In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור
10 בפברואר 2021
כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.
שיטה זו מאפשרת הדמיה של מוח דג זברה בשלבים מאוחרים יותר של זחל כדי לאפשר את התצפית של הארכיטקטורה העצבית בצורה מפורטת מאוד ב vivo כי בעבר לא היה אפשרי. תאי פיגמנט, אשר הופיעו במהלך התפתחות זחל מאוחר יותר ומונע את המוח הדמיה ברורה, אינם בעיה עם שיטה זו כי הם פשוט מוסרים. בשיטה, יש ללמוד תהליכים המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר במהלך התפתחות הזחל של המוח, תהליכים המשפיעים על פלסטיות סינפטית, ניוון של נוירונים או התחדשותם.
לפני תחילת הניסוי השתמש במשיכת מיקרופיפט כדי להכין מחטי זכוכית חדות, דקות, מנימי זכוכית. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר פלסטיק כדי לאסוף זחל לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ המכיל את הפתרון המתאים. מעבירים את הזחל הנבחר לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה ACSF ומניחים 24 על 24 מילימטר, מרובע, כיסוי זכוכית להחליק לתוך מכסה צלחת פטרי.
ואז aliquot את הנפח של ACSF הדרוש לניסוי לתוך phial מתאים עבור חמצון עם קרבוגן. כדי להטמיע את הזחל, השתמש בצינור פסטר כדי להעביר את הזחל המרדים לתא הרכבה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. אם כל זחל עדיין מסוגלים לזוז, לא להשתמש בדגים לניסוי עד הדגים אינם מסוגלים לזוז לחלוטין.
כאשר הזחלים הם חסרי תנועה, בזהירות להסיר את מדיום עודף מיד להוסיף לפחות מיליליטר אחד של אגרוז נמס נמוך על הזחל. כוון את דג הזברה עם אזור הגב הפונה למעלה קרוב ככל האפשר לפני השטח של האגארוז. אם הזחל יצולם באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לאחר התחזקות, גזמו את האגורוז המכיל את הזחל לבלוק קובואידי קטן.
כדי לחשוף את המוח להדמיה, לקצץ את עודף agarose מעל אזור המוח של עניין לפי הצורך ולהשתמש במחט זכוכית כדי להפוך חתך קטן דרך העור ליד, אבל לא מעל, אזור העניין מבלי לחדור עמוק מדי לתוך הרקמה. בקושי להזיז את המחט ממש מתחת לפני העור, להמשיך בזהירות לעשות חתכים קטנים מאוד סביב אזור העניין עד העור מעל אזור העניין ניתן להסיר או לדחוף הצידה. כאשר הרקמה הוסרה מכל העוברים, הוסף טיפה קטנה של אגרוז נמס נמוך לתא ההדמיה שהוכן בעבר של מיקרוסקופ הפוך והשתמש במרית קטנה כדי להפוך את בלוק אגרוז הקוביואיד 180 מעלות על טיפת האגרוז בתא ההדמיה.
כאשר האגורוז התגבש, מלאו את תא ההדמיה ב-ACSF טרי והתחילו להדמיה את הזחל. כאן, זחל מהונדס שלם 14 ימים לאחר ההפריה עם הגולגולת עדיין שלם ניתן לראות. כפי שמוצג, תאי הפיגמנט בתוך העור המניח מפוזרים על כל הראש, מפריעים לאות הפלואורסצנטי באזור העניין.
לאחר ניתוח גולגולת פתוח, תחום העניין הופך לנגיש באופן חופשי להדמיה מפורטת ברזולוציה גבוהה. מחסום העור, הגולגולת או מוח הדם מעכבים גם את חדירת החומרים למוח, כפי שממחיש צבע גרעיני איתן הכתם שנצפו בתאי מוח אלה רק לאחר ניתוח גולגולת פתוח. יתרונות אלה נצפים גם ב 30 ימים לאחר ההפריה.
בדגים מהונדסים המכילים כלי דם מוחי פלואורסצנטי בשל הביטוי של חלבון פלואורסצנטי אדום, mCherry, בתאי אנדותל, קידוד צבע בערכי העומק של מחסנית התמונה מדגים כי אפילו כלי דם קבורים עמוק בתוך המוח כמעט 250 מיקרון עדיין גלויים בבירור למעקב. בעת ביצוע הליך זה תמיד יש לזכור כי זהו ניתוח בחיה חיה. לכן, זה דורש כבוד ונפש ממוקדת.
לאחר הליך זה, הקלטה של המורפולוגיה העצבית, כולל מבנים סינפטיים, אירועי הובלה פיזיולוגיים תאיים יכולה להתבצע בזחלים מעל שבעה ימים לאחר ההפריה. בטכניקה זו, אנו מקווים לספק גישה המאפשרת לחקור גם תהליכים תאיים במוח המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר של זחל, וכי הם מעורבים ביצירת, למשל, התנהגויות מורכבות כגון התנהגות חברתית או קבלת החלטות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה כירורגית זעיר-פולשנית לחשיפת המוח של זחלי zebrafish ערים בשלבי התפתחות מאוחרים, המאפשרת דימוי in vivo ברזולוציה גבוהה של הארכיטקטורה הנוירונלית ותהליכים פיזיולוגיים. השיטה פותרת את אתגר הפיגמנטציה של העור המעכבת גישה אופטית בזחלים מבוגרים יותר, ובכך מאפשרת לחוקרים ללמוד על מורפולוגיה נוירונלית, מבנים סינפטיים ואירועים תאיים דינמיים בפירוט חסר תקדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- טכנולוגיית דימות
רקע
- דימות מפורט של התפתחות המוח בעוברי דגי Zebrafish סיפק תובנות משמעותיות לגבי מנגנונים תאיים ומולקולריים.
- בשלבים מאוחרים יותר של הזחלים, פיגמנטציה של העור חוסמת את חדירות האור ומגבילה את יכולות הדימות.
- עיכוב פרמקולוגי של הפיגמנטציה אינו בר ביצוע בזחלים מבוגרים יותר.
- הבנת הזיקוק והקישוריות העצבית בשלבים אלה חיונית לחקר התנהגויות מורכבות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה כירורגית לגישה אופטית למוח של דגי הזברה בשלבי הזחליל המאוחרים.
- מתן אפשרות לדימוי ברזולוציה גבוהה של מבנים עצביים ותהליכים פיזיולוגיים in vivo.
- סיוע במחקרים על פלסטיות סינפטית, דגנרציה עצבית, רגנרציה ותהליכים מוחיים הקשורים להתנהגות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מחטי זכוכית חדות באמצעות מכשיר למתיחת מיקרופיפטות (micropipette puller).
- הטמעת זחלי zebrafish הרדומים באגרוז בנקודת התכה נמוכה לצורך ייצוב.
- קילוף מיקרוסקופי של העור וסחוס הגולגולת הרך באמצעות מחטי זכוכית כדי לחשוף את אזור המוח הרלוונטי.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופ הפוך, כולל סימון פלואורסצנטי וויזואליזציה ברזולוציית עומק.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת הסרה של תאי פיגמנט, ובכך מספקת גישה אופטית ברורה למוח בזחלים עד 30 ימים לאחר ההפריה.
- ניתן לבצע הדמיה ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה ניורונוית, מבנים סינפטיים ואירועי הובלה תוך-תאיים.
- מבני מוח עמוקים, כולל כלי דם בעומק של עד 250 microns, נגישים להדמיה.
- השיטה מאפשרת מחקרים פיזיולוגיים, כגון תנודות של Ca2+ ומניפולציות פרמקולוגיות או אופטוגנטיות.
מסקנות
- גישה זעיר-פולשנית זו מאפשרת הדמיה מפורטת in vivo של מוח דג הזברה בשלבי התפתחות מאוחרים יותר.
- היא מקלה על חקר שינויים נוירונליים מבניים ופיזיולוגיים העומדים בבסיסם של התנהגויות מורכבות.
- הטכניקה מרחיבה את היקף המחקר בדגי זברה בנושאי התפתחות המוח, קישוריות ותפקוד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות in vivo ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורה נוירונלית בזריקי זב של זברופיש ערים מאפשר תצפית ישירה על התפתחות המוח, עידון סינפטי ותהליכים פיזיולוגיים הרלוונטיים לתיקוף מטרות נוירו-התפתחותיות. טכניקה זו לחשיפה מינימלית פולשנית של המוח עוקפת מחסומי פיגמנטציה, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). הגישה משפרת את הרצף התרגומי על ידי מתן אפשרות לחקירה תפקודית של מעגלים נוירונליים במהלך חלונות התפתחותיות קריטיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של מורפולוגיה נוירונלית ומבנים סינפטיים ברקמת מוח חיה ומתפתחת.
- תומך במחקרים מכניסטיים של פלסטיות סינפטית, דגנרציה ורגנרציה הרלוונטיות לתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מקל על בחינת קישוריות נוירונלית ותהליכים תלויי-פעילות העומדים בבסיס התנהגויות מורכבות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vivo מתוקף להדמיה כמותית של תגובות נוירונליות וסינפטיות.
- מאפשר הערכה הדירה של מניפולציות פרמקולוגיות או אופטוגנטיות במעגלים עצביים שלמים.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות להדמיה בעלת תוכן גבוה (high-content imaging) וסריקה תפקודית במודלים של התפתחות נוירולוגית.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- תואם לשלבי התפתחות רלוונטיים למחלה לצורך מידול של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירו-פסיכיאטריות.
- מאפשר ביצוע של מחקרים אורכיים של מבנה ותפקוד נוירונלי לאורך תקופות קריטיות של התבגרות המוח.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון, באמצעות אספקת נתונים חיזויים in vivo על קישוריות ותפקוד עצביים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים, ובכך תומכת בזיהוי מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ובאופטימיזציה של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי קישוריות נוירונלית, עידון סינפטי ואיתות תלוי-פעילות in vivo.
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים להערכת השפעות של תרכובות על מורפולוגיה ותפקוד נוירונליים.
- אנליזה: מספקת קריאות ברזולוציה גבוהה של שינויים מבניים ופיזיולוגיים, התומכות בניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי המוקדם לתיקוף פרה-קליני על ידי מידול תהליכי התפתחות הרלוונטיים להפרעות ב-CNS אנושי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לדימות in vivo ובחינה תפקודית בנוירוביולוגיה של דגי זברה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ב-CNS ומפחית עמימות מנגנונית במחקר נוירו-התפתחותי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה בדימות in vivo לצורך שחזוריות ויכולת הרחבה בשלבים מוקדמים של הגילוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית של מטרות נוירונליות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תוכניות CNS באמצעות נתוני in vivo חסונים על מבנה ותפקוד נוירונליים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-כירורגיה ובדימות חי של מודלים של חולייתנים קטנים.
- נדרשת גישה לתשתיות מתקדמות של מיקרוסקופיה וניתוח תמונות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הניתוח והדימות לצורך הדירות (reproducibility).
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שלבי התפתחות שונים או רקעים גנטיים שונים.
- טיפול זהיר הוא חיוני כדי למזער את הסטרס של בעלי החיים ולהבטיח את איכות הנתונים.
