיה (EVOS XL Core Cell Imaging System)</td> <td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה עם שמירה נמוכה</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014342</td><td></td></tr><tr><td>מיני מספריים (Evo Spring Scissors)</td><td>כלי מדע עדין</td><td>15800-01</td><td></td></tr><tr><td>עיוות פלסטיק</td><td>VWR</td><td>46610-056</td><td></td></tr><tr><td>מרית (כפית מוריה)</td><td>כלי מדע עדין</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים כירורגיים (Dumount #2 מלקחיים למינקטומיה)</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s תמיסה</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>T2145-10L</td><td>עשוי ממלחי טירוד</td></tr><tr><td>0.25% טיפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Hoefer</td><td>33946</td><td>עשוי מ-1 M PBS</td></tr><tr><td>0.22-&mu; מסנן מזרק m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>Koptec</td><td>233919</td><td>עשוי מ-100% אתנול</td></tr><tr><td>1-מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>8194938</td><td></td></tr><tr><td>5-mL צינור מיקרוצנטריפוגה מחייב נמוך</td><td>Eppendorf</td><td>30122348</td><td></td></tr><tr><td>30-G מחט</td><td>BD</td><td>9193532</td><td></td></tr><tr><td>35-&mu; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>64750</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu; מסננת תא m</td><td>Falcon</td><td>64752</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

דיסוציאציה של תאים הייתה הליך חיוני למחקרים ברמת התאים הבודדים ו/או ברמת אוכלוסיית התאים (למשל, רצף RNA של תא יחיד ותרבות תאים ראשונית). תשואת תאים בריאים ובת קיימא בכמויות גדולות היא קריטית, והתנאים האופטימליים לעשות זאת תלויים ברקמות. אוכלוסיות התאים באפיתל הלשון ורקמת החיבור הבסיסית הן הטרוגניות ומבני הרקמות משתנים באזורים שונים ובשלבים התפתחותיים שונים. בדקנו פרוטוקולים לבודד תאים מאפיתל לשון העכבר ורקמת mesenchyme / חיבור בשלבים ההתפתחותיים המוקדמים [יום עוברי 12.5 (E12.5)] ומבוגר צעיר (8 שבועות). הפרדה נקייה בין האפיתל לבין רקמת mesenchyme / חיבור הבסיסית היה קל להשיג. עם זאת, כדי להמשיך לעבד ולבודד תאים, מניב תאים בריאים קיימא בכמויות גדולות, ובחירה זהירה של מאגר עיכול אנזימטי, זמן הדגירה, ומהירות צנטריפוגה וזמן הם קריטיים. דגירה של אפיתל מופרד או רקמת mesenchyme / חיבור הבסיסית ב 0.25% טריפסין-EDTA במשך 30 דקות ב 37 °C (69 °F), ואחריו צנטריפוגה ב 200 x g במשך 8 דקות הביא תשואה גבוהה של תאים בשיעור כדאיות גבוהה (>90%) ללא קשר לשלבי העכבר ואזורי הלשון. יתר על כן, מצאנו כי הן אפיתל מנותק והן תאי רקמת mesenchymal / חיבור משפות עובריות ובוגרות יכול לשרוד במדיום מבוסס תרבות התא לפחות 3 שעות ללא ירידה משמעותית של הכדאיות התא. הפרוטוקולים יהיו שימושיים למחקרים הדורשים הכנת תאים מבודדים מלשונות עכבר בשלבים התפתחותיים מוקדמים (E12.5) ומבוגרים צעירים (8 שבועות) הדורשים ניתוק תאים מתאי רקמות שונים.

הפרדת אפיתל הלשון מרקמת המזנצ'ים/חיבור הבסיסית בלשון העכבר העוברי, ניתן לראות פער במרחב התת-אפיתל לאחר עיכול אנזים תקין. יריעות אפיתל של לשונות מסוימות מופרדות ללא כוח מכני במהלך הדגירה.
בלשון העכבר הבוגר, הזרקת אנזים מוצלחת מסומנת על ידי הנפיחות באזורים המוזרקים (איור 1B2 ), מה שמרמז עלכךשהאנזים יכול להיות מוחזק על ידי הלשון. אין מספיק אנזים ו/או החדרת מחט עמוקה למזנכיים ו/או חדירת אפיתל הלשון על ידי מחט יגרום לנפיח...

פיתחנו פרוטוקול כללי כדי לנתק כמות גדולה של תאים בודדים באיכות גבוהה מן האפיתל ו mesenchyme / רקמת חיבור של לשונות עכבר עובריות ובוגרות.

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

תשואה גבוהה ואיכות של תאים מרקמות מורכבות חיוניים לניתוח ניסיוני נפוץ, כגון רצף RNA של תא יחיד ותרביות תאי גזע ראשוניות. פרוטוקול זה יוצר תאים בריאים בתפוקה גבוהה ואיכות מאזורים שונים ותאי רקמות של לשון היונקים, כולל אפיתל לשון ורקמת חיבור. כדי להפריד את האפיתל מ mesenchyme של לשון העכבר E 12.5, להעביר את העכבר הנשי בהריון המתת חסד לאזור כירורגי להרטיב את הבטן העכבר עם 70% אתנול כדי למנוע פרווה מלהיכנס לאתר ההפעלה.פתח את הבטן באמצעות מספריים מנתחים כדי לחשוף את קרני הרחם הנושאות את העוברים, לנתח את קרני הרחם ולהעביר אותם לתמיסה של 15 מיליליטר של טיירוד טרי בצלחת תרבות של 100 מילימטר. תחת מיקרוסקופ מנתח, להשתמש במספריים מיני מלקחיים בסדר לנתח את העוברים מקרני הרחם. פתח את חלל הפה עם מלקחיים עדינים לנתח את הלשון מן הלסת התחתונה באמצעות מספריים מיני.לשטוף את הלשונות עם 15 מיליליטר של פתרון טרי סטרילי Tyrode בצלחת תרבות 100 מילימטר. ואז להעביר את הרקמות לשני מיליליטר של תערובת אנזים של dispase ו קולגן בצלחת תרבות 35 מילימטר דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את הלשונות ל-15 מיליליטר של הפתרון הסטרילי הטרי של טיירוד ומפרידים בעדינות את המזנצ'ים והאפיתל מהצד הגחוני באמצעות מלקחיים עדינים.לשטוף את האפיתליה מופרדים mesenchyme פעמיים ב 15 מיליליטר של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי. כדי להפריד את אפיתל הלשון מרקמת החיבור הבסיסית של עכבר בוגר, להעביר את העכבר מורדם לאזור כירורגי להרטיב את ראש העכבר באמצעות 70% אתנול כדי למנוע פרווה להיכנס לחלל הפה. השתמש ניתוח מספריים כדי לחתוך את הפינות של הפה לאורך הלחי כדי לפתוח את חלל הפה.לנתח את הלשון עם הלסת התחתונה, לשטוף אותו ומניחים אותו בצלחת פלסטיק עם שכבה של ניילון נצמד. באמצעות מלקחיים כירורגיים להחזיק את הלשון, להזריק את תערובת האנזים של dispase וקולאז'נים בחלל subepithelial של הלשון דרך הקצה החוד החנית של הלשון האחורית. להזריק מיליליטר אחד של תערובת אנזימים באופן שווה לכל הלשון לאיסוף רקמות, ולאחר מכן להזריק 0.5 מיליליטר של תערובת אנזימים מקומית ללשון הקדמונית לאיסוף רקמות מקצה הלשון או ללשון האחורית לאיסוף רקמת פפילה circumvallate.עוטפים את הלשון בניילון נצמד ומדגרים אותה במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. השתמש מספריים מיני לנתח את פפילה circumvallate ואת קצה הלשון. ואז להעביר רקמה ל 15 מיליליטר של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי.להפריד את האפיתל מרקמת החיבור הבסיסית בחלל subepithelial מעוכל האנזים באמצעות מספריים מיני לקצץ את הרקמות לגודל הנכון, על פי הדרישה של ניסויים במורד הזרם. שטפו את האפיתל המופרד ואת רקמת החיבור הבסיסית פעמיים ב-15 מיליליטר של הפתרון של Tyrode סטרילי טרי בצלחת תרבות של 100 מילימטר. להעביר את הרקמות לשלושה מיליליטר של 0.25%trypsin EDTA בצלחת תרבות חדשה 35 מילימטר.דגירה את המנה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, בעדינות להתסיס את הרקמות כל חמש דקות עם טיפים פיפטה מיליליטר אחד. הוסף 500 מיקרוליטרים של 5%FBS ב- DMEM F12 כדי לעצור את התגובה ולהעביר את המדיום לצינור צנטריפוגה מחייב נמוך של חמישה מיליליטר. צנטריפוגה השעיית התא ב 200 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.בעדינות resuspend התאים בשלושה מילימטרים של DMEM F12 המכיל 10%FBS ו 1%BSA, ולסנן את התאים עם מסננת תאים 70 מיקרומטר, ואחריו מסננת תאים 35 מיקרומטר. צנטריפוגה השעיית התא ב 200 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את רוב המדיום, משאיר 50 עד 300 microliters כנפח הסופי כדי resuspend התאים. בלשון העכבר העוברי, ניתן לראות פער במרחב התת-דתי לאחר עיכול אנזים תקין.בלשון העכבר הבוגר, הזרקת אנזים מוצלחת מסומנת על ידי נפיחות באזורים המוזרקים, מה שמרמז כי האנזים יכול להיות מוחזק על ידי הלשון. לאחר איגום יריעות האפיתל של E12.5 לשונות ושכבות דקות של mesenchyme, ספירת תאים ידנית הוכיחה כי הפרוטוקול הניב 63, 917 תאים בסך הכל עם הכדאיות של 95.2% מן גיליונות האפיתל, ו 294, 333 תאים בסך הכל עם הכדאיות של 96.3% מן mesenchyme. כאשר 10 לשונות מבוגרים בגיל שמונה שבועות שימשו, הפרוטוקול הניב 187, 333 תאים עם יכולת הקיום של 95.4% יריעות אפיתל של קצה הלשון, 544, 000 תאים עם יכולת הקיום של 96.3% יריעות אפיתל של papillae circumvallate, ו 150, 500 תאים עם הכדאיות של 93% מרקמות חיבור.בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בתאים המנותקים לריצוף RNA של תא יחיד ולתרבות אורגנואידית לבדיקה תלת-ממדית כדי להגדיר תאי אב בדיקה לא מזוהים תחת האפיתל הלשונית.

cell-dissociation-from-tongue-epithelium-mesenchymeconnective-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים...

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

בסרטון זה אנו מתארים את הבידוד של תאי אפיתל מלשון מורין. תאים אלה יכולים להיות תרבית נוספת כדי ליצור מושבות תאים.

בידוד ותרבית תאי אפיתל לשון מורין: הליך לבידוד ותרבית תאי אפיתל לשון ממודל עכבר

סרטון זה מדגים את הכנת המטריצה החוץ תאית של לשון מורין באמצעות שיטת דה-צלולריזציה, הכוללת חשיפת הלשון שנקטפה לסדרה של טיפולים פיזיקליים, כימיים ואנזימטיים. פיגום TEM שנוצר שומר על הרכב המטריקס החוץ תאי המקורי שלו, ומסיר את רכיבי התא.

ייצור מטריצה חוץ-תאית ממודל עכבר: הליך יעיל להכנת מטריצה חוץ-תאית לשון דה-תאית מלשון מורין

בסרטון זה, אנו מתארים את הבידוד של אפיתל פפילות היקפיות (CVP) מלשון מורין.

בידוד אפיתל פפילה היקפית (CVP) ממודל עכבר: הליך אנזימטי להפרדת אפיתל CVP מלשון עכבר

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי קליפת המוח הראשוניים מהטלנספלון הדורסולטרלי של עוברי עכברים.

בידוד וגידול תאים מעובר עכבר טלנספלונים דורסולטרליים

פרוטוקול להפרדה של אקטודרם וmesenchyme פן עובר מתואר. אנו משתמשים Dispase השני לטיפול בעוברים שלמים ראשון, לנתח בליטות פן שלמות, ואז להפריד אקטודרם וmesenchyme הפנים.

הפרדת אקטודרם עכבר העוברי פן וmesenchyme

השן החותכת העכבר הולך ומתרחבת מספקת מודל ללימוד חידוש רקמות שיניים מתאי גזע שיניים אפיתל (DESCs). מערכת חזקה בעקביות ובאמינות קבלת תאים אלה מהשן החותכת והרחבתן במבחנה הוא דיווח כאן.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך העכבר העכבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בשילוב עם מגוון רחב של שורות העכבר כתב פלואורסצנטי, עם מעכבי נתיב עבור תובנה מכניסטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור הדמיה חיה במערכות התפתחותיות אחרות.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של תאים מזנכימליים הפליאטוניים של עכבר ראשוניים להדמיה של צמיחה דו-ממדית (2D) ובגידות לתיקון פצעים. אנו מספקים גם את המתודולוגיה לניתוח נתוני ההדמיה של זמן לשגות כדי לקבוע היווצרות זרם תאים תנועתיות כיוונית.

בידוד והדמיה בזמן-לשגות של תאי מזנשים הפליאטל העוברי הראשי של העכבר כדי לנתח תכונות תנועה קולקטיבית

הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

למד פרוטוקול לניתוק תאים בודדים באיכות גבוהה מאפיתל ומזנכימה של לשון עכברים. השיטה מייצרת תאים בריאים לריצוף RNA ותרביות אורגנואידים.

ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

גלה סרטונים נוספים