Name: ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למדו איך לדמות רמות מימן חמצני בתאי עצב זברה ופגים באמצעות הביוסנסור roGFP2-Orp1. שיטה זו מאפשרת גילוי בזמן אמת של ROS ומסייעת בחקר תפקידם בפיזיולוגיה עצבית ובהתפתחות עוברית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (Grant R01NS117701), הקרן הלאומית למדע (Grant 1146944-IOS), קרן המחקר של חוט השדרה הטראומטי של אינדיאנה ופגיעות מוחיות (גרנט 20000289), קרן המחקר פרדו (גרנט 209911) ומשרד סגן נשיא בכיר למחקר ושותפויות באוניברסיטת פרדו (גרנט 210362). אנו מודים לד"ר קורי ג'יי וויבר והיילי רודר על הקמת פרוטוקול תרבות זברה-פיש RGC. אנו מודים להיילי רודר על שסיפקה את הנתונים של איור 4. אנו מודים ללאה ביאסי וקני נגוין על העזרה בתרבות RGC. אנו מודים לג'נטרי לי על עריכת הטקסט. אנו מודים לד"ר טוביאס דיק על שסיפק את roGFP2-Orp1 ואת ד"ר צ'ינג דנג על וקטור pCS2+ המכיל roGFP2-Orp1. איור 2 נוצר באמצעות Biorender.com.

<ol><li>Bórquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+Physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li>
<li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li>
<li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+of+the+brain%3A+Distribution%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li>
<li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-dependant+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
<li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency%3A+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li>
<li>Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li>
<li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li>
<li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li>
<li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li>
<li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury%3A+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752(2017).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li>
<li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+redox+biology%3A+from+imaging+to+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li>
<li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12(2020).</li>
<li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genomics+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539(2013).</li>
<li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028(2010).</li>
<li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Migration%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li>
<li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nox2%2Fcybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132(2012).</li>
<li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222(2014).</li>
<li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li>
<li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li>
<li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li>
<li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li>
<li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model%3A+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li>
<li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li>
<li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2%2Frobo2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li>
<li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyPer+family+probes%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li>
<li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SypHer3s%3A+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Communications%22%5BJournal%5D)">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li>
<li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

ישנם מספר שלבים קריטיים הזקוקים לתשומת לב לאורך פרוטוקול זה. אנו מאמינים כי התחשבות בנקודות אלה תשפר את זרימת הניסויים. עבור תרבות RGC העיקרית, הסטריליות של ZFCM(-) חשובה מאוד, שכן מדיה תרבותית זו אינה מכילה אנטיביוטיקה וזיהום יכול להתרחש לפני או במהלך ההדמיה. כדי להימנע מכך, אנו ממליצים להכין ולהשתמש ZFCM(-) רק בתוך ארון biosafety ולעשות מדיה ZFCM טרי (-) באופן קבוע (שלב 1.5). בנוסף, מניות למין צריך להישמר ב -80 מעלות צלזיוס. למין מופשר צריך להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס בכל עת. אין לשמור על פתרונות למין בטמפרטורת החדר...

חמצן תגובתי מינים (ROS) איתות מווסת את ההתפתחות והתפקוד של מערכת העצבים1. מקור ROS תאי חשוב הם תחמוצות NADPH (NOX), שהם חלבונים טרנסממברן המייצרים סופראוקסיד ומי חמצן (H2O2)2. אנזימי NOX נמצאים בכל מערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), ו- NOX נגזר ROS לתרום להתפתחות עצבית3,4,5,6. תחזוקה ובידול של תאי גזע עצביים, יצירת קוטביות עצבית, נוייריט נימים, פלסטיות סינפטית הוכחו לדרוש רמות נאותות של ROS7,8,9,10,11. מצד שני, ייצור בלתי מבוקר של ROS על ידי NOXes לתרום הפרעות ניווניות כולל מחלת אלצהיימר, טרשת נפוצה, ופגיעה מוחית טראומטית12,13,14. לפיכך, הייצור של ROS רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הוא קריטי לשמירה על תנאים בריאים.
פיתוח של biosensors מקודדים גנטית הקל על גילוי של ROS הסלולר מאוד. אחד היתרונות החשובים של biosensors מקודד גנטית הוא הרזולוציה הזמנית והמרחבית מוגברת של אות ROS, כמו חיישנים אלה יכולים להיות ממוקדים במיוחד למקומות שונים. GFP רגיש לאדומים (roGFP) הוא סוג אחד של ביוסנסורים מסוג ROS. גרסת roGFP2-Orp1 מזהה באופן ספציפי H2O2 דרך תחום Orp1 שלה, שהוא חלבון משפחת גלוטתיון peroxiredoxin משמרים15,16. החמצון של חלבון Orp1 מועבר roGFP2 כדי לשנות את הקונפורמציה שלה (איור 1A). הגשוש מציג שתי פסגות עירור ליד 405 ננומטר ו 480 ננומטר, ושיא פליטה יחיד ב 515 ננומטר. עם החמצון, עוצמת הפלואורסצנטיות סביב עירור מגיעה לשיאה: בעוד שהתרגשות של 405 ננומטר עולה, 480 ננומטר של עירור פוחת. לפיכך, roGFP2-Orp1 הוא ביוסנסור יחסי, ורמות H2O2מזוהות על ידי היחס בין עוצמות הפלואורסצנטיות הנרגשות משני אורכי גל שונים (איור 1B). בסך הכל, roGFP2-Orp1 הוא כלי רב-תכליתי להדמיית ROS שניתן להשתמש בו ביעילות ב- vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי וספקטרום עירור של roGFP2-Orp1. (A) העברת חמצון מתרחשת בין Orp1 ו roGFP2 בתגובה H2O2, המוביל לשינויים קונפורמיים roGFP2. (B)ספקטרום העירור של roGFP2-Orp1 מציג שתי פסגות עירור ב 405 ננומטר ו 480 ננומטר ושיא פליטה יחיד ב 515 ננומטר. עם חמצון על ידי H2O2, עירור 405 ננומטר עולה בעוד 480 ננומטר עירור פוחתת. התוצאה היא קריאה ביחס עבור נוכחות H2O2. הנתון שונה מבילאן ובלושוב (2017)16 ומורגן ואח ' (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
למערכת המודלים של דניו ריו (זברה-פיש) יש מספר יתרונות ליישום ביוסנסורים מקודדים גנטית. השקיפות האופטית של העוברים והזחלים מאפשרת הדמיה לא פולשנית של vivo. כלי הדמיה חדשים מפותחים כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר וחדירה עמוקה יותר17. יתר על כן, ישנם כלים מבוססים למניפולציה גנטית (ביטוי mRNA חוץ רחמי, Tol2 transgenesis, וכו ') ועריכת גנום (TALENs, CRISPR / Cas9, וכו '), אשר מקדם את הדור של בעלי חיים מהונדסים18. ככל שעוברי הזברה מתפתחים מחוץ לאם, מערכת זו מאפשרת גישה ומניפולציה קלות יותר של העוברים. לדוגמה, זריקות שלב אחד וטיפולים תרופתיים ניתן לעשות בקלות.
כאן, השתמשנו בזברה כדי לבטא באופן ארעי את ה- H2O2-ספציפי biosensor roGFP2-Orp1 על ידי הזרקת mRNA עם עיטור במבחנה. עוברים אלה יכולים לשמש הן להדמיה במבחנה של נוירונים תרבותיים והן להדמיית vivo (איור 2). אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוח וציפוי תאי גנגליון רשתית (RGCs) מעוברים זברה ולאחר מכן הערכת H2O2-רמות נוירונים תרבותיים. לאחר מכן, אנו מציגים שיטה להדמיה in vivo של עוברים מבטאים roGFP2-Orp1 ותזחלים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. גישה זו לא רק מאפשרת לקבוע פיזיולוגית H2O2-רמות, אלא גם שינויים פוטנציאליים המתרחשים בשלבים התפתחותיים שונים או תנאים. בסך הכל, מערכת זו מספקת שיטה אמינה לגילוי H2O 2 בתאים חיים ובעליחיים כדי ללמוד את התפקיד של H2O2 בפיתוח, בריאות, ומחלות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> איור 2. קווי המתאר של הגישה הניסיונית. בקצרה, לאחר איסוף עוברים, roGFP2-Orp1 mRNA מוזרק לתוך החלמון של עוברי זברה שלב אחד. פיתוח עוברים יכול לשמש הן עבור (A) במבחנה ו -( B) בהדמיה vivo. (A)עוברים חיוביים GFP משמשים לנתח רשתית עבור אוסף RGC ב 34 hpf. RGCs מנותקים מצופים על כריכות מצופות PDL/למין במדיה ZFCM (+). הדמיית חרוט צמיחה יכולה להתבצע כמו RGCs להרחיב את האקסונים שלהם לאחר 6-24 שעות של ציפוי. תאים יכולים להיות כפופים לטיפולים שונים כדי למדוד את השינויים הפוטנציאליים H2O2-רמות. כאן, מדדנו H2O2-רמות בקונוסים הצמיחה של RGCs (אדום). (B)עוברים חיוביים של GFP משמשים להדמיית vivo. בגיל הרצוי, עוברים יכולים להיות מורדמים ומורכבים על כלים תחתונים מזכוכית 35 מ"מ להדמיה קונפוקלית. כאן, עוברים מותקנים באופן מאוורר להדמיה ברשתית. סכמטי מראה התפתחות רשתית בזברפיש. RGCs יוצרים שכבת תא גנגליון (GCL), שהיא השכבה הפנימית ביותר ברשתית. אקסונים RGC לפתח עצב הראייה לחצות קו האמצע, ויוצרים chiasm אופטי. לאחר מכן, אקסונים RGC לגדול dorsally לעשות סינפסות ב טקטום אופטי ב midbrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבות 35 מ"מ</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>סאטר / פישר סיינטיפיק</td><td>NC9029378</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>כלי פטרי חד פעמיים (100 x 15 מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>25384-094</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא Aldich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>עובש הזרקה</td><td>כלי מדע אדפטיבי</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית</td><td>Zeiss</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium עם פנול אדום</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>11-415-064</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium ללא פנול אדום</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>21-083-027</td><td></td></tr><tr><td>התכה נמוכה agarose</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 ערכת תמלול</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone/Fisher Scientific</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>Sigma Aldich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>פנאומטי PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma Aldich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>QiaQUICK PCR ערכת טיהור</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי slit2</td><td>מו"פ D Systems</td><td>5444-SL-050</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא אלדיך</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>סטריטופ 0.22 ומיקרו; m filter</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TE</td><td>Buffer Ambion</td><td>AM9860</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine Methanesulfonate</td><td>Sigma Aldich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטה אנכי</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td></td></tr></tbody></table>

ros הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות איתות מבוססות היטב, החשובות בהתפתחות תקינה, הומאוסטזיס ופיזיולוגיה. בין ROS שונים, מי חמצן (H2O2) מאופיין בצורה הטובה ביותר ביחס לתפקידים איתות הסלולר. H2O2 כבר מעורב במהלך הפיתוח במספר מינים. לדוגמה, עלייה חולפת H2O2 זוהה בעוברים זברה בימים הראשונים לאחר ההפריה. יתר על כן, דלדול מקור H2O2 הסלולר חשוב, NADPH אוקסידאז (NOX), פוגע בהתפתחות מערכת העצבים כגון בידול, צמיחה אקסונאלית, והנחיה של תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הן vivo והן במבחנה. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה תאית H2O2 רמות נוירונים זברה בתרבית וזחלים שלמים במהלך הפיתוח באמצעות Hמקודד גנטית 2O2-ספציפי biosensor, roGFP2-Orp1. בדיקה זו יכולה לבוא לידי ביטוי באופן ארעי או יציב בזחלי זברה. יתר על כן, הקריאה היחסית מפחיתה את ההסתברות לגילוי חפצים עקב ביטוי גנים דיפרנציאלי או השפעות נפח. ראשית, אנו מדגימים כיצד לבודד ולתרבת RGCs הנגזרים מעוברים של דגי זברה המבטאים באופן ארעי roGFP2-Orp1. לאחר מכן, אנו משתמשים בזחלים שלמים כדי לפקח על H2O2 רמות ברמת הרקמה. החיישן אומת על ידי תוספת של H2O2. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש למדידת H2O2 רמות בסוגי תאים ספציפיים ורקמות על ידי יצירת בעלי חיים מהונדסים עם ביטוי biosensor ספציפי לרקמות. כמו זברה פיש להקל על מניפולציות גנטיות והתפתחותיות, הגישה הוכיחה כאן יכול לשמש צינור כדי לבדוק את התפקיד של H2O2 במהלך התפתחות עוברית עצבית וכללית בחולייתנים.

RGCs דג זברה תרבותי להרחיב אקסונים בתוך 1d. תמונת יחס מייצגת של 405/480 של H2O2-biosensor מוצגת באיור 4A. גוף התא, האקסון וקונוסי הגדילה נראים בבירור בנוירונים בודדים. נוירונים אלה יכולים להיות כפופים לטיפולים שונים לאורך זמן כדי לפקח על H2O2 שינויים. בעבר מצאנו כי הוספת 100 μM H2O2 למדיה תרבותית מגדילה את ערכי היחס, מראה כי שינויים בזמן אמת ניתן לזהות עם מערכת זו (איור 4)24</sup...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

הפרוטוקול שלנו מתאר את השימוש בביוזנסור מי חמצן בנוירונים וזחלים של דגי זברה בתרבית. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים לנתח את תפקידם של מיני חמצן תגובתי בפיזיולוגיה נורמלית ופתופיזיולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זיהוי בזמן אמת של מי חמצן בבעלי חיים ותאים תרבותיים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על בעלי חיים אחרים, כמו מערכת מודל מכרסמים. כדי להכין את ה-coverslips, יש להשתמש בכיסויים מנוקים בחומצה המאוחסנים ב-100% אתנול. השתמש מלקחיים כדי להסיר כיסוי אחד ממכל האחסון, ולהצית אותו כדי להסיר אתנול שיורית.אוויר לייבש את הכיסוי לחלוטין על ידי הצבת אותו בזווית בתוך צלחת תרבות 35 מילימטר. הכן פולי-די-ליבין או PDL, או פתרון עבודה. החל PDL למרכז של כל coverslip, הימנעות התפשטות של הפתרון לקצוות דגירה PDL במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.ודא PDL לא להתייבש. לשטוף את PDL עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים ולתת את הצלחות להתייבש לחלוטין. הכן פתרון עבודה למין.ולהחיל אותו על המרכז של כל coverslip, הקפדה למנוע את התפשטות הפתרון לקצוות. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח במשך שעתיים עד שש שעות, למנוע ייבוש של תמיסת למין. כדי לבצע ניתוח עובר בתאי גנגליון רשתית צלחת או RGCs, להכין ולתייג ארבע מנות תרבית רקמה 35 מילימטר ולמלא אותם עם ארבעה מיליליטר של 70% אתנול.E2 מדיה אחת. E2 מדיה שתיים. ותקשורת E2 שלוש, ביום הניתוח.שמור את הכלים במקרר. כאשר עוברי זברה הם 34 שעות לאחר ההפריה, לקחת את מנות התרבות מצופה למינצין מתוך האינקובטור. ולשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של 1X PBS.לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים ארבעה מיליליטר של ZFCM + מדיה לכל צלחת תרבות. הימנע ייבוש הצלחת. מחזירים את מנות התרבות בקירור המוכנות ומניחים להן להשתוות לטמפרטורת החדר.מלא ארבעה עד שישה צינורות PCR עם 15 מיקרוליטרים של ZFCM + מדיה. לאחזר עוברי זברה מן האינקובטור לטבול עוברים בצלחת תרבית רקמה 35 מילימטר המכיל 70% אתנול במשך 5-10 שניות כדי לעקר אותו. באמצעות העברה של פיפטה, להעביר עוברים E2 מדיה מנה אחת, המכיל מדיה סטרילית E2 לשטוף אתנול עודף.לאחר מכן, להעביר את העוברים ל E2 מדיה שתי צלחת ולהסיר chorions שלהם עם מלקחיים חדים. לבסוף, להעביר עוברים E2 מדיה שלוש צלחת לבצע ניתוחים. באמצעות זוג מלקחיים עדינים, למקם ולהחזיק עוברים לפני החלמון עם אחד המלקחיים.ולהסיר את הזנב האחורי לשק החלמון עם המלקחיים האחרים. תפוס את הצוואר עם מלקחיים ולהוריד את הראש כדי לחשוף את המוח והעיניים למדיה E2. עם קצה של מלקחיים עדינים, בעדינות לגלגל את העיניים מהראש תוך החזקת רקמת הגולגולת למטה עם מלקחיים שניים.העבר ארבע עיניים לאחד הצינורות שהוכנו בעבר המכיל ZFCM + בעדינות triturate למעלה ולמטה עם p20 פיפטה על 45 פעמים כדי לנתק תאים. העבר את ה- ZFCM+ עם התאים המנותקים למרכז ה- coverslips. לשמור על תרבויות על הספסל העליון ב 22 מעלות צלזיוס על מתלה קצף פוליסטירן לספוג תנודות.ביום ההדמיה, בדוק תאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת את הצמיחה של אקסונים RGC. להדמיית תאים חיים, העבירו את הכיסויים מתבשיל התרבות לתא הדמיה של תא חי. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במסנן אדום OG-590 Longpass אובייקטיבי DIC ומצלמת EMCCD.לפני ההדמיה, החלף את ZFCM + בינוני עם ZFCM-לאחר מיקום התאים עם המטרה 10X, לרכוש תמונות בהגדלה 60X באמצעות מטרת טבילה בשמן. השתמש בהגדלה נוספת של פי 1.5. ראשית לרכוש תמונות DIC.לאחר מכן, תמונה roGFP2-Orp1, באמצעות ערכת המסננים המתאימה. לאחר לקיחת הסט הראשון של תמונות, להחליף מדיה עם מדיה המכילה פתרונות טיפול שונים. יש לשנות את המדיה כל 30 דקות של הדמיה כדי למנוע שינויי pH ו- osmolarity.להדמיית vivo, יש לשמור על עוברים לאחר הפריה 22 עד 24 שעות במדיה E3, המכילים 0.003% פניל תיוראה ללא כחול מתילן. להחליף מדיה ולהסיר עוברים מתים מדי יום. בגיל הרצוי, הרדמה והרה עוברים ב 1%agarose על 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות תרבות.עוברים יכולים להיות מכוונים דרך הגב, דרך הפה, או לרוחב, בהתאם לאזור העניין להדמיה. לאחר שהאגרוז מתגבש, ממלאים את הכלים במדיית E3 ללא מתילן כחול, אך עם 0.016% טריקאין. הגדר את המיקרוסקופ להדמיה.השתמש במיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר הפוך כדי לדמות עוברים המותקנים בתחתית טיפת אגרוז. לרגש roGFP2-Orp1, ולרכוש תמונות תואמות עם מסנני הפליטה הרצויים. לרכוש z-ערימות עם עובי סעיף חמישה מיקרו מטר דרך החלק הרצוי של העוברים.לאחר ההדמיה, להסיר עוברים מ Agarose עם מלקחיים עדינים ולשמור אותם באינקובטור ומתילן כחול מדיה חופשית עם פניל thiourea עד הגיל הרצוי. תמונה מייצגת של ביוסנסור מי חמצן ואקסונים מורחבים של דגי זברה RGC בתרבית מוצגת כאן. גוף התא, האקסון וקונוסי הגדילה נראים בבירור בנוירונים בודדים.התוספת של מי חמצן למדיה התרבותית מגדילה את ערכי היחס, מראה כי שינויים בזמן אמת ניתן לזהות עם מערכת זו. כימות של רמות מי חמצן מוצג בפאנל B.To לקבוע את רמות מי חמצן בעוברים זברה שלמים, mRNA הוזרק במהלך שלב התא אחד, גורם לכל הרקמות לבטא את biosensor roGFP2-Orp1. האזור הראשי של זחלי זברה מוצג בשתי נקודות זמן שונות, תוך התמקדות ברמות מי חמצן ברשתית.רמות הבסיס של מי חמצן בעוברים של דגי הזברה ביומיים שלאחר ההפריה וחמישה ימים לאחר ההפריה נמדדו. ביומיים שלאחר ההפריה, ערכי היחס היו נמוכים משמעותית מחמישה ימים לאחר ההפריה. יתר על כן, כל בעל חיים הראה רמה שונה של עלייה בתכולת מי חמצן הרשתית שלהם.שימוש במלקחיים עדינים להסרת העיניים ניתוק עדין של העיניים עם פיפטה הם הצעדים הקריטיים ביותר בהליך זה. פרוטוקול זה יכול להיות מלווה על ידי טיפולים תרופתיים כדי לחקור את הגורמים המעורבים איתות ROS.

ros-live-cell-imaging-during-neuronal-development

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים...

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

סרטון זה מדגים טכניקה לזיהוי רמות מי חמצן בזמן אמת בתאי גנגליון ברשתית באמצעות הביוסנסור roGFP2-Orp1 וטכניקות הדמיה של תאים חיים. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהכנת תאים, דימות פלואורסצנטי וכימות רמות מי חמצן.

זיהוי רמות מי חמצן בתאי עצב בתרבית באמצעות הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים

מקור: Gómez-Villafuertes, R., et. al., הדמיה חיה ואחריה מעקב אחר תא בודד כדי לנטר את הביולוגיה של התא ואת התקדמות השושלת של אוכלוסיות עצביות מרובות. J. Vis. exp. (2017)} } וידאו מדגים את תהליך ההכנה, ההדמיה והמעקב אחר תאי גזע עצביים בוגרים בזמן אמת כדי לחקור התנהגויות תאיות, כולל חלוקה והתמיינות.

 הדמיה חיה ומעקב אחר תא בודד לניטור שושלת עצבית בתאי גזע עצביים בוגרים

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור התנהגויות הסלולר בזמן אמת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של קליפת המוח ראשי תאים המאפשרת בדיקה מקיפה של השלבים שחוקקו במהלך ההתקדמות שושלת היוחסין מתאי גזע עצביים העיקרי נוירונים הבדיל, עכשיו, דונלד.

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

למדו איך לדמות רמות מימן חמצני בתאי עצב זברה ופגים באמצעות הביוסנסור roGFP2-Orp1. שיטה זו מאפשרת גילוי בזמן אמת של ROS ומסייעת בחקר תפקידם בפיזיולוגיה עצבית ובהתפתחות עוברית.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

גלה סרטונים נוספים