יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים
18 בפברואר 2021
מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.
שיטה זו מאפשרת לחוקרים להעריך אינטראקציות רקמות בין המוח הקדמי הבסיסי לבין הפנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מבודדת את המוח הקדמי הבסיסי להערכה ומונעת זיהום עם תאי פסגה עצבית, אשר יבלבל את הניתוח. החלק הקשה בטכניקה זו הוא הסרת המוח הקדמי מהפונדקאי והחלפתו ברקמת התורם.
מי שתדגים את ההליך תהיה דיאן הו, מדענית מחקר ממעבדתו של ד"ר ראלף מרקוצ'יו. כדי להתחיל, להכין מדיה DMEM עם אדום ניטרלי, פיפטה העברת זכוכית, טונגסטן מושחז. בעזרת מזרק 10 מיליליטר ומחט 18 מד, מוציאים 0.5 מיליליטר אלבומין מהקצה המחודד של קליפת הביצה.
צור חור קטן על גבי הקליפה באמצעות נקודת מספריים. לאחר מכן מניחים חתיכת סרט מעל החור וחותכים פתח עגול כדי לחשוף את העובר. מכתימים את העובר באדום נייטרלי.
קצור שתלי רקמה מהצד השמאלי של המוח הקדמי הבסיסי של שלב שבע או שמונה עוברים. השתמש מחטי טונגסטן מחודדות מעוקלות כדי לחתוך בעדינות חתיכה של המוח הקדמי. כדי לא לכלול את האנדודרם הבסיסי, החליקו את המחט מתחת למוח הקדמי ובמקביל לציר הצינור העצבי.
הרימו את השתל מהעובר התורם באמצעות פיפטת העברת הזכוכית, והעבירו אותו ל- DMEM המכיל אדום נייטרלי למשך שתי דקות כדי להכתים אותו. לאחר מכן הניחו את השתל המוכתם ב-DMEM שאינו מכיל אדום נייטרלי עד שהוא מוכן לקליטה. דוגרים על ביצים מופרות מתרנגולת לגהורן לבנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח עד לשלב המבורגר-המילטון בשלב שבע עד שמונה.
לחשוף עוברים כפי שהודגם בעבר. באמצעות מחטי טונגסטן מושחזות, הכינו את אתר השתל על ידי חיתוך ולאחר מכן הסרה של חתיכה בגודל 0.3 על 0.2 מילימטר של המוח הקדמי הבסיסי כדי להתאים לשתל. הימנע הפרעה מוגזמת של האנדודרם הבסיסי, אשר יהיה ניכר כמו גרגרי חלמון יתחילו לדלוף דרך כל קרע שנוצר.
לאחר העברת השתל לפונדקאי, מקם את השתל כך שיחליף את המוח הקדמי הבזאלי של המארח. מניחים נייר דבק בחוזקה מעל החור, ומחזירים את העוברים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח. בתחילה, כימרות נוצרו על ידי השתלת רקמות שליו לעוברי אפרוחים.
באמצעות נוגדן QCPN, תאי שליו הודגמו ונבדלו מהרקמות המארחות. מערכת אפרוח השליו אישרה כי כל השתל מורכב רק מרקמה עצבית ולא היה מזוהם עם סוגי תאים אחרים. השתלת רקמת שליו בעוברי ברווזים הובילה לעיוות חמור של כימרות עקב מוח שליו המתפתח מהר יותר.
לכן, בוצעה השתלת רקמות ברווז בעוברי תרנגולות. הכימרות המתקבלות כתוצאה מכך מצביעות על כך שהמוח משתתף בוויסות המורפולוגיה. הכלאה של הר שלם C2 שימשה להערכת ביטוי קיפוד סוניק בכימרות.
בדומה למורפולוגיה, ביטוי הקיפוד הסוניק בצד הברווז של הכימרה נראה דומה יותר לברווז. הכנת האתר המארח דורשת תרגול. מספר גדול של עוברים אינם שורדים, ולכן יצירת מספר גדול של כימרות יכולה לעזור להבטיח דגימות נאותות לניתוח.
שיטה זו אפשרה להעריך כיצד אותות מהמוח מעצבים את תחום הביטוי של קיפוד סוניק באזור האקטודרמלי הקדמי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה להשתלת רקמות המאפשרת לחוקרים להעריך אינטראקציות רקמתיות בין המוח הקדמי הבסיסלי (basal forebrain) לבין הפנים במהלך ההתפתחות הקראניו-פציאלית. השיטה מבודדת את המוח הקדמי הבסיסלי לצורך הערכה, ובכך מונעת זיהום בתאי רבב עצבי (neural crest cells).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- התפתחות קרניו-פציאלית
- טכניקות להשתלת רקמות
רקע
- המוח הקדמי הבזאלי (basal forebrain) ממלא תפקיד קריטי בהתפתחות הקרניו-פציאלית.
- הבנת האינטראקציות בין רקמות היא חיונית עבור הביולוגיה ההתפתחותית.
- זיהום של תאי רב רכס עצבי (neural crest cells) עלול להוביל לתוצאות מטעות בניתוח.
- בידוד המוח הקדמי הבזאלי מאפשר הערכה ברורה יותר של תכונות האותות שלו.
מטרת המחקר
- בדיקת תכונות האיתות והתבניות של המוח הקדמי הבזאלי (basal forebrain).
- פיתוח שיטה אמינה להשתלת רקמות.
- שיפור ההבנה של מנגנוני ההתפתחות הקרניו-פציאלית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מצע DMEM עם neutral red.
- שימוש בפיפטת העברה מזכוכית וטונגסטן מושחז.
- סילוק אלבומין מהקצה המחודד של קליפת הביצה באמצעות מזרק.
- החלפת המוח הקדמי של המאחס ברקמה מתורם.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מבודדת ביעילות את המוח הקדמי הבזאלי (basal forebrain) לצורך אנליזה.
- הדגמה של הפרוצדורה על ידי מדען מחקר.
- הערכה מוצלחת של אינטראקציות רקמתיות ללא זיהום.
- תובנות לגבי תפקידו של המוח הקדמי הבזאלי בהתפתחות הקרניו-פציאלית.
מסקנות
- טכניקת השתלה היא כלי בעל ערך לחקר ההתפתחות הקרניו-פציאלית.
- בידוד המוח הקדמי הבסיסי (basal forebrain) משפר את הדיוק של הערכות התפתחותיות.
- ניתן ליישם שיטה זו במחקרים נוספים בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של אותות רקמה בהתפתחות קרניו-פציאלית על ידי בידוד המוח הקדמי הבסיסי (basal forebrain) מתרומות מבלבלות של תאי הרבו נבט (neural crest). היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף המטרה (target validation) על ידי הבהרת האופן שבו אותות ממקור מוחי מווסתים מסלולים מורפוגנטיים, כגון Sonic hedgehog, באזור האקטודרמלי הפרונטו-נזאלי. גישה זו מספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת מסלולים התפתחותיים בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות לגבי אינטראקציות בין רקמות המוח לפנים בהתפתחות חולייתנים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות בידוד תכונות איתות של המוח הקדמי הבזאלי.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון ניבוי על ידי קישור מניפולציה של המוח הקדמי הבזאלי לשינויים בתחום הביטוי של SHH.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות כימרות מתוקפות להערכה כמותית של ביטוי מורפוגנים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של השתלת רקמות לקבלת תוצאות בדיקה הניתנות לשחזור בתנאים ניסיוניים שונים.
- יכולת הרחבה: מאפשר יצירה של כימרות רבות כדי להתגבר על שיעורי הישרדות נמוכים ולהבטיח חוסן אנליטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת תובנות מנגנוניות משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים של תבניתיות קרניו-פציאלית.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה רגולטורים במעלה הזרם של SHH, נתיב מרכזי במידול הפרעות מולדות.
- מערכת רלוונטית למחלה: משתמשת בכימרות של עופות כדי לחקור מנגנוני התפתחות פנים שמורים בחולייתנים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים, שבהם בדיקות של אינטראקציה עם רקמות מספקות מידע על רמת הביטחון במטרה לפני מאמצים לזיהוי תרכובות מובילות (leads).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מרכזי איתות במורפוגנזה קרניו-פציאלית.
- מוכנות לבדיקה: מייצר מערכות ביולוגיות סטנדרטיות לניתוח כמותי של ביטוי SHH.
- אנליטיקה: מאפשר ביצוע היברידיזציה in situ של דגימה שלמה למדידת שינויים בביטוי גנים מרחבי כתוצאה מרכזית.
- מחקר תרגומי: מספק רצף מכניסטי מהשתלת רקמה עצבית ועד לתוצאות של פנוטיפ פנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת תרומות ספציפיות של רקמות למסלולי התפתחות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד אותות מהמוח הקדמי הבזאלי בפיתוח הפנים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות טכניקות סטנדרטיות של השתלה והכנת המארח.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי הבהרת הרגולטורים השלישיה (upstream regulators) של מסלולים הניתנים לטיפול תרופתי כגון SHH.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס נתוני אינטראקציה מאומתים של רקמות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות במיקרו-כירורגיה ובמניפולציה של עוברי עופות.
- תלוי בכלים ייעודיים, הכוללים מחטי טונגסטן מחודדות ופיפטות העברה מזכוכית.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של דגירה וסיווג שלבי התפתחות עבור עוברי המאכסן והתורם.
- כולל אופטימיזציה של הכנת אתר ההשתלה כדי למנוע דליפת חלמון ולהבטיח את חיוניות המאכסן.
- מוגבל עקב שיעורי הישרדות נמוכים של עוברים, מה שמחייב מספר דגימות גבוה לצורך ניתוח מהימן.
