Name: In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: למד הדמיית סידן חיה של נוירונים בגנגליון הגניקולט בעכברים באמצעות GCaMP. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תגובות לגירויים טעם ברזולוציית תאים בודדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לס. הומאיון על גידול העכברים. מימון עבור עבודה זו ניתן בחלקו על ידי בוגר הקונסורציום לבריאות המוח של UTSA ומענק זרע פוסט-דוקטורט (B.E.F.) ו- NIH-SC2-GM130411 ל- L.J.M.

פרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת טקסס סן אנטוניו.
1. התקנה טרום ניתוחית
הערה: שים לב כי ההתקנה הראשונית של הציוד אינה מטופלת כאן, שכן היא תשתנה בהתאם למערכת המשאבה, המיקרוסקופ, המצלמה ותוכנת ההדמיה שבה נעשה שימוש. לקבלת הוראות התקנה, עיין בחומרי הדרכה המסופקים על-ידי ספק הציוד. עבור ציוד המשמש את המחברים, עיין בטבלת החומרים.
<ol><li>ודא נוזל זורם דרך כל הרכב (מים) וקווים טעימים. אם הקו חסום, התנתק ושטוף במים. אם הקו הוא סטיה, לעסות עד נוזל זורם. ודא שהנוזל מתחיל ונעצר לפי סימן.</li>
	<li>לאחר כל הקווים מאושרים ללא חסימה, להפעיל רכב עבור 10 s ואז לסגור את כל השסתומים.</li>
	<li>ודא שתוכנת ההדמיה מוכנה עם כל המשתנים הנדרשים (למשל, אורך ניסיון, שמות קבצים, קצב פריימים וכו '). באמצעות μManager, חבילת תוכנה לרכישת תמונות בקוד פתוח, הזן 200 אלפיות השנייה בשדה שכותרתו זמן חשיפה עבור מסגרות לשנייה של 5Hz, בחר x2 תחת binningולחץ על הלחצן שכותרתו Live. כאשר הווידאו מתחיל, לחץ על הלחצן בצד שמאל שכותרתו ROI. התוצאה תהיה שדה ראייה של 512x512.</li>
</ol>2. מרדים ומשתק את החיה
הערה: הפרוטוקול הבא הוא הליך סופני ממוטב לעכברים מכל מין במשקל 18-35 גרם. מומלץ לשימוש עם בעלי חיים בין הגילאים 10 ל -12 שבועות. זה עשוי לשמש עם בעלי חיים מהונדסים המבטאים אינדיקטורים סידן מקודד גנטית (GECIs) כגון Snap25-GCaMP6s, או בעלי חיים מוזרק סטריאוטקסית עם GECIs ויראלי. כפפות, חלוק מעבדה ומסכת פנים צריכים להיות משוחקים במשך כל הפרוטוקול.
<ol><li>לגרד את החיה ולבצע הזרקה תוך-גופית של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו Xylazine (10 מ"ג/ק"ג). להעריך את עומק ההרדמה באמצעות צביטת הבוהן לפני שתמשיך.</li>
	<li>גילוח החלק העליון של הראש amd האזור הכירורגי בחלק הקדמי של הצוואר.</li>
	<li>הפעל את כרית החימום והניח את החיה נוטה על הכרית.</li>
	<li>יש למרוח משחה על עיני החיה כדי למנוע ייבוש העיניים.</li>
	<li>בצע תרסיס (~ 1 ס"מ) בקו האמצע של הראש כדי לחשוף את הגולגולת של החיה. הסר רקמת חיבור באמצעות ספוגית סטרילית כך העצם החשופה נגישה. השתמש אפליקטור כותנה קצה כדי להבטיח את הגולגולת יבשה.</li>
	<li>החל קשר וטרינר על הגולגולת. הקפד לכסות את הגולגולת החשופה. חכה שהדבק יתייבש.</li>
	<li>במכסה צלחת פטרי, מערבבים ומחילים שכבה של מלט דנטלי על הגולגולת. הקצה האחורי של אפליקטור הכותנה המשמש בשלב 2.5 יעבוד היטב עבור תהליך זה. מניחים כיסוי ראש על גבי המלט הדנטלי ומניחים שכבה שנייה של מלט דנטלי כדי לכריך את כיסוי הראש במקום על הגולגולת.</li>
	<li>תן לו לשבת עד הבטון הדנטלי יבש ומוצק. לשבור את אפליקטור הכותנה הטה לשניים ולהשתמש בקצוות מחודדים לתקוע את מלט השיניים כדי לבדוק. אם המלט הדנטלי אינו נכנע לדחיפה החיה עשוי להפוך לתנוחה על-ביתית.</li>
</ol>3. קנה הנשימה
<ol><li>יש למרוח קרצוף טרום ניתוחי על אזור כירורגי. לאחר קרצוף, לעשות חבטה בקו האמצע ~ 2 ס"מ בעור הגרון מ ועצם החזה לסנטר.</li>
	<li>לסגת העור ואת בלוטות תת maxillary, להיות בטוח לחשוף באופן מלא את השרירים digastric.</li>
	<li>מצא את התפר בשריר הצנחן, להפריד אותו עם ניתוח קהה, ולבטל פתוח.</li>
	<li>חותכים בזהירות פתח בחלק העליון של קנה הנשימה גדול מספיק כדי להתאים צינורות פוליאתילן (I.D. 0.86 מ"מ, O.D. 1.27 מ"מ). אין לחתוך יותר מחצי דרך קוטר קנה הנשימה. הכנס צינורות לתוך קנה הנשימה לכיוון הריאות.</li>
	<li>מקם מחדש מפסקים כדי לשחרר שרירים paratracheal ולבטל את בלוטות תת-מהילארי.</li>
	<li>דבק שרירים paratracheal יחד על צינורות עם כמות מינימלית של דבק וטרינרי (ראה איור 1A).</li>
</ol>4. לשבור את הבוולה הסימפנית
<ol><li>הקנירו בעדינות את שריר הדיגסטרו הרצוי (משמאל או מימין) למעלה ופרקו את רקמת החיבור. חותכים בקצה הקדמי של השריר, הימנעות מכלי הדם, ולמשוך לאחור לאחור עד נקי של bulla tympanic.</li>
	<li>הטה את הראש מעט לאחור כדי להרים את הבולה הטימפנית. אתר את הענף של העורק הראשי הקדמי לנקודת הכניסה האחורית של השריר digastric. תרגישו רק אחוריים לכלי הדם הזה למבנה הקמור של הבורה הטימפנית.</li>
	<li>חפשו תפר בשרירים במיקום זה (ראו איור 1B). באמצעות שני סטים של מלקחיים עדינים, לנתח בוטה בתפר עד העצם של bulla tympanic גלוי. השתמש במפסקים כדי לשמור על תצוגה ברורה של הבוולה הסימפנית.</li>
	<li>מצאו את התפר שרץ הקדמי אל אחורי הבולה (ראו איור 1C). באמצעות בדיקה כירורגית, לתקוע חור בעצם במרכז התפר הזה. השתמש קבוצה של מספריים קצה דק לחתוך אזור מעגלי בעצם, דואג לא לחתוך כלי דם הקדמי, אחורי, ועמוק מתחת bulla.</li>
</ol>5. חשיפת ההיגיינה
<ol><li>בתוך החור הזה יש חתיכת עצם קעורה, זו השבלול. החלק האחורי של השבלול הוא שריר, טימפני הטנסור (ראו איור 1D). בעזרת מספריים קפיץ, לחתוך את טימפני טנסור ולהסיר אותו.</li>
	<li>בצע צביטת בוהן. אם בעלי חיים מגיבים, לתת תערובת קטמין / קסילסין ata 1/3 מנה עבור redosing.</li>
	<li>הכן נוזל השקיה וקו יניקה. באמצעות הגשוש הכירורגי, לנקב חור בצוק שבלול. מיד להשקות את הנוזל שזורם החוצה ולהסיר אותו עם יניקה. נוזל זה יזרום פחות או יותר ברציפות מנקודה זו ויהיה צורך לטפל בו מעת לעת.</li>
	<li>להגדיל את החור שבלול. יש להקפיד על כלי הדם האופפת את השבלול לקצה האחורי והלבי.</li>
	<li>הטה את ראש העכבר קדימה. אתר את החור בעצם הטמפורלית מתחת למה שהיה השבלול (ראו איור 1E). שימו לב לרכס החם לחור הזה, הרכס הזה יושב ישירות מעל העצב השביעי.</li>
	<li>הכנס בדיקה כירורגית לתוך החור והרם בזהירות את עצם הזמן כדי לחשוף את העצב השביעי (ראו איור 1F). קח מלאי של כמה של העצב השביעי נראה ואם geniculate אינו חשוף לחלוטין, להטות את ראשו של החיה בחזרה ולנסות למשוך את העצם מן העצבים אל העצב.</li>
	<li>אם הגנגליון עדיין לא נראה במלואו, משוך יותר עצם מלמטה. היזהר מאוד לא למקם את הגשוש עמוק מתחת לעצם כמו עושה את זה עלול לפגוע geniculate.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2.jpg"> איור 1: חשיפה כירורגית של גנגליון geniculate. (A)תמונה של חלל צוואר העכבר לאחר קנה הנשימה. החץ מצביע על שריר הדיגסטרי השוכב מעל האזור הכירורגי שנחקר בשאר הדמות. (B)תמונה של אזור תחת שריר digastric שצוין בעבר. החץ מציין את התפר בשרירים עבור ניתוח בוטה. (ג)תמונה של בולה טימפנית. החץ מציין תפר בעצם כדי לשבור עם בדיקה כירורגית. (ד)תמונה של אזור כירורגי לאחר פתיחת הבוולה. החץ השמאלי התחתון מציין את השבלול, החץ העליון מצביע על טימפני הטנסור. קו בקופסה מציין אזור ב- (E) ו -F. (ה)תמונה של אזור כירורגי לאחר השבלול נשבר והתוכן הוסר. החץ הלבן מציין היכן למקם בדיקה כירורגית המוזכרת בפרוטוקול שלב 5.6. (ו)תמונה של גנגליון geniculate חשוף. החץ מציין את גופו של העצב השביעי, משולש מקווקו מקיף את גנגליון geniculate. לוחות A-B, Scale = 5 מ"מ. לוחות C-F, Scale = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
6. הפעל פאנל טעים
<ol><li>השתמש שאיבה כדי להסיר נוזל מעל geniculate. לחלופיות, מקם נקודת ספיגה כדי לסייע בצמצם את החלחול ולסייע בניווט במיקרוסקופ.</li>
	<li>מניחים את החיה על כרית סופגת מתחת למיקרוסקופ. אתר את גנגליון geniculate: ציוני דרך שימושיים כוללים את החור שנותר בולה, החור בעצם הטמפורלית, ואת העצב השביעי. באמצעות מסנן FITC /GFP על טווח האפיפלואורסצנטיות, בדוק אם יש נוירוני גנגליון geniculate בודדים המביעים GCaMP. מטרה של 10x (מרחק עבודה 10 מ"מ) תספק רזולוציה מספקת כדי לעקוב אחר הפעילות של תאים בודדים, אך ניתן להשתמש גם במטרה של 20x (מרחק עבודה 12 מ"מ).</li>
	<li>מניחים מחט חלוקה לקו טעים בחוזקה בפה של בעלי חיים. מניחים צלחת פטרי מתחת לפה של החיה כדי לתפוס נוזל.</li>
	<li>ודא שהמצלמה מציגה את שדה הראייה של המיקרוסקופ. סנכרן את תחילת הקלטת הווידאו עם תחילת המצגת הטעים.</li>
	<li>במהלך ההקלטה, צפה בשידור חי כדי לצפות בתגובות, להיסחף ולחלחל.</li>
	<li>אם חלחול מתרחשת, שאיבה הנוזל עד התצוגה של geniculate ברור וחוזר על עצמו. אם מתרחשת סחף, ודא שכל חלקי עמוד הראש מתהדקים היטב. אם לא מתרחשות תגובות, בדוק שהנוזל זורם ושהמיקרוסקופ והמצלמה מתמקדים במיקום הנכון מבלי שמשהו יטשטש את שדה הראייה.</li>
	<li>חזור על הפעולה עד לקבלת מספר הסרטונים הרצוי. הקל בעדינות על המפסקים ולאחר מכן חזור על שלבים 3-6 בצד הנגדי.</li>
	<li>לאחר שהסרטונים הרצויים הושגו עבור כל הגרעינים הרצויים, המת חסד את החיה באמצעות נקע צוואר הרחם.</li>
</ol>

<ol><li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4(2007).</li>
<li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission%3F+CALHM1%2C+a+voltage-gated+ATP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li>
<li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv-European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li>
<li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+for+ATP%3A+neurotransmission+in+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264(2013).</li>
<li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+sense+about+taste%3A+from+mammals+to+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li>
<li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+neural+response+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li>
<li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li>
<li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li>
<li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li>
<li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia%3A+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).</li>
<li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li>
<li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%3A+A+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865(2018).</li>
<li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106(2015).</li>
<li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewiring+the+taste+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html">http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html</a> (2008).</li>
<li>Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014).</li>
<li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZcalcium%3A+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li>
<li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079(2019).</li>
<li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440(2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים לדווח.

עבודה זו מתארת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לחשוף בניתוח את גנגליון geniculate ולתעד חזותית את הפעילות של הנוירונים שלה עם GCaMP6s. הליך זה דומה מאוד לזה שתואר קודם לכן17, עם כמה יוצאים מן הכלל בולטים. ראשית, השימוש בתנוחת ראש מאפשר התאמה קלה של מיצוב הראש במהלך הניתוח. שנית, לגבי משלוח גירוי, הגישה על ידי וו ו Dvoryanchikov זורם גירויים טעם דרך צינורות הוושט17, ואילו פרוטוקול זה מספק נוזל ישירות לתוך הפה עם מחט מחלק. כל שיטה יכולה לשמש כדי לעורר בהצלחה תגובות נוירון גנגליון ge...

מרכיב מרכזי במערכת הטעם ההיקפית של היונקים הוא גנגליון geniculate. בנוסף לכמה נוירונים סומטוסנסוריים המ innervate את הפינה של האוזן, geniculate מורכב מגופי התא של נוירונים gustatory innervating הלשון והחך הצפוניים. בדומה לנוירונים חושיים היקפיים אחרים, נוירוני הגנגליון הגנולטים הם פסאודו-חד קוטביים עם אקסון ארוך המקרין באופן היקפי לבלוטות הטעם, ובמרכז לגרעין גזע המוח של מערכת הבודדת1. נוירונים אלה מופעלים בעיקר על ידי שחרור של ATP על ידי תאי קולטן טעם המגיבים לגירויים טעם בחלל הפה2,3. ATP הוא נוירוטרנסמיטר חיוני עבור איתות טעם, קולטני P2rx לידי ביטוי על ידי נוירונים גנגליון gustatory נחוצים להפעלתם4. בהתחשב בכך שתאי קולטן הטעם מבטאים קולטני טעם ספציפיים עבור מודאליות טעם מסוימת (מתוק, מריר, מלוח, אומאמי, או חמוץ), ההשערה היא כי תגובות נוירון גנגליון gustatory טעם גירויים יהיה גם מכוון בקושי5.
הקלטות עצבים שלמות הראו הן את chorda tympani ואת העצבים פטרוסאלי מעולה גדול יותר לבצע אותות gustatory המייצגים את כל חמש שיטות הטעם כדי גנגליון geniculate6,7. עם זאת, זה עדיין השאיר שאלות על הספציפיות של תגובות עצביות לטעם נתון: אם יש מודאליות טעם נוירונים ספציפיים, נוירונים פולימודליים, או תערובת של שניהם. הקלטות סיבים בודדים לתת מידע נוסף על הפעילות של סיבים בודדים רגישויות כימיות שלהם8,9,10, אבל מתודולוגיה זו מוגבלת לאיסוף נתונים ממספר קטן של סיבים. באופן דומה, בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות vivo של נוירוני גנגליון geniculate חולדה בודדים לתת מידע על התגובות של נוירונים בודדים11,12,13, אבל עדיין מאבד את הפעילות של האוכלוסייה ומניב הקלטות נוירון מעט יחסית לכל חיה. על מנת לנתח את דפוסי התגובה של הרכבים עצביים מבלי לאבד את הפעילות של נוירונים בודדים, טכניקות חדשות צריך להיות מועסק.
הדמיית סידן, במיוחד באמצעות אינדיקטורים סידן מקודד גנטית כמו GCaMP, סיפק פריצת דרך טכנית זו14,15,16,17,18. GCaMP משתמש בסידן כבא כוח לפעילות עצבית, הגדלת פלואורסצנטיות ירוקה ככל שרמות הסידן בתוך התא עולות. צורות חדשות של GCaMP ממשיכות להיות מפותחות כדי לשפר את יחס האות לרעש, להתאים קינטיקה מחייבת, ולהתאים לניסויים מיוחדים19. GCaMP מספק רזולוציית נוירון יחיד, שלא כמו הקלטת עצב שלמה, והוא יכול בו זמנית למדוד תגובות של הרכבים של נוירונים, שלא כמו סיב יחיד או הקלטת תא יחיד. הדמיית סידן של הגרעינים geniculate כבר סיפק מידע חשוב על פרופילי כוונון של נוירונים אלה בעכברים מסוג בר16,20, וזיהה טעם היקפי חיווט פנוטיפים במניפולציה גנטית עכברים18.
אחד הקושיים העיקריים ליישם בטכניקות הדמיית סידן ויוו על גנגליון geniculate הוא שזה עטוף בתוך בולה טימפנית גרמית. על מנת לקבל גישה אופטית geniculate, ניתוח עדין נדרש כדי להסיר את שכבות העצמות, תוך שמירה על הגנגליון שלם. לשם כך, יצרנו מדריך זה כדי לעזור לחוקרים אחרים לגשת לגנגליון geniculate ולדמות את GCaMP מתווך תגובות פלואורסצנטיות של נוירונים אלה לטעום גירויים ב vivo.

<table><tbody><tr><td>1 x #5 מלקחיים Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9792102</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל עם מנעול luer</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>2 x #3 מלקחיים Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>M3S 11200-10</td><td></td></tr><tr><td>27 מד קהה מחלק מחט</td><td>פישר מדעי</td><td>NC1372532</td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0398332</td><td></td></tr><tr><td>4-40 מכונה בורג אגוזי משושה</td><td>מהדקים</td><td>3SNMS004C</td><td></td></tr><tr><td>4-40 בורג כובע ראש שקע</td><td>מהדק</td><td>3SSCS04C004</td><td></td></tr><tr><td>נקודות סופגות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-930-668</td><td></td></tr><tr><td>Acesulfame K</td><td>Fisher Scientific</td><td>A149025G</td><td></td></tr><tr><td>דמעות מלאכותיות</td><td>Akorn</td><td>59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>מגשי אלרגיסט BD עם מחט מחוברת לצמיתות</td><td>פישר מדעי</td><td>14-829-6D</td><td></td></tr><tr><td>מחזירים קהים</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>לוח לחם</td><td>Thor Labs</td><td>MB8</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>פישר מדעי</td><td>A95-3</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas מספריים אביב</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>נוזל אורתו-סילון עכשווי</td><td>לאנג</td><td>1504</td><td></td></tr><tr><td>אבקת אורתו-סילון עכשווית</td><td>Lang</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>פישר</td><td>19-062-616</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק עמוד ראש מותאם אישית</td><td>eMachineShop</td><td></td><td>ראה קובץ מצורף 202410.ems</td></tr><tr><td>מותאם אישית ראש מתכת פוסט</td><td>eMachineShop</td><td></td><td>ראה קובץ מצורף 202406.ems</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורת DC</td><td>FHC</td><td>מצלמה דיגיטלית 40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>, sCMOS OrcaFlash4 מיקרוסקופ רכוב</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440</td><td></td></tr><tr><td>היקף חתך</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>קוצץ שיער</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>CL7300-Kit</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>פישר AAJ6195906</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי קטמין קטאבד</td><td></td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>אור קר LED מקור</td><td>Leica Mcrosystems</td><td>KL300LED</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock מתאמי צינורות 1/16 אינץ'</td><td>פישר</td><td>01-000-116</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>מיני סדרה עמודים אופטיים</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R</td><td></td></tr><tr><td>MPG</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AAA1723230</td><td></td></tr><tr><td>MXC-2.5 בדיקה מסתובבת מהדק</td><td>Siskiyou</td><td>14030000E</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-947-346</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>אוויר בלחץ</td><td>Airgas</td><td>AI Z300</td><td></td></tr><tr><td>כינין</td><td>פישר AC163720050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הדבקה עצמית סרט תיוג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>צינורות שסתום צביטה סיליקון 1/32 אינץ' x 1/16 אינץ' OD (לכל רגל)</td> <td>אוטומציה מדעית</td><td>05-14</td><td></td></tr><tr><td>Sola SM מנוע אור</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td><td>JAX</td><td>025111</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים לסטודנטים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה כירורגית</td><td>Roboz חנות כירורגית</td><td>RS-6067</td><td></td></tr><tr><td>כירורגית מחזיק בדיקה</td><td>Roboz חנות כירורגית</td><td>RS-6061</td><td></td></tr><tr><td>חוט</td><td>G&uuml; termann</td><td>02776</td><td></td></tr><tr><td>BD צינורות תוך-רפואיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-046941</td><td></td></tr><tr><td>ווסת גז דו-שלבי</td><td>Airgas</td><td>Y12FM244B580-AG</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ויניל Tygon - 1/16 אינץ'</td> <td>Automate Scientific</td><td>05-11</td><td></td></tr><tr><td>Valvelink8.2 בקר דיגיטלי/ידני</td><td>Automate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>Valvelink8.2 שסתום צביטה מערכת זלוף</td><td>אוטומציה מדעית</td><td>17-pp-54</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>Anased</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

בעשר השנים האחרונות, ההתקדמות במדדי סידן (GECIs) המקודדים גנטית קידמה מהפכה בהדמיה תפקודית של vivo. באמצעות סידן כבא כוח לפעילות עצבית, טכניקות אלה מספקות דרך לפקח על התגובות של תאים בודדים בתוך הרכבים עצביים גדולים למגוון גירויים בזמן אמת. אנחנו, ואחרים, יישמנו טכניקות אלה כדי לדמיין את התגובות של נוירונים גנגליון geniculate בודדים לטעום גירויים להחיל על הלשונות של עכברים מרדים חיים. הגנגליון הגנולט מורכב מגופי התא של נוירונים גוסטטוריים המחדירים את הלשון והחך העורפיים, כמו גם כמה נוירונים סומטוסנסוריים המחדירים את הפינה של האוזן. הדמיית התגובות מעוררות הטעם של נוירוני גנגליון geniculate בודדים עם GCaMP סיפק מידע חשוב על פרופילי כוונון של נוירונים אלה בעכברים מסוג בר, כמו גם דרך לזהות פנוטיפים טעם היקפי miswiing בעכברים מניפולציה גנטית. כאן אנו מדגימים את ההליך הכירורגי כדי לחשוף את גנגליון geniculate, רכישת תמונה פלואורסצנטית GCaMP, צעדים ראשוניים לניתוח נתונים, ופתרון בעיות. טכניקה זו יכולה לשמש עם GCaMP מקודד מהונדס, או עם ביטוי GCaMP בתיווך AAV, וניתן לשנות אותה לתמונה תת-קבוצות גנטיות מסוימות של עניין (כלומר, ביטוי GCaMP בתיווך Cre). בסך הכל, בהדמיית סידן ויו של נוירוני גנגליון geniculate היא טכניקה רבת עוצמה לניטור הפעילות של נוירונים גוסטטוריים היקפיים ומספקת מידע משלים להקלטות מסורתיות יותר של chorda tympani עצב שלם או טעם התנהגות ישבן.

בעקבות הפרוטוקול, חיה מהונדסת Snap25-GCaMP6s היה מסומם, גרעינים geniculate נחשפו, ו tastant הוחל על הלשון בזמן וידאו הוקלט. מטרת הניסוי הייתה להגדיר אילו תיחומות עוררו תגובות מכל תא. תמציתים (30 מ"מ AceK, 5 mM כינין, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 מ"מ חומצת לימון)18 היו מומסים במי DI והוחלו על הלשון עבור 2 s מופרדים על ידי 13 s של מים DI.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62172/62172fig2v2.jpg"> <strong ...

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

טכניקה זו יכולה לענות על שאלות פונקציונליות חשובות על תגובות עצביות לטעום הגרעינים geniculate, חלק מכריע של מסלול הטעם צ'ורדה טימפאני הפנימי. טכניקה זו יכולה לשמש לניטור התגובות בזמן אמת של נוירונים בודדים מרובים בניסוי ניסיוני יחיד, שכן תאים שנרשמו לכל חיה גבוהים באופן משמעותי ממה שנצפו בדרך כלל בשיטה האלקטרופיזיולוגית. עם העכבר רכוב על עמוד הראש בתנוחת העל-אדמה על כרית חימום, בצע חתכת קו האמצע של שני ס"מ בעור מעל הגרון, מעצם החזה לסנטר.ולחזר את העור ואת בלוטות תת-מקסילארי לחשוף באופן מלא את השרירים digastric. לאחר איתור התפר בשריר הפרצ'אל, להפריד את התפר עם ניתוח קהה ולבטל את הרקמה כדי לפתוח אותו. חותכים בזהירות פתח בחלק העליון של קנה הנשימה גדול מספיק כדי להתאים חתיכת צינורות פוליאתילן מבלי לחתוך יותר ממחצית הדרך דרך הקוטר של קנה הנשימה ולהכניס את הצינורות לתוך קנה הנשימה לכיוון הריאות.מקם מחדש את המפסקים כדי לשחרר את השרירים paratracheal ולבטל את בלוטות מקסילארי המשנה. לאחר מכן, השתמש בכמות קטנה של דבק וטרינרי כדי לאטום את השרירים paratracheal יחד מעל הצינור. כדי לשבור את הבולה הטימפנית, להקניט בעדינות את השריר digastric הרצוי כלפי מעלה ולמשוך את רקמת החיבור לגזרים.לעשות חותך בקצה האחורי של השריר, הימנעות כלי הדם. ולמשוך לאחור לאחור עד נקי של bulla טימפני. הטה את הראש מעט לאחור

in-vivo-calcium-imaging-mouse-geniculate-ganglion-neuron-responses-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Shannonhouse, J.,  et al. In vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גב שלמים. J. Vis. Exp. (2023). הסרטון מדגים טכניקת הדמיית סידן in vivo לניטור פעילות עצבית בגרעיני השורש הגבי (DRG) של עכבר טרנסגני. נוירונים DRG מבטאים אינדיקטור סידן המגביר את עוצמת הקרינה בעת הקישור לסידן. גירויים מכניים או תרמיים המופעלים על כפה אחורית מייצרים פוטנציאל פעולה המתפשט ל-DRG, גורם לזרימת סידן בתאי העצב וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטיות מוגברת.

הדמיית סידן in vivo של הרכבים עצביים בגרעיני השורש הגבי השלמים של עכבר

מקור: Fowler, B. E., et al. הדמיית סידן in vivo של תגובות נוירונים גנגליון גנגליון של עכבר לגירוי טעם. J. Vis. Exp. (2021) סרטון זה מדגים פרוטוקול להעברת טעמים לגנגליון הגניקולט שנחשף בניתוח בעכבר מורדם ושימוש בפלואורסצנטיות GCaMP עם מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית כדי להמחיש תגובות עצביות בזמן אמת, ומסייע למחקרים על עיבוד אותות טעם היקפי.

הדמיה in vivo של תגובות נוירונים של גנגליון גניקולאט באמצעות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיית סידן in vivo למדידת התגובות של הרכבים של נוירונים מותניים-6 DRG לגירויים סומטיים וקרביים. ניתן לבצע השוואות יסודיות בין נוירונים המגיבים לגירויים שונים. פרוטוקול זה הוא בעל ערך לחקירת מנגנונים של כאב קרביים וגירוי סומטי, כגון דיקור סיני.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובת נוירוני גרעיני השורש הגבי לגירויים סומטיים וקרביים

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

גישת הדמיית סידן מאפשרת להקליט תגובות הנגרמות על ידי טעם במוחם של זבובים ערים בזמן שתמיסה מוחלת על התווית. תגובות טעם ראשוניות ב-Drosophila melanogaster משמשות כדוגמה, אך ניתן להתאים פרוטוקול זה לחקר נוירונים במורד הזרם או מינים אחרים.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובות עצביות הנגרמות על ידי טעם בדרוזופילה בוגרת

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

למד הדמיית סידן חיה של נוירונים בגנגליון הגניקולט בעכברים באמצעות GCaMP. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תגובות לגירויים טעם ברזולוציית תאים בודדים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

גלה סרטונים נוספים