Name: מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למד שיטות פלואורסצנטיות למדידת העברת פוספטידילסרין ופוספטידילינוזיטול 4-פוספט על ידי חלבוני העברת ליפידים כמו Osh6p בין ממברנות סינתטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר א. קאטריס על הגהתה הקפדנית של כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי מענק ExCHANGE של סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-16-CE13-0006) ועל ידי CNRS.

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

התוצאות של בדיקות אלה מסתמכות ישירות על האותות של חיישני השומנים הפלואורסצנטיים. לכן, הטיהור של בדיקות אלה שכותרתו ביחס 1:1 עם NBD וללא זיהום פלואורופור NBD חינם הוא צעד קריטי בפרוטוקול זה. כמו כן, חובה לבדוק אם ה- LTP הנבדק מקופל כראוי ולא צבור. כמות ה- LTP שנבדקה בבדיקות החילוץ חייבת להיות שווה או גבוהה מזו של מולקולות PS או PI(4)P נגישות כדי למדוד כראוי אם LTP זה מחלץ ביעילות שומנים אלה. ואכן, NBD-C2לקט ו- NBD-PHFAPP נקשרים ל- PS ו- PI(4)P, בהתאמה, בעקבות עקומת כריכת רוויה קלאסית. בהתחשב זיקתם בה...

ההתפלגות המדויקת של שומנים בין ממברנות שונות ובתוך הממברנות של תאים אאוקריוטים1,2 יש השלכות ביולוגיות עמוקות. פענוח האופן שבו תפקוד LTPs הוא נושא חשוב בביולוגיה של התא3,4,5,6, וגישות במבחנה הן בעלות ערך רב בטיפול בבעיה זו7,8,9,10,11. כאן, אין ויטרו, אסטרטגיה מבוססת פלואורסצנטיות מוצגת כי כבר אינסטרומנטלי לקבוע כי כמה חלבוני ORP / Osh להשפיע PS / PI(4)P חילופי בין קרום התא12 ובכך מהווים סוג חדש של LTPs. PS הוא גליצריופוספוליפיד אניוני המייצג 2-10% מכלל שומנים ממברנה בתאים אוקריוטים13,14,16. הוא מופץ לאורך שיפוע בין חדר המיון לבין ראש הממשלה, שם הוא מייצג 5-7% ועד 30% של גליצריופוספוליפידים, בהתאמה17,18,19. יתר על כן, נ.ב. מרוכז בעצם בעלון הציטוטוסולי של ראש הממשלה. הצטברות זו והמחיצה הלא אחידה של PS בראש הממשלה הם קריטיים לתהליכי איתות סלולריים19. בשל המטען השלילי של מולקולות נ.ב. העלון הציטוסולי של ראש הממשלה הוא הרבה יותר אניוני מאשר העלון הציטוטוסולי של אברונים אחרים1,2,19,20. זה מאפשר גיוס, באמצעות כוחות אלקטרוסטטיים, של חלבוני איתות כגון מצע C-kinase עשיר מאלנין myristoylated (MARCKS)21, סרקומה (Src)22, קירסטן-חולדת סרקומה ויראלי אונקוגן (K-Ras)23, וראס הקשורים C3 botulinum רעלן מצע 1 (Rac1)24 המכילים רצועה של חומצות אמינו טעונות חיובית וזנב שומניד.
נ.ב. מוכר גם על ידי חלבון קונבנציונאלי קינאז C באופן סטריאו-סלקטיבי באמצעות תחום C225. עם זאת, נ.ב. מסונתז ב- ER26, המציין כי יש לייצא אותו לראש הממשלה לפני שיוכל למלא את תפקידו. לא היה ידוע כיצד זה הושג19 עד הממצא כי, בשמרים, Osh6p ו Osh7p להעביר PS מן המיון ל PM27. LTPs אלה שייכים למשפחה שמורה אבולוציונית באאוקריוטים שחבר המייסד שלהם הוא OSBP ומכיל חלבונים (ORPs בחלבוני אדם, Osh בשמרים) המשלבים תחום הקשור ל- OSBP (ORD) עם כיס לארח מולקולת שומנים. Osh6p ו Osh7p מורכבים רק מ- ORD שתכונותיו המבניות מותאמות לאגד במיוחד את נ.ב. ולהעביר אותו בין הממברנות. עם זאת, לא היה ברור כיצד חלבונים אלה העבירו את נ.ב. ממיון לראש הממשלה. Osh6p ו Osh7p יכול ללכוד PI(4)P כמו ליגנד שומניםחלופי 12. בשמרים, PI(4)P מסונתז מפוספטידילינוזיטול (PI) בגולגי ובראש הממשלה על ידי PI 4-kinases, Pik1p ו- Stt4p, בהתאמה. לעומת זאת, אין PI(4)P בקרום המיון, כמו שומנים זה הוא hydrolyzed PI על ידי פוספטאז Sac1p. לפיכך, מעבר צבע PI(4)P קיים הן בממשקי ER /Golgi והן בממשקי ER/PM. Osh6p ו- Osh7p מעבירים PS מחדר המיון לראש הממשלה באמצעות מחזורי חילופי PS/PI(4)P באמצעות מעבר צבע PI(4)P שקיים בין שתי הממברנות הללו12.
בתוך מחזור אחד, Osh6p מחלץ PS מחדר המיון, מחליף PS עבור PI(4)P בראש הממשלה ומעביר PI(4)P בחזרה לחדר המיון כדי לחלץ מולקולת PS אחרת. Osh6p/Osh7p מתקשרים עם Ist2p28, אחד החלבונים הבודדים שמחברים ומביאים את קרום המיון ואת ראש הממשלה לקרבה זה לזה כדי ליצור אתרי קשר ER-PM בשמרים29,30,31. בנוסף, הקשר של Osh6p עם ממברנות טעונות שליליות הופך חלש ברגע שהחלבון מחלץ את אחד מהליגנדים השומנים שלו עקב שינוי קונפורמציה שמשנה את התכונות האלקטרוסטטוריות שלו32. זה מסייע Osh6p על ידי קיצור זמן התעכבות הממברנה שלה, ובכך לשמור על היעילות של פעילות העברת השומנים שלה. בשילוב עם האיגוד ל- Ist2p, מנגנון זה יכול לאפשר Osh6p/7p לבצע במהירות ובדייקות חילופי שומנים בממשק ER / PM. בתאים אנושיים, חלבוני ORP5 ו- ORP8 מבצעים חילופי PS/ PI(4)P באתרי מגע ER-PM באמצעות מנגנונים ברורים33. יש להם ORD מרכזי, בדומה Osh6p, אבל הם מעוגנים ישירות לחדר המיון באמצעות קטע transmembrane מסוף C33 לעגון לתוך ראש הממשלה באמצעות N-מסוף פלקסטרין הומוולוגיה (PH) תחום המזהה PI(4)P ו PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 משתמש ב- PI(4)P כדי להעביר נ.ב., והוכח כי ORP5/8 מווסת בנוסף את רמות PM PI(4,5)P2 וככל הנראה מווסת נתיבי איתות. בתורו, ירידה ברמות PI(4)P ו- PI(4,5)P2 מורידה את פעילות ORP5/ORP8 מכיוון שחלבונים אלה מקשרים את ראש הממשלה בצורה תלוית PIP. סינתזת PS גבוהה באופן חריג, המובילה לתסמונת לנץ-מג'בסקי, משפיעה על רמות PI(4)P באמצעות ORP5/836. כאשר הפעילות של שני החלבונים נחסמת, נ.ב. הופך פחות שופע בראש הממשלה, מה שמוריד את היכולת האונקוגנית של חלבוני איתות37.
לעומת זאת, ביטוי יתר ORP5 נראה לקדם פלישה לתאים סרטניים ותהליכים גרורתיים38. לכן, שינויים בפעילות ORP5/8 יכולים לשנות באופן חמור את ההתנהגות התאית באמצעות שינויים בהומאוסטזיס השומנים. יתר על כן, ORP5 ו- ORP8 תופסים אתרי קשר עם ER-mitochondria ושומרים על כמה פונקציות מיטוכונדריאליות, אולי על ידי אספקת PS39. בנוסף, ORP5 לוקליזציה לאתרי קשר טיפת שומנים ER כדי לספק PS טיפות שומנים על ידי PS / PI(4)P exchange40. האסטרטגיה המתוארת בזאת למדידת (i) PS ו- PI(4)P מיצוי ליפוזומים ו- (ii) טרנספורט PS ו- PI(4)P בין ליפוזומים הומצאה כדי להקים ולנתח את פעילות החליפין PS/PI(4)P של Osh6p/Osh7p12,32 ומשמשת קבוצות אחרות לניתוח הפעילות של ORP5/ORP835 ו- LTPs אחרים10, 41. הוא מבוסס על השימוש בקורא לוחות פלואורסצנטי, ספקטרופלואורומטר סטנדרטי בפורמט L, ושני חיישנים פלואורסצנטיים, NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP, שיכולים לזהות PS ו- PI(4)P, בהתאמה.
NBD-C2לקט מתאים לתחום C2 של הגליקופרוטאין, לקטדרין, שהופצה מחדש כדי לכלול ציסטאין ייחודי חשוף ממס ליד אתר כריכת נ.ב. המשוער; פלואורופור NBD רגיש לקטבים (7-ניטרבנז-2-אוקסה-1,3-דיאזול) מקושר באופן קוולנטי לשאריות אלה(איור 1A)12. ליתר דיוק, תחום C2 של לקטדהרין (Bos taurus, UniProt: Q95114, שאריות 270-427) שוכפל לווקטור pGEX-4T3 שבא לידי ביטוי בהיתוך עם גלוטתיון S-transferase (GST) ב Escherichia coli. רצףה-C2 לקט עבר מוטציה כדי להחליף שני שאריות ציסטאין נגישות לממס (C270, C427) בשאריות אלנין ולהכניס שאריות ציסטאין לאזור הסמוך לאתר כריכת PS הפואטי (מוטציה H352C) שניתן לתייג לאחר מכן עם N,N'-דימתיל-N-(iodoacetyl)-N'-(7-ניטרובנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl) אתילן דיאמין (IANBD) 12. אתר מחשוף עבור תרומבין קיים בין חלבון GST ואת N-terminus של תחום C2. יתרון מרכזי הוא כי דומיין זה מזהה באופן סלקטיבי PS באופן Ca2 +- עצמאי בניגוד לתחומים ידועים אחרים C2 או Annexin A542. NBD-PHFAPP נגזר מתחום PH של חלבון 4-פוספט-מתאם אנושי 1 (FAPP1), אשר היה מהוהה מחדש כדי לכלול ציסטאין אחד חשוף ממס שניתן לתייג עם קבוצת NBD ליד PI(4)P איגוד אתר(איור 1A)43. רצף הנוקלאוטידים של תחום ה- PH של חלבון FAPP האנושי (UniProt: Q9HB20, פלח שוק [1-100]) שוכפל לווקטור pGEX-4T3 שבא לידי ביטוי בד בבד עם תג GST. רצףFAPP PH שונה כדי להכניס שאריות ציסטאין ייחודי בתוך ממשק מחייב הממברנה של חלבון43. יתר על כן, מקשר תשע שאריות הוכנס בין אתר מחשוף תרומבין לבין N-terminus של דומיין PH כדי להבטיח נגישות לפרוטאז.
כדי למדוד מיצוי PS מליפוזומים, NBD-C2לקט מעורבב עם ליפוזומים עשוי פוספטידילכולין (PC) המכיל כמויות זעירות של PS. בשל זיקתו ל- PS, מבנה זה נקשר לליפוזומים, והפלואורופור של NBD חווה שינוי בקוטביות כשהוא בא במגע עם הסביבה ההידרופובית של הממברנה, אשר מעוררת שינוי כחול ועלייה בפלואורסצנטיות. אם נ.ב. מופק כמעט לחלוטין על ידי כמות סטויצ'יומטרית של LTP, הבדיקה אינה מקשרת עם ליפוזומים, ואות NBD נמוך יותר (איור 1B)32. הבדל זה באות משמש כדי לקבוע אם LTP(למשל, Osh6p) מחלץ PS. אסטרטגיה דומה משמשת עם NBD-PHFAPP למדידת PI(4)P חילוץ (איור 1B), כפי שתואר בעבר12,32. שתי מבחניות מבוססות FRET תוכננו (i) למדוד הובלת PS מ- LA ל- LB ליפוזומים, המחקים את קרום המיון ואת ראש הממשלה, בהתאמה, ו- (ii) תחבורה PI(4)P בכיוון ההפוך. בדיקות אלה מבוצעות באותם תנאים (כלומר, אותו חיץ, טמפרטורה וריכוז שומנים) כדי למדוד חילופי PS / PI(4)P. כדי למדוד הובלת PS, NBD-C2לקט מעורבב עם ליפוזומים LA המורכבים ממחשב אישי ומסומם עם 5 מול% PS ו -2 מול% של פוספטידילטנולמין פלואורסצנטי (Rhod-PE) ו LB ליפוזומים המשלבים 5 מול% PI(4)P.
בזמן אפס, FRET עם רוד-PE מרווה את פלואורסצנטיות NBD. אםנ.ב מועבר מ- LA ל- LB ליפוזומים ( למשל, עם הזרקת Osh6p), מתרחשת דהייה מהירה עקב טרנסלוקציה של מולקולותLact NBD-C2 מ- LA ל- LB ליפוזומים (איור 1C). בהתחשב בכמות ה- PS הנגיש, NBD-C2Lact נשאר למעשה במצב של קרום קשור במהלך הניסוי12. לכן, עוצמת האות NBD בקורלציה ישירה עם ההתפלגות של NBD-C2Lact בין LA ו LB ליפוזומים וניתן לנרמל בקלות כדי לקבוע כמה נ.ב. מועבר. כדי למדוד את ההעברה של PI(4)P בכיוון ההפוך, NBD-PHFAPP מעורבב עם ליפוזומים LA ו- LB; בהתחשב בכך שהוא נקשר רק ליפוזומים LB המכילים PI(4)P, אבל לא Rhod-PE, הפלואורסצנטיות שלה גבוהה. אם PI(4)P מועבר לליפוזומים מסוג LA, הוא מעביר את ה- ליפוזומים אלה, והאות פוחת עקב FRET עם Rhod-PE (איור 1C). האות מנורמל כדי לקבוע כמה PI(4)P מועבר43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-ציסטאין ו-GE; 97 % (מהשדה)&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>W326305-100G</td><td>הכן תמיסת מלאי L-ציסטאין של 10 מ"מ במים. האליקוטים מאוחסנים ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>C 2 מ"ל בקבוקון ענבר, PTFE/Rub Lnr, לאחסון שומנים ב-CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית בקוטר 4 מ"מ</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; מטהר KTA</td><td>GE healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td><td></td>אלומיניום</tr><tr><td>Amicon Ultra-15 עם MWCO של 3 ו-10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 עם MWCO של 3 ו-10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td></td><td></td><td>הכן תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל עם מים מסוננים ומעוקרים ואחסן אותה ב-20 & deg;C.</td></tr><tr><td>בסטטין</td><td>סיגמא</td><td>B8385-10 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>BL21 תאים מוכשרים זהב</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) ב-CHCl3 (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>ממיסים 1 מ"ג של אבקת C16:0/C16:0-PI(4)P ב-250 ומיקרו; L של MeOH ו-250 ומיקרו; L של CHCl3. לאחר מכן השלם עם CHCl3 עד 1 מ"ל. הפתרון חייב להתבהר.</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS (POPS) ב-CHCl3 (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) ב-CHCl3 (25 מ"ג/מ"ל)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td></td><td>הכינו תמיסת מלאי CaCl2 10 מ"מ במים.</td></tr><tr><td>משבש תאים</td><td>דינמיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קבועה כלורופורם (CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr> מים <tr><td>נטולי יונים (Milli-Q)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתילפורממיד (DMF), נטול מים, >99% טהור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse I רקומביננטי, ללא RNAse, באבקה</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>הכן תמיסת מלאי DTT 1 M במי Milli-Q.&nbsp; הכן 1 מ"ל אליקוטים ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>עמודות כרומטוגרפיה אקונו-פאק (1.5 ופעמים; 12 ס"מ).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>קובטת אלקטרופורציה 2 מ"מ</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור זווית קבועה Ti45 ו-Ti45 צינורות</td><td>בקמן</td><td>מסתובב את הליזטים</td><td></td>הבטאריאליים</tr><tr><td>מזרקי זכוכית (10, 25 ו-50 ומיקרו; L) לניסוי פלואורסצנטי</td> מזרקי זכוכית <td>המילטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(25, 100, 250, 500 ו-1000 ומיקרו; L) לטיפול בתמיסות מלאי שומנים</td><td>המילטון</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>גלוטתיון ספרוז 4B חרוזים</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול (99% טהור)</td> <td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>צינורות המוליזה עם מכסה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, >99% טהור</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra NAP 10 עמוד התפלה</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>הכן תמיסת מלאי IPTG של 1 M ב-Milli-Qwater. הכן 1 מ"ל אליקוטים ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>K-אצטט</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB מדיום מרק ללא גלוקוז</td><td></td><td></td><td>מוכן עם מי מילי Q ועובר חיטוי.</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>לינדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול (MeOH) &ge; 99.8%</td> <td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>הכן תמיסה של 2 מ' MgCl2. סנן את התמיסה באמצעות 0.45 & micro; מסנן M.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microplate 96 Well PS F-Botom שחור לא מחייב</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>מיני מכבש עם שני מזרקי המילטון אטומים לגז 1 מ"ל</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות פלואורסצנטי מבוסס מונוכרומטור</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td></td><td>ממיסות 25 מ"ג של IANBD ב-2.5 מ"ל של דימתיל-סולפוקסיד (DMSO) ומכינים 25 מנות של 100 ומיקרו; L בצינורות פקק בורג של 1.5 מ"ל. אל תבריג את המכסה לחלוטין. לאחר מכן, הסר DMSO במייבש הקפאה כדי לקבל 1 מ"ג IANBD יבש לכל שפופרת. הצינורות סגורים ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C בחושך.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ NaH<תת>2</תת>PO<תת>4</תת>, 1.8 מ"מ KH<תת>2</תת>PO<תת>4, אוטוקלאב ומאוחסן ב-4&&deg;C.</td></tr><tr><td>צלוחיות זכוכית בצורת אגס (25 מ"ל, 14/23, זכוכית דוראן)</td>קבוצת <td>דוראן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין</td><td>סיגמא</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plasmid</td><td></td><td></td><td>זמין על פי בקשה מהמעבדה שלנו</td></tr><tr><td>pGEX-PHFAPP פלסמיד</td><td></td><td></td><td>זמין על פי בקשה מהמעבדה שלנו</td></tr><tr><td>פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) &ge; 98.5% (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>הכן תמיסת מלאי PMSF של 200 מ"מ במסנני פוליקרבונט איזופרופנול</td></tr><tr><td>פוספורמידון</td><td>סיגמא</td><td>R7385-10 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>(קוטר 19 מ"מ) בגודל נקבוביות של 0.2 ומיקרו; m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>עמודת כרומטוגרפיה Poly-Prep (עם נפח מיטה של 0-2 מ"ל ומאגר של 10 מ"ל)</td> <td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Prefilters (קוטר 10 מ"מ).</td><td>ליפידים קוטביים של Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>בניית המודלים התלת-ממדיים של החלבונים (איור 1A)</td></tr><tr><td>קובטה קוורץ עבור UV/פלואורסצנטיות גלויה (נפח מינימלי של 600 ומיקרו; L)</td> <td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz cuvettes</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת&nbsp; מאייד סיבובי Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריגוג עם מכסה בורג (1.5 מ"ל)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מוט ערבוב PFTE מגנטי קטן (5 ופעמים; 2 מ"מ)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צינורות מיקרוצנטריגוג עם מכסה הצמד (0.5, 1 ו-2 מ"ל)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO תפוז</td><td></td><td></td><td>כתם פלואורסצנטי לזיהוי חלבון בג'ל SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THROMBIN, מפלזמה אנושית</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>ממיסים 20 יחידות ב-1 מ"ל מים מילי-Q ומכינים 25 ומיקרו; L מכילות בצינורות אפנדורף של 0.5 מ"ל. לאחר מכן מקפיאים ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Tris, אולטרה טהור</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה L90K</td><td>בקמן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV / ספיגה גלויה</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV / ספקטרופלואורומטר גלוי עם מחזיק תא מבוקר טמפרטורה ומכשיר ערבוב</td><td>Jasco או Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 או Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td> <td>ואקום</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK 16/70 עמוד עמוס Sephacryl S200HR</td><td>GE בריאות</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

לאחרונה נמצאו מספר חברים במשפחת החלבון המחייב אוקסיסטרול (OSBP) (ORP)/OSBP(Osh) המייצגים קבוצת חלבון העברת שומנים חדשני (LTP) בשמרים ובתאים אנושיים. הם מעבירים פוספטידילסרין (PS) מן reticulum אנדופלסמי (ER) לקרום הפלזמה (PM) באמצעות PS / פוספטידילינוזיטול 4-פוספט (PI(4)P) מחזורי חילופי. ממצא זה מאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו נ.ב., שהוא קריטי לתהליכי איתות, מופץ ברחבי התא וחקירת הקשר בין תהליך זה לבין חילוף החומרים של פוספינוסיטיד (PIP). הפיתוח של פרוטוקולים חדשים המבוססים על פלואורסצנטיות סייע בגילוי ואפיון של מנגנון תאי חדש זה במבחנה ברמה המולקולרית. מאמר זה מתאר את הייצור והשימוש בשני חיישני שומנים מתויגים פלואורסצנטית, NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP, כדי למדוד את היכולת של חלבון לחלץ PS או PI(4)P ולהעביר שומנים אלה בין ממברנות מלאכותיות. ראשית, הפרוטוקול מתאר כיצד לייצר, לתייג ולקבל דגימות טוהר גבוה של שני מבנים אלה. שנית, מאמר זה מסביר כיצד להשתמש בחיישנים אלה עם קורא מיקרו-לוח פלואורסצנטי כדי לקבוע אם חלבון יכול לחלץ PS או PI(4)P ליפוזומים, באמצעות Osh6p כמקרה מבחן. לבסוף, פרוטוקול זה מראה כיצד למדוד במדויק את הקינטיקה של PS / PI(4)P להחליף בין ליפוזומים של הרכב שומנים מוגדרים כדי לקבוע את שיעורי העברת השומנים על ידי העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET) באמצעות פלואורומטר סטנדרטי.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> איור 1: תיאור חיישני השומנים הפלואורסצנטיים ובבדיקות במבחנה. (A)דגמים תלת-ממדיים של NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP המבוססים על מבנה הגביש של תחום C2 של לקטדרין בקר (מזהה PDB: 3BN648)ומבנה NMR של תחום ה- PH של חלבון FAPP1 האנושי (מזהה PDB: 2KCJ46). N,N'-דימתיל-<...

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

שיטה זו משתמשת בפלואורסצנטיות כדי לקבוע אם העברת חלבון לליקידים חשובים ביולוגית בין ממברנה סינתטית ובכך תורמת להפצת שומנים אלה בתוך תאים אאוקריוטים. טכניקה זו מאפשרת מיצוי והובלה של שומנים טבעיים על ידי חלבון, זה דורש ותאי פלואורסצנטיות וליפוזומים שקל לעשות. שיטה זו יכולה לשמש ולשנות כדי לקבל תובנה על ביולוגיה תאית על ידי חלבונים מאחורי התפלגות של כמה שומנים חיוניים בין איברים וממברנות.הדגמה חזותית היא קריטית כדי להסביר כיצד לבצע מדידות בזמן אמת של העברת שומנים על ידי פלואורסצנטיות. אז מדגים את ההליך יהיה גם מוד Magdeleine, מהנדס למעבדה שלי. התחל על ידי הכנת חיץ אשלגן אצטט HEPES טרי מסונן ללא גז, בתוספת כלוריד מגנזיום מילימולרי אחד כדי ליצור חוצץ HKM.לאחר מכן, להכין ליפוזומים עשוי רק של מחשב או מסומם בנוסף עם שני PS אחוז טוחנות או PI(4)P. עכשיו, מניחים את הבקבוקון על מאייד סיבובי כדי לייבש את השומנים תחת ואקום. בבאר אחת, לערבב ליפוזומים המכילים שני PS אחוז טוחן עם חיישן שומנים בדם, NBD-C2 Lact, לריכוז סופי של 250 ננומולר ונפח של 100 microliters.מלאו באר שנייה באותה כמות של ליפוזום והלק NBD-C2 מעורבב עם שלושה חלבון העברת שומנים מיקרומולרי או LTP. מלאו באר שלישית עם 250 הנקה NBD-C2 ננו-מולרי מעורבב עם ליפוזומים טהורים של 80 מיקרומולרים PC ובאר רביעית עם ליפוזומים טהורים של 80 מיקרומולרים למחשב. חזור על שלבים אלה כדי להכין שלוש סדרות נוספות של ארבע בארות.לאחר מכן מניחים את הצלחת הרב-בארית בקורא הפלואורסצנטיות. עבור כל שיא באר ספקטרום NBD מ 505 עד 650 ננומטר עם רוחב פס חמישה ננומטר על עירור ב 490 ננומטר ב 25 מעלות צלזיוס. עבור כל סדרה להחסיר את הספקטרום שנרשם רק עם ליפוזומים מן הספקטרום האחר.עבור PI(4)P חילוץ אסאי להכין ליפוזומים מסוממים עם שני אחוז טוחן פוספטידילינוזיטול-4-פוספט ולבצע מדידות עם NBD-PH FAPP בדיקה. בצע ניסויי בקרה וקבע את אחוז החילוץ. לאחר סיום ליפוזומים בולטים למלא צינור עם ליפוזומים אלה extruded.הכן חיץ HKM טרי ללא גז ומסונן ושמור על הצינורות המכילים ליפוזומים בולטים בטמפרטורת החדר. לעטוף צינורות המכילים ליפוזומים עם רודמין שכותרתו פוספטידילטנולמין בנייר אלומיניום ולאחסן אותם בקופסה אטומה כדי למנוע הלבנת תמונה. הגדר את הטמפרטורה בין 25 ל 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את מונוכרום העירור ל 460 ננומטר עם רוחב פס קצר של אחד עד שלושה ננומטר ופליטה ל 530 ננומטר עם רוחב פס גדול של יותר מ 10 ננומטר.הגדר את זמן הרכישה לעשרים וחמש דקות עם רזולוציית הזמן של לכל היותר שנייה אחת. בקוורץ cuvette לדלל 30 microliters של השעיית ליפוזום LA ופתרון מלאי Lact NBD-C2 חיץ HKM לפני המלחמה כדי להכין דגימת microliter 570 המכיל 200 שומנים סה"כ micromolar ו 250 ננומולר או NBD-C2 הנקה. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי קטן וממקמים את הקובט במחזיק הפלואורומטר.ברגע המדגם הוא ערך תרמית להפעיל את המדידה. לאחר דקה אחת, להוסיף 30 microliters של השעיית ליפוזום LB לדגימה. לאחר שלוש דקות להזריק LTP לתוך המדגם, כך הריכוז הסופי של LTP הוא 200 nanomolar, ולאחר מכן לרכוש את האות עבור 21 הדקות הנותרות.בצע ניסוי מקביל כדי לנרמל את אות NBD. מערבבים 30 מיקרוליטרים של השעיית ליפוזום שיווי המשקל בלוס אנג'לס עם 250 ננו-מולר NBD-C2 הנקה במאגר HKM בנפח סופי של 570 מיקרוליטרים. לאחר דקה אחת, להזריק 30 microliters של השעיית ליפוזום שיווי משקל LB.המר את העקומות הקינטיות שנמדדו עם LTP של עניין כדי לקבוע את כמות PS שהועברה מלוס אנג'לס לליפוזומים LB לאורך זמן. לאחר מכן נרמל כל נקודת נתונים של העקומה. בצע את ניסוי PI(4)P באמצעות אותן הגדרות ותנאים של פולט רצפה באשר לבדיקת העברת PS.בקובט, מערבבים 30 מיקרוליטרים של מתלה ליפוזום lb ובדיקת FAPP NBD-PH עם חוצץ HKM מחומם מראש כדי להשיג נפח סופי של 570 מיקרוליטרים. לאחר שהשוויון התרמי של המדגם מגיע, התחל את המדידה. לאחר דקה אחת, להזריק 30 microliters של השעיית ליפוזום LA.לאחר שלוש דקות, להזריק את LTP של עניין ולהקליט את האות. בצע ניסוי שני כדי לנרמל את אות NBD. ערבבו 30 מיקרוליטרים של השעיית ליפוזום שיווי משקל ליברות עם 250 ננו-מולר NBD-PH FAPP ו-570 מיקרוליטרים של חוצץ HKM.לאחר דקה אחת, להזריק 30 microliters של השעיית ליפוזום שיווי משקל LA. המר את העקומות הקינטיות כדי לקבוע את כמות ה- PI(4)P המועבר מ- LB לליפוזומים בלוס אנג'לס לאורך זמן, ולאחר מכן נרמל כל נקודת נתונים. כדי לכמת את מידת היעילות של LTP.בצע רגרסיה ליניארית של נקודות הנתונים הראשונות של קינטיקה ההעברה כדי להשיג שיפוע. חלק את ערך השיפוע על ידי ריכוז LTP בתערובת התגובה כדי לקבוע את מספר מולקולות השומנים שהועברו לכל חלבון ליחידת זמן. התאוששות יעילה של Lact C2 מן החרוזים אומתה עם ניתוח דף SDS.ספקטרום הספיגה הנראה האולטרה סגול של Lact C2 המסומן ב- NBD אישר כי כל מולקולות הלק C2 סומנו עם קבוצת NBD. הטוהר של הנקה NBD-C2 והפלואורסצנטיות שלו נקבעו על ידי ניתוח דף SDS. הפלואורסצנטיות של NBD-C2 לקט או NBD-PH FAPP הייתה מקסימלית כאשר רק ליפוזומים המכילים PS או PI(4)P שימשו לדגירה, מה שמצביע על כך החיישן היה קשור לממברנה.פלואורסצנטיות נמוכה נראתה כאשר Osh6p היה גם נוכח המציין כי חלבון זה ביעילות מופק PS או PI(4)P מליפוזומים. התוצאות מביקורת העברת PS באמצעות Osh6p כ- LTP מוצגות. העקומות הקינטיות הממוצעות של העברת PS מליגוזומים בלוס אנג'לס לליפוזומים LB, מסוממים, או לא מסוממים עם פוספטידילינוזיטול-4-פוספט חושבו.קצב הובלת ה-PS ההתחלתי הממוצע נקבע משלושה ניסויים נפרדים. באופן דומה, תוצאות מבוחן העברת PI(4)P באמצעות Osh6p כ- LTP מוצגות כאן. יחד עם העקומות הקינטיות הממוצעות המתקבלות לאחר נורמליזציה של אותות.שיעורי העברה ממוצעים נמדדו עם ליפוזומים בלוס אנג'לס שהיו מסוממים או לא מסוממים עם נ.ב. בעת ביצוע פרוטוקול זה השתמש במאגר חדש והכן את אותם ימים. מזערו את התערוכה הקלה של ליפוזומים וחלבונים פלורסנטיים, השתמשו בחלבון שכותרתו NBD מטוהר היטב ושמרו אותם על קרח. ניתן לאשר על ידי מדידת PS ו PI(4)P העברה בין אברון בתוך התא prokaryotic באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית.טכניקה זו סוללת דרך להבנה טובה יותר של PS ו- PI(4) מופצים בתוך התא, ופעילותם עוברת ייחודיות של מספר LTPS.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד בתבנית מיקרופלואידית באמצעות בדיקת אפנון pH, באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH המתויג לשומנים פוספטידיל-אתנולמין של דו-שכבה ליפידית נתמכת, הנקראת פלטפורמה מיקרופלואידית. המודולציות ב- pH לאחר קשירת חלבון לפוספוליפידים גורמות למרווה פלואורסצנטית.

בדיקת אפנון pH על שכבות שומנים נתמכות לזיהוי אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת הדיפוזיה הרוחבית של מין פעיל על פני השטח בממשק נוזל-נוזל על ידי מיזוג חד-שכבת טיפה על חד-שכבה שטוחה.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

אנו מתארים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית למדידת ערבול פוספוליפידים בליפוזומים חד-צדדיים גדולים שהורכבו מחדש עם אופסין.

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

פרוטוקול זה מציג שיטת הדמיה פלואורסצנטית המשתמשת במחלקה של פלואורופורים ליפידים רגישים ל- pH כדי לעקוב אחר תנועת קרום השומנים במהלך אקסוציטוזה של התא ומחזור האנדוציטוזה.

מדידת תחלופת שומנים בממברנה עם ND6 אנלוגי פלואורסצנטי רגיש ל- pH

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

אנו מתארים שיטה לשימוש בציקלודקסטרין כדי לתווך חילופי שומנים של קרום הפלזמה עם ליפידים אקסוגניים. ניתן לשלב טכניקה זו עם ניסויים החוקרים חלבונים טרנסממברניים, המתנהגים באופן שונה בסביבות דמויות רפסודת שומנים מאשר בסביבות שאינן דמויות רפסודה.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

למד שיטות פלואורסצנטיות למדידת העברת פוספטידילסרין ופוספטידילינוזיטול 4-פוספט על ידי חלבוני העברת ליפידים כמו Osh6p בין ממברנות סינתטיות.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

גלה סרטונים נוספים