הערכת Nanocrystals בדרכי השתן בבני אדם באמצעות סידן פלואורופור תיוג וניתוח מעקב חלקיקים

פרוטוקול זה יכול לזהות במיוחד nanocrystals המכילים סידן בשתן אנושי. טכניקה זו עשויה להיות שימושית כדי לחזות שלבים מוקדמים של היווצרות אבן כליה, כמו גם מחלות אחרות הקשורות אוריאה גביש. הדגמת ההליך תהיה ד"ר פרוון קומאר, חוקרת IV במעבדה שלי.

יש למשתתפים לצרוך דיאטה דלת אוקסלט במשך שלושה ימים וצום לילה. לאחר מכן לאסוף דגימת שתן 24 שעות ביממה מהמשתתפים לפני שיש להם לצרוך עומס אוקסלט. להאכיל את המשתתפים עם שייק המכיל פירות וירקות שיש עומס oxalate של כשמונה מילימולים.

יש למשתתפים לאסוף את השתן שלהם במשך 24 שעות לאחר צריכת oxalate ולהחזיר אותו למחרת. יש לשמור על כל דגימות השתן בטמפרטורת החדר לפני העיבוד. למדוד ולתעד pH שתן ונפח של דגימות שתן.

מערבבים ביסודיות ומוסיפים 50 מיליליטר של שתן לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר חרוט. צנטריפוגה המדגם ב 1, 200 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה הספסל העליון. להשליך את supernatant, ואז לשטוף ו resuspend גלולה שוב עם חמישה מיליליטר של 100% אתנול.

צנטריפוגה המדגם ב 1, 200 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה הספסל העליון. השלך את supernatant ו resuspend גלולה במיליליטר אחד של 100% אתנול. אחסן את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר או המשך מיד עם הכתמת הדגימות.

לדלל 100 חלקיקי זהב בגודל ננומטר במים אולטרה-דקים ביחס של 1:1, 000 ולהשתמש בהם כדי לייעל את ההגדרות על המכשיר. לדלל את דגימות השתן 20 פעמים במים לפני הכתמת עם חמישה מילימולאר Fluo-4 AM במשך 30 דקות בחושך ולנתח את הדגימות באמצעות NTA. הכינו גבישי סידן אוקסלט וסידן פוספט כמתואר בכתב היד של הטקסט לפני ניתוח NTA.

הפעל את המחשב ואת המכשיר ולאחר מכן פתח את התוכנה והפעל את המצלמה. לחץ על סמל הלכידה בפינה הימנית העליונה של החלון כדי להפעיל את מצב הלכידה. נקה את הפלטפורמה על ידי שאיבת אוויר לתוכה תחילה באמצעות מזרק מיליליטר אחד עד שהפלטפורמה נראית נקייה.

מוסיפים בעדינות מים למנגנון פעמיים עד שלוש פעמים ומשתמשים במזרק מיליליטר נוסף להסרת בועות אוויר. לאחר שהפלטפורמה נקייה, מוסיפים מים ומחפשים זיהום על פני השטח על ידי צפייה במצלמה, ולאחר מכן מוסיפים חלקיקי זהב כפקד למזרק משאבת הטעינה לדוגמה כדי להגדיר את המכשיר. כוונן את רמת המצלמה על המסך או על הידית לצד ימין של המכשיר עד שהתמונה תתחיל להציג פיקסלים צבעוניים ולאחר מכן הקטן את רמת המצלמה.

לאחר מכן, כוונן את המסך כדי למטב את התמונה. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על תמונת הווידאו. החזק את לחצן העכבר השמאלי לחוץ וגרור את התמונה למעלה ולמטה כדי לקבל את התצוגה כולה.

הגדר את מהירות העירוי ומקד את המצלמה כך שננו-חלקיקי הזהב יהיו גלויים על מסך המצלמה. הגדר את מהירות העירוי לגבוהה עבור ההתקנה הראשונית כדי להבטיח את חלקיקי הזהב מזוהים. לאחר שזוהה, להפחית את המהירות ל 50 microliters לדקה כדי לדמיין חלקיקי זהב.

כוונן את רמת המצלמה כדי לדמיין את החלקיקים. לדגימות לא מוכתמות, כווננו את הגבר המסך ברמה חמש כדי להשיג את מוקד המצלמה ולהגדיר את רמת המצלמה לשמונה. לאחר הגדרת המוקד, רשום את הדוגמה.

לאחר אופטימיזציה, לנקות את המנגנון שוב עם מים לפני הערכת דגימות אחרות כדי להבטיח כי הצינור נקי וחלקיקים אינם נוכחים. כדי לנתח דגימות מוכתמות, התאימו את המצלמה למיקום המסנן המכיל את מסנן הפלואורסצנט המתאים וטענו דגימות מדוללות ומוכתמות על מזרק משאבת הטעינה לדוגמה, מה שמפחית את המהירות ל-20 מיקרוליטר לדקה לניתוח. כוונן את הגבר המסך לחמש ואת רמת המצלמה ל- 13.

שמור את הנתונים לאחר כל מדידה. חשב את המספר הממוצע של חלקיקים עבור כל חמש הקריאות עבור כל מדגם בנפרד ונתח את הנתונים באמצעות סטיית תקן או שגיאת תקן של הממוצע. השתמש בבדיקות T לניתוח מזווג.

Fluo-4 AM היה מסוגל להיקשר הן גבישי סידן אוקסלט, שהיו בין 50 ל 270 ננומטר בגודל היה ריכוז ממוצע של 1, 260 מיליון חלקיקים למיליליטר, וגבישי סידן פוספט, שהיו בין 30 ל 225 ננומטר והיה ריכוז ממוצע של 2, 220 מיליון חלקיקים למיליליטר. דגימות שתן 24 שעות ביממה שנאספו לפני עומס oxalate הכיל כמה nanocrystals השתן בין 110 ל 300 ננומטר בגודל. לעומת זאת, חלה עלייה משמעותית בננו-קריסטלים בדרכי השתן בדגימות פוסט-אוקסלט.

כדי לאשר את השחזור של השיטה, דגימות נמדדו שלוש פעמים ולא הייתה וריאציה משמעותית בשכפולים טכניים. בעת ניסיון לפרוטוקול זה, ייתכן שיהיה קושי מסוים בהוספת דגימות ללא בועות למחשב. כדי למנוע זאת, להוסיף אוויר ומים למכונה, ולאחר מכן לאט להוסיף דגימות.

כמו כן, הקפד לפקח ללא הרף על הדגימות שלך וכי אין בועות נוכח. שיטה חדשה זו תיבדק אצל אנשים עם מחלת אבן כליה סידן אוקסלט כדי לפקח על התקדמות המחלה ו / או לחזות סיכון אבן כליות.