חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

פרוטוקול זה מאפשר לחקור את המורפולוגיה העדינה של נוירונים ברשתית ויכול לתת תובנה על השינויים המורפולוגיים התאיים והתת-תאיים המתרחשים במצבי מחלה. שיטה זו משפרת באופן משמעותי את השקיפות האופטית של הרשתית ומאפשרת הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה, חיווט מעגלים ומבנים תאיים תת-תאיים עדינים של נוירונים ברשתית בהכנת רשתית הורמונלית. לאכוף את עיני העכבר עם מלקחיים מעוגלים ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי קטנה עם 0.1 M PBS.

לתקוע חור קטן לאורך צומת סקלרה הקרנית עם המחט מתחת למיקרוסקופ הניתוח, ולאחר מכן להעביר את העין לתוך 4% כוח פורמלדהיד במשך שעה אחת. מעבירים את העין בחזרה למנה עם PBS. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להשתמש מספריים ניתוח לחתוך את כל הדרך סביב צומת Corneoscleral.

מוציאים את הקרנית והעדשה. ואז לחתוך אותו בבסיס עצב הראייה בזהירות לקלף את הסקלרה עם מלקחיים כדי לבודד את הרשתית. בצע ארבעה חתכים קטנים באופן שווה סביב הרשתית ולהשתמש מברשת קצה דק טבול PBS להניח אותו שטוח GCL בצד למטה בצורה דמוית תלתן על חתך מרובע קטן מנייר מסנן nitrocellulose.

להרים את הפינה של נייר nitrocellulose עם מלקחיים ומניחים אותו בצלחת 48 היטב עם 4% כוח פורמלדהיד במשך שעה אחת, ולאחר מכן להעביר את נייר המסנן הרשתית לבאר עם PBS ולשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. להפשיר פתרון A4P0 על קרח. לאחר מכן העבירו את הרשתית לתמיסת A4P0 ודגרו בן לילה בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.

מוסיפים שמן צמחי לבאר כדי לכסות לחלוטין את פתרון A4P0. דגירה באמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות ללא רעידות. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף.

דגירה הרשתית ב 10% נתרן דודקיל סולפט ב 40 מעלות צלזיוס במשך יומיים עם טלטול עדין ולאחר מכן להעביר את נייר המסנן רשתית PBS עם טריטון X-100 ולשטוף חמש פעמים במשך 90 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה הסופית, יש לאחסן את הרשתית ב-4 מעלות צלזיוס ב-PBS-T עם 0.01% נתרן אזיד או לעבור ישירות לכתמים אימונו. מוציאים את הרשתית מנייר הסינון על ידי קילוף עדין עם מברשת קצה עדינה ב-PBS-T.

דגירה בנוגדן ראשוני מדולל בתמיסת חסימה במשך יומיים ב 40 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות. לאחר הדגירה, לשטוף חמש פעמים במשך 90 דקות PBS-T. דגירה הרשתית עם נוגדנים משניים מתאימים מדוללים בחסימת פתרון במשך יומיים ב 40 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות.

הגן על הדגימות מפני אור לאורך שארית ההליך. לשטוף את הרשתית חמש פעמים במשך 90 דקות ב 0.02 M חוצץ פוספט. לבסוף דגירה הרשתית בתמיסת אינדקס שבירה מבוססת סורביטול ב 40 מעלות צלזיוס לילה עם רעידות עדינות.

מיתאר תגית כיסוי זכוכית עם סמן קבוע קצה דק כדי לסמן גבול מרובע בחלק האחורי של שקופית מיקרוסקופ זכוכית. הפוך את השקופית והשתמש במזרק כדי לעקוב אחר הגבול עם קו דק של גריז סיליקון בחזית השקופית. השאירו פער קטן בפינה אחת לפתרון הרכבה עודף לברוח.

מעבירים את הרשתית למרכז האזור התחום וממקמים אותה עם מברשת קצה עדינה כך שהיא שוכנת שטוחה עם הצד photoreceptor נגד שקופית הזכוכית. פיפט כ 60 microliters של sRIMS כך שהוא מכסה את הרשתית שטוחה משתרע על פינה אחת של המתחם. ודא כי הרשתית נשארת שטוחה במקומה.

החל את תלוש הכיסוי, החל מהפינה עם sRIMS ולאט לאט להוריד אותו עד שהוא נוגע בשמן מכל הצדדים. מניחים ערימה של שלוש תלושי כיסוי בכל צד של הרשתית המותקנת כמרווח. השתמש בקצה הארוך של שקופית אחרת כדי ללחוץ על שובר הכיסוי כך שההר יהיה שטוח ושווה.

אחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיה. התחל על ידי הצבת השקופית על שלב המיקרוסקופ ואיתור המדגם. כדי להשיג תמונות מוערמות Z של דגימות, התמקדו תחילה באות בכל ערוץ בנפרד וקבעו את זמן החשיפה או מהירות הסריקה למיקרוסקופים פלואורסצנטיים או קונפוקליים בהתאמה.

הגדר את הטווח עבור מחסנית Z על-ידי הגדרה ידנית של מישור המוקד בחלק העליון והתחתון של הטווח הרצוי או על-ידי הגדרת נקודת האמצע ולאחר מכן ציון טווח סביב נקודת האמצע. התאימו את גודל הצעד או את מספר הפרוסות לפי הצורך. לכוד את התמונה ושמור את הקובץ המקורי.

לאחר מכן יוצא כקובץ TIF או כתבנית רצויה אחרת. השתמש בניתוח תמונה, תוכנה לבחירה כדי להתאים את הבהירות והניגודיות בכל ערוץ עד שיושג בהירות אופטימלית הן בתמונות הבודדות והן בעיבוד התלת מימדי של מחסנית Z. כאשר מעובד עם פרוטוקול CLARITY שונה שקיפות אופטית מלאה לאורך העובי של הרשתית נצפתה לעומת רשתית בקרה לא מעובדת.

תמונות מוערמות Z עבור קונוסים שכותרתו Arrestin ב- ONL, TH שכותרתו DAC של INL, ו RBPMS מסומן RGCs ב- GCL מוצגים כאן. המיקום היחסי של נוירונים לאורך כל עובי הרשתית נצפה בתמונה כיסוי. כתמי TH ובהירות מעובדים רטינות הר שלם הושווה עם תמונות שהתקבלו הכנה סטנדרטית.

דנדריטים ותהליכים דמויי אקסון של DACs התגלו בצורה ברורה יותר ברשתית מעובדת בהירות מאשר ברשתית סטנדרטית. תהליכים דמויי אקסון של DACs הציגו מבנים שלמים דמויי טבעת ברשתית בהירות בהשוואה לרשתית סטנדרטית. מבנים דמויי טבעת של רשתית CLARITY שנלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי היו כמעט זהים לאלה שנצפו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

התהליכים דמויי האקסון רצו גם לכיוון הרשתית החיצונית. חיסון מכתים נגד GluA2 ו PSD-95 הראו puncta ברור, חושף GluA2 בודדים המכילים קולטני אמפא ואתרים סינפטיים פוסט putative פוסט, בהתאמה. תמונת שכבת-על הראתה ניקוב מסוים בתהליכי DAC.

הנקודות של לוקליזציה משותפת putative הוצגו XZ, YZ, ו XY מטוסים TH במשותף באופן ברור עם שניהם GluA2 ו PSD-95. חשוב כי הרשתית נשארת שטוחה במהלך תהליך פולמור הידרוג'ל, כך הרשתית פינה יכול לשכב שטוח עבור תהליך הרכבה והדמיה.