מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

שיטה זו משתמשת בפלואורסצנטיות כדי לקבוע אם העברת חלבון לליקידים חשובים ביולוגית בין ממברנה סינתטית ובכך תורמת להפצת שומנים אלה בתוך תאים אאוקריוטים. טכניקה זו מאפשרת מיצוי והובלה של שומנים טבעיים על ידי חלבון, זה דורש ותאי פלואורסצנטיות וליפוזומים שקל לעשות. שיטה זו יכולה לשמש ולשנות כדי לקבל תובנה על ביולוגיה תאית על ידי חלבונים מאחורי התפלגות של כמה שומנים חיוניים בין איברים וממברנות.

הדגמה חזותית היא קריטית כדי להסביר כיצד לבצע מדידות בזמן אמת של העברת שומנים על ידי פלואורסצנטיות. אז מדגים את ההליך יהיה גם מוד Magdeleine, מהנדס למעבדה שלי. התחל על ידי הכנת חיץ אשלגן אצטט HEPES טרי מסונן ללא גז, בתוספת כלוריד מגנזיום מילימולרי אחד כדי ליצור חוצץ HKM.

לאחר מכן, להכין ליפוזומים עשוי רק של מחשב או מסומם בנוסף עם שני PS אחוז טוחנות או PI(4)P. עכשיו, מניחים את הבקבוקון על מאייד סיבובי כדי לייבש את השומנים תחת ואקום. בבאר אחת, לערבב ליפוזומים המכילים שני PS אחוז טוחן עם חיישן שומנים בדם, NBD-C2 Lact, לריכוז סופי של 250 ננומולר ונפח של 100 microliters.

מלאו באר שנייה באותה כמות של ליפוזום והלק NBD-C2 מעורבב עם שלושה חלבון העברת שומנים מיקרומולרי או LTP. מלאו באר שלישית עם 250 הנקה NBD-C2 ננו-מולרי מעורבב עם ליפוזומים טהורים של 80 מיקרומולרים PC ובאר רביעית עם ליפוזומים טהורים של 80 מיקרומולרים למחשב. חזור על שלבים אלה כדי להכין שלוש סדרות נוספות של ארבע בארות.

לאחר מכן מניחים את הצלחת הרב-בארית בקורא הפלואורסצנטיות. עבור כל שיא באר ספקטרום NBD מ 505 עד 650 ננומטר עם רוחב פס חמישה ננומטר על עירור ב 490 ננומטר ב 25 מעלות צלזיוס. עבור כל סדרה להחסיר את הספקטרום שנרשם רק עם ליפוזומים מן הספקטרום האחר.

עבור PI(4)P חילוץ אסאי להכין ליפוזומים מסוממים עם שני אחוז טוחן פוספטידילינוזיטול-4-פוספט ולבצע מדידות עם NBD-PH FAPP בדיקה. בצע ניסויי בקרה וקבע את אחוז החילוץ. לאחר סיום ליפוזומים בולטים למלא צינור עם ליפוזומים אלה extruded.

הכן חיץ HKM טרי ללא גז ומסונן ושמור על הצינורות המכילים ליפוזומים בולטים בטמפרטורת החדר. לעטוף צינורות המכילים ליפוזומים עם רודמין שכותרתו פוספטידילטנולמין בנייר אלומיניום ולאחסן אותם בקופסה אטומה כדי למנוע הלבנת תמונה. הגדר את הטמפרטורה בין 25 ל 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את מונוכרום העירור ל 460 ננומטר עם רוחב פס קצר של אחד עד שלושה ננומטר ופליטה ל 530 ננומטר עם רוחב פס גדול של יותר מ 10 ננומטר.

הגדר את זמן הרכישה לעשרים וחמש דקות עם רזולוציית הזמן של לכל היותר שנייה אחת. בקוורץ cuvette לדלל 30 microliters של השעיית ליפוזום LA ופתרון מלאי Lact NBD-C2 חיץ HKM לפני המלחמה כדי להכין דגימת microliter 570 המכיל 200 שומנים סה"כ micromolar ו 250 ננומולר או NBD-C2 הנקה. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי קטן וממקמים את הקובט במחזיק הפלואורומטר.

ברגע המדגם הוא ערך תרמית להפעיל את המדידה. לאחר דקה אחת, להוסיף 30 microliters של השעיית ליפוזום LB לדגימה. לאחר שלוש דקות להזריק LTP לתוך המדגם, כך הריכוז הסופי של LTP הוא 200 nanomolar, ולאחר מכן לרכוש את האות עבור 21 הדקות הנותרות.

בצע ניסוי מקביל כדי לנרמל את אות NBD. מערבבים 30 מיקרוליטרים של השעיית ליפוזום שיווי המשקל בלוס אנג'לס עם 250 ננו-מולר NBD-C2 הנקה במאגר HKM בנפח סופי של 570 מיקרוליטרים. לאחר דקה אחת, להזריק 30 microliters של השעיית ליפוזום שיווי משקל LB.

המר את העקומות הקינטיות שנמדדו עם LTP של עניין כדי לקבוע את כמות PS שהועברה מלוס אנג'לס לליפוזומים LB לאורך זמן. לאחר מכן נרמל כל נקודת נתונים של העקומה. בצע את ניסוי PI(4)P באמצעות אותן הגדרות ותנאים של פולט רצפה באשר לבדיקת העברת PS.

בקובט, מערבבים 30 מיקרוליטרים של מתלה ליפוזום lb ובדיקת FAPP NBD-PH עם חוצץ HKM מחומם מראש כדי להשיג נפח סופי של 570 מיקרוליטרים. לאחר שהשוויון התרמי של המדגם מגיע, התחל את המדידה. לאחר דקה אחת, להזריק 30 microliters של השעיית ליפוזום LA.

לאחר שלוש דקות, להזריק את LTP של עניין ולהקליט את האות. בצע ניסוי שני כדי לנרמל את אות NBD. ערבבו 30 מיקרוליטרים של השעיית ליפוזום שיווי משקל ליברות עם 250 ננו-מולר NBD-PH FAPP ו-570 מיקרוליטרים של חוצץ HKM.

לאחר דקה אחת, להזריק 30 microliters של השעיית ליפוזום שיווי משקל LA. המר את העקומות הקינטיות כדי לקבוע את כמות ה- PI(4)P המועבר מ- LB לליפוזומים בלוס אנג'לס לאורך זמן, ולאחר מכן נרמל כל נקודת נתונים. כדי לכמת את מידת היעילות של LTP.

בצע רגרסיה ליניארית של נקודות הנתונים הראשונות של קינטיקה ההעברה כדי להשיג שיפוע. חלק את ערך השיפוע על ידי ריכוז LTP בתערובת התגובה כדי לקבוע את מספר מולקולות השומנים שהועברו לכל חלבון ליחידת זמן. התאוששות יעילה של Lact C2 מן החרוזים אומתה עם ניתוח דף SDS.

ספקטרום הספיגה הנראה האולטרה סגול של Lact C2 המסומן ב- NBD אישר כי כל מולקולות הלק C2 סומנו עם קבוצת NBD. הטוהר של הנקה NBD-C2 והפלואורסצנטיות שלו נקבעו על ידי ניתוח דף SDS. הפלואורסצנטיות של NBD-C2 לקט או NBD-PH FAPP הייתה מקסימלית כאשר רק ליפוזומים המכילים PS או PI(4)P שימשו לדגירה, מה שמצביע על כך החיישן היה קשור לממברנה.

פלואורסצנטיות נמוכה נראתה כאשר Osh6p היה גם נוכח המציין כי חלבון זה ביעילות מופק PS או PI(4)P מליפוזומים. התוצאות מביקורת העברת PS באמצעות Osh6p כ- LTP מוצגות. העקומות הקינטיות הממוצעות של העברת PS מליגוזומים בלוס אנג'לס לליפוזומים LB, מסוממים, או לא מסוממים עם פוספטידילינוזיטול-4-פוספט חושבו.

קצב הובלת ה-PS ההתחלתי הממוצע נקבע משלושה ניסויים נפרדים. באופן דומה, תוצאות מבוחן העברת PI(4)P באמצעות Osh6p כ- LTP מוצגות כאן. יחד עם העקומות הקינטיות הממוצעות המתקבלות לאחר נורמליזציה של אותות.

שיעורי העברה ממוצעים נמדדו עם ליפוזומים בלוס אנג'לס שהיו מסוממים או לא מסוממים עם נ.ב. בעת ביצוע פרוטוקול זה השתמש במאגר חדש והכן את אותם ימים. מזערו את התערוכה הקלה של ליפוזומים וחלבונים פלורסנטיים, השתמשו בחלבון שכותרתו NBD מטוהר היטב ושמרו אותם על קרח. ניתן לאשר על ידי מדידת PS ו PI(4)P העברה בין אברון בתוך התא prokaryotic באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית.

טכניקה זו סוללת דרך להבנה טובה יותר של PS ו- PI(4) מופצים בתוך התא, ופעילותם עוברת ייחודיות של מספר LTPS.