Name: אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למדו איך לחקור את ההשפעות הפונקציונליות של מוטציות RYR1 בתאים שמקורם בחולים באמצעות לימפוציטים B ותאי לוויין שריר. שיטה זו מאפשרת הערכת הומאוסטזיס סידן ובדיקת טיפולים פוטנציאליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNF) ומקרן השרירים השוויצרית.

הפרוטוקולים המתוארים להלן תואמים את הנחיות האתיקה של Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. הכנת אפשטיין בר מונצח B-לימפוציט קווים11
<ol><li>לאחר הסכמה מדעת, לאסוף 30 מ"ל של דם שלם בצינורות סטריליים שטופלו EDTA מן proband נושא מוטציה RYR1 ומבני משפחה בריאים ללא מוטציה. הערה: שמור על כל הפתרונות סטריליים ועבוד במכסה המנוע של תרבית הרקמות.</li>
	<li>לבודד תאים מונונוקלאריים מדם שלם על ידי צפיפות של מדיית צנטריפוגה הדרגתית (למשל, פיקול-היפק, .077 גרם/ ליטר).<ol>
<li>מניחים 30 מ"ל של דם סטרילי בצינור סטרילי חרוט 50 מ"ל.</li>
		<li>מניחים את הקצה של פיפטת פסטר המכילה את מדיית צנטריפוגת שיפוע הצפיפות בתחתית הצינור ושכבה 20 מ"ל סטרילית של תמיסת מדיה שיפועית בצפיפות לאט מתחת לדם.</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-900 x גרם ב-18°-20 מעלות צלזיוס, ללא הפסקה. הערה: שכבת התא המונונוקלארי מופיעה כטבעת מעוננת באינטרפאזה שבין שכבת המדיה של צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות לבין השכבה העליונה המכילה פלזמה מועשרת בטסיות דם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עם פיפטה סטרילית להסיר בעדינות את השכבה הבין-פאזית המכילה תאים מונונוקלאריים (כ 3-5 מ"ל) ולהעביר את הפתרון לצינור חרוט סטרילי נקי 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו 20 מ"ל של תמיסת מלח פוספט (PBS) לשטיפת תאים, צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-600 x גרם בטמפרטורת החדר והגדילו מחדש את הכדור ב-PBS. חזור על הפעולה במשך שלוש פעמים בסך הכל; פעולה זו מבטיחה שכל המדיה תוסר.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה, תאים resuspend ב 1-2 מ"ל של מדיום תרבית רקמות (RPMI בינוני בתוספת 10% סרום עגל עוברי, 2 mM L-גלוטמין, ו 100 יחידות של פניצילין וסטרפטומיצין). מקם תאים מונונוקלאריים (כ 1 x 106 תאים) בבקבוק תרבית רקמות T125 המכיל 20 מ"ל של מדיום תרבית רקמות.</li>
	<li>להדביק תאים מונונוקלריים עם וירוס אפשטיין-בר.<ol>
<li>השתמש בנתחי-על מתרביות קווי תאים B95.8 (המכילים 10 יחידות טרנספורמציה של10-2-103 יחידות טרנספורמציה/מ"ל המצוידות ב- -80 °C (70 °F) כמקור ל- EBV.</li>
		<li>Resuspend 1 x 106 תאים מונונוקלאריים בשלב 1.5 ב 20 מ"ל של מדיום תרבית רקמות לחשוף אותם 2 מ"ל של supernatant מקו התא B95.8 בנוכחות cyclosporin A (0.2 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי) לזיהום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את הבקבוקון באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול. אחרי שבוע לשנות את המדיום התרבותי. הערה: ברגע שתאי B מתחילים להתרבות הם יוצרים גושים מוכרים וגדלים במהירות כך שניתן להרחיב ולהקפיא את התרביות.</li>
	<li>לחלץ את ה- DNA הגנומי מן EBV מונצח B-לימפוציט קווים11 כדי לאשר את נוכחות או היעדר המוטציה הנתונה.</li>
</ol>2. מדידות תאיות Ca2+
הערה: שינויים בריכוז הסידן התאי של קווי תאי B-לימפוציטים שעברו טרנספורמציה של EBV ניתנים לניטור באוכלוסיות תאים, עם ספקטרופלואורומטר המצויד במפזר מגנטי ומחזיק cuvette להגדיר 37 °C (50 °F). לחלופין, ניתן לעקוב אחר שינויים של Ca2+ בתאים בודדים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בשני המקרים תאים מוסרים מבקבוק תרבית הרקמה, נשטפים פעמיים עם הפתרון של קרבס רינגר (140 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5.5 מ"ר גלוקוז, pH 7.4 המכיל 1 mM CaCl2) ונספר .
<ol><li>לניסויים באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר11,13,14<ol>
<li>תאים resuspend בריכוז סופי של 1 x 107 תאים / מ"ל בתמיסה של קרבס רינגר ודגורה ב 37 °C במשך 30 דקות עם ריכוז סופי של 5 μM Fura-2/AM.</li>
		<li>תאי צנטריפוגה ב 900 x g במשך 10 דקות ו resuspened אותם בתמיסה של קרבס רינגר בריכוז של 2 x 106 תאים / מ"ל.</li>
		<li>מדוד שינויים פלואורסצנטיים (יחס 340/380 ננומטר) באמצעות ספקטרופלואורומטר המצויד ב stirrer מגנטי להגדיר במהירות מקסימלית להגדיר 37 °C (37 °F).</li>
		<li>רגע לפני הניסוי ספין תאים ב 900 x g במשך 5 דקות ב microcentrifuge במהירות resuspend הכדור ב 1.5 מ"ל של הפתרון של קרבס רינגר עם 0.5 מ"מ EGTA אבל לא הוסיף Ca2 +.</li>
		<li>מקם את התאים ב cuvette cuvette זכוכית 3 מ"ל ולרשום את יחס פלואורסצנטיות (340 ננומטר / 380 ננומטר עירור, פליטה 510 ננומטר).</li>
		<li>להשיג קו בסיס יציב (כ 30 שניות), להוסיף את הריכוז הנבחר של אגוניסט RyR1 (4-כלורו-m-cresol, או 4-cmc) ולתעד את סידן חולף. הערה: פתרון מלאי של 300 מ"מ של 4 ס"מ המיוצר ב- DMSO משמש כמחזר מתחיל. פתרון זה יכול להיעשות מראש, aliquoted ומאוחסן ב -20 °C (50 °F) במשך מספר חודשים.</li>
		<li>בצע ניסויים בריכוזים שונים של 4 cmc. הערה: כלול 75 מיקרומטר, 150 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 450 מיקרומטר, 600 מיקרומטר, 750 מיקרומטר עד 1 מ"מ כדי ליצור עקומת תגובת מינון של אגוניסט לעומת שינוי ב [ Ca2 +]. ריכוזי 4-cmc השונים מתקבלים על ידי הוספת הנפח המתאים של 4-cmc מפתרון המלאי, ישירות לתוך cuvette המכיל את התאים הטעונים Fura-2. לדוגמה, לריכוז סופי של 300 μM 4-cmc, 1.5 μL של פתרון המלאי מתווספים cuvette המכיל 1.5 מ"ל של תאים בפתרון של קרבס רינגר. לריכוזים אגוניסטיים נמוכים יותר, פתרון המלאי של 300 מ"מ צריך להיות מדולל ל- 75 מ"מ עם DMSO ואת הנפח המתאים שנוסף ל- cuvette המכיל 1.5 מ"ל של תאים בתמיסה של קרבס רינגר.</li>
		<li>הוסף 400 nM thapsigargin לתאים כדי לחשב את הסכום הכולל של Ca2 + נוכח בחנויות תאיות. תעד את השיא Ca2+.</li>
		<li>התווה את שיא הסידן המושרה על ידי ריכוז נתון של 4 cmc לעומת שיא הסידן המושרה על ידי thapsigargin, אשר נחשב 100% ולבנות עקומת תגובה מינון 4 cmc השוואת תאים מ proband וקרוב משפחה בריא</li>
	</ol></li>
	<li>לניסויים בתאים בודדים13<ol>
<li>לדלל פולי-L-ליצין 1:10 סטרילי H2O ולטפל מראש כיסויי הזכוכית במשך 30 דקות. אפשר לייבש אוויר מתחת למכסה המנוע סטרילי של תרבית הרקמות.</li>
		<li>להשעות מחדש EBV-לימפוציטים B-לימפוציטים לריכוז סופי של 1 x 106 תאים / מ"ל בתמיסה של קרבס רינגר המכיל 1 mM CaCl2 ולהוסיף ריכוז סופי של 5 מיקרומטר Fura-2/AM.</li>
		<li>מניחים 1 מ"ל של תאים על כיסויים שטופלו בפולי-L-ליסין ודגרה ב 37 °C בחממה תרבית תאים לח במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאי EBV להיצמד כיסוי זכוכית במהלך הטעינה.</li>
		<li>מניחים את כיסוי תא הזילוף ומתחילים זלוף (בקצב של 2 מ"ל לדקה) עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 1 מ"מ Ca2 +.</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (המצויד במטרה טבילת שמן פי 40 (צמצם מספרי 0.17), מסננים (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) כדי להקליט מדידות און-ליין, עם קובץ מצורף למצלמה מצמידה להתקן (CCD) הנשלט על-ידי תוכנה.</li>
		<li>השג תמונות במרווחי זמן של 1 שניות בזמן חשיפה קבוע (100 מילישניות עבור אורכי גל של 340 ו- 380 ננומטר. השתמש בתוכנת הדמיה כדי לנתח שינויים בפלואורסצנטיות. מדוד את ערך הפיקסלים הממוצע עבור כל תא לאורכי גל של 340 ו- 380 ננומטר13.</li>
		<li>כדי להשיג גירוי התא, להשתמש ממריץ זלוף תא עם 12 שסתומים ולהוסיף ריכוזים שונים של 4-cmc. שסתום סומק מכיל הפתרון של קרבס רינגר ללא תוספת Ca2 + בתוספת 100 μM La3+ כדי לפקח על שחרור סידן מחנויות תאיות בלבד.</li>
		<li>לבנות עקומת תגובת מינון של 4-cmc לעומת שינוי ב [Ca2+], כמתואר לעיל.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת מיוטיוב אנושי מביופסיותשרירים 10,12,15
הערה: שיטות שונות שימשו מעבדות שונות כדי להשיג myoblasts שמקורם בתא לווין myotubes. להלן תיאור השיטה המשמשת בבאזל.
<ol><li>לשטוף ביופסיה שריר עם PBS סטרילי כדי להסיר עודף דם לחתוך לרסיסים קטנים של כ 0.5-1 מ"מ.</li>
	<li>הכן 6 מנות תרבית רקמות היטב עם להכניס. הוסף 1.5 מ"ל של בינוני צמיחת שריר אנושי לכל באר ו 0.5 מ"ל של מדיום צמיחת שריר אנושי לכל הוספה. הערה: מדיום הצמיחה מורכב כדלקמן: 500 מ"ל של המדיום של נשר שונה של Dulbecco עם גלוקוז גבוה, או DMEM (4.5 מ"ג / מ"ל), המכיל 10% סרום סוס, 5 ננוגרם / מ"ל אינסולין, 3 mM גלוטמין, 600 ng / mL פניצילין G וסטרפטומיצין, ו 7 mM HEPES, pH 7.4. ניתן להשתמש גם במדיום צמיחת שריר השלד הזמינה מסחרית.</li>
	<li>מניחים 2-3 שברי שרירים קטנים בכל תוספת(איור 1A)ומכניסים מנות תרבות לאינקובטור תרבית התאים (5% CO2, 37 °C (37 °F). לאחר כ-8-10 ימים ניתן לראות תאי לוויין צומחים מתוך הביופסיה של השרירים, המחוברים לתוספת(איור 1,B ו-C, חצים).</li>
	<li>לשחרר מספר מספיק של תאים מן הביופסיה (לאחר כ 10-14 ימים), trypsinize כדלקמן:<ol>
<li>הסר את כל המדיום תרבית, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS, להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון טריפסין / EDTA (0.025% טריפסין ו 0.01% EDTA) ודגרה ב 37 °C (5 דקות.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של מדיום צמיחה לתאים כדי לנטרל את ההשפעה של טריפסין ולהעביר את תאי הלוויין לתוך בקבוקון חדש של תרבית תא T25; להוסיף 3 מ"ל של בינוני צמיחה ומניחים את התאים באינקובטור תרבית תאים (5% CO2, 37 °C ).</li>
		<li>שנה את מדיום הצמיחה למחרת כדי להסיר את EDTA ולאחר מכן לשנות את המדיום פעם בשבוע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר myoblasts הם כ 75% מפגש, trypsinize ולהעביר אותם על כיסוי זכוכית לטיפול למינין. הערה: כפרופורציה, תאים הגדלים בבקבוק T25 אחד יש להעביר על כיסוי זכוכית אחד בקוטר 43 מ"מ למינין. כיסוי הזכוכית צריך להיות ממוקם בתוך צלחת תרבית רקמות בקוטר 60 מ"מ המכיל 3 מ"ל של מדיום צמיחה.</li>
	<li>לגדל תאים על מכסה הזכוכית במדיום צמיחה באינקובטור תרבית התא (5% CO2, 37 °C) שינוי המדיום פעם בשבוע. ב 90% השפעה, לעבור בידול בינוני מורכב כדלקמן: DMEM גלוקוז גבוה (4.5 מ"ג / מ"ל), 0.5% אלבומין סרום בקר, 10 ng / mL גורם גדילה אפידרמיס, 0.15 מ"ג / מ"ל קריאטין, 5 ng / mL אינסולין, 200 mM גלוטמין, 600 ng / mL פניצילין G וסטרפטומיצין, ו 7 mM HEPES, pH 7.4). ניתן להשתמש גם במדיום בידול זמין מסחרית. שנה את מדיום הבידול פעם בשבוע.</li>
	<li>לאחר 7-10 ימים בבידול בינוני, מיוטיובים מרובי נוקלים נראים. הערכה עבור שינויים ב- [Ca2+] בתוך שבוע אחד, כמתואר להלן.</li>
</ol>4. [Ca2+] מדידות יחסi נקבעות עם Fura-2
<ol><li>כיסויי זכוכית עומס למיוטיובים שגדלו עם Fura-2/AM (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר) מדולל ב- DMEM למשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F). בקצרה, להסיר את מדיום הבידול מן זכוכית מכסה תאים גדל ולהוסיף 2 מ"ל בינוני בידול טרי. הוסף 10 μL של Fura-2 AM מפתרון מלאי של 1 mM ודגרה 30 דקות בחממה תרבית תא (5% CO2,37 °C (37 °C).</li>
	<li>העבר כיסוי זכוכית לתא הזלוף ושטוף תאים עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 2 מ"מ CaCl2.</li>
	<li>בצע מדידות און-ליין [Ca2+] כמתואר לעיל בסעיף תא בודד EBV עם המטרה FLUAR טבילת מים 20x (צמצם מספרי 0.17).</li>
</ol>

<ol><li>Dlamini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RYR1+are+a+common+cause+of+exertional+myalgia+and+rhabdomyolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis.</a> Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).</li>
<li>Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+genetic+findings+in+a+large+cohort+of+patients+with+ryanodine+receptor+1+gene-associated+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies.</a> Human Mutation. 33, 981-988 (2012).</li>
<li>Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RYR1+in+malignant+hyperthermia+and+central+core+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease.</a> Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+mediated+activation+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).</li>
<li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Ca2%2B+transients+in+COS-7+cells+transfected+with+the+cDNA+encoding+skeletal-muscle+ryanodine+receptor+carrying+a+mutation+associated+with+malignant+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia.</a> Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).</li>
<li>Nakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dihydropyridine+receptor+channel+activity+in+the+presence+of+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor.</a> Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).</li>
<li>Durham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RyR1+S-nitrosylation+underlies+environmental+heat+stroke+and+sudden+death+in+Y522S+RyR1+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice.</a> Cell. 133 (81), 53-65 (2008).</li>
<li>Zvaritch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dysregulation+in+Ryr1%28I4895T%2Fwt%29+mice+causes+congenital+myopathy+with+progressive+formation+of+minicores%2C+cores%2C+and+nemaline+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).</li>
<li>Elbaz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-allelic+expression+of+the+RyR1+p.A4329D+mutation+decreases+muscle+strength+in+slow-twitch+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).</li>
<li>Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+homeostasis+in+human+primary+muscle+cells+from+malignant+hyperthermia+susceptible+and+normal+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals.</a> Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).</li>
<li>Girard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-lymphocytes+from+Malignant+Hyperthermia-Susceptible+patients+have+an+increased+sensitivity+to+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077(2001).</li>
<li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ryanodine+receptor+mutations+on+interleukin-6+release+and+intracellular+calcium+homeostasis+in+human+myotubes+from+Malignant+Hyperthermia-+Susceptible+individuals+and+patients+affected+by+Central+Core+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).</li>
<li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+ryanodine+receptors+carrying+three+amino+acid+substitutions+identified+in+patients+affected+by+multi-minicore+disease+and+central+core+disease%2C+expressed+in+immortalized+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes.</a> Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).</li>
<li>Tilgen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+four+novel+mutations+in+the+C-terminal+membrane+spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor+1%3A+association+with+central+core+disease+and+alteration+of+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis.</a> Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).</li>
<li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitation-coupled+Ca2%2B+entry+induces+nuclear+translocation+of+NFAT+and+contributes+to+IL-6+release+from+myotubes+from+patients+with+central+core+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).</li>
<li>Yasuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JP-45%2FJSRP1+variants+affect+skeletal+muscle+excitation+contraction+coupling+by+decreasing+the+sensitivity+of+the+dihydropyridine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor.</a> Human Mutation. 34, 184-190 (2013).</li>
<li>Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+ryanodine+receptor+is+involved+in+calcium+signaling+in+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).</li>
<li>Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorocresol%2C+an+additive+to+commercial+succinylcholine%2C+induces+contracture+of+human+malignant+Hyperthermia+Susceptible+muscles+via+activation+of+the+ryanodine+receptor+Ca2%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel.</a> Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).</li>
<li>Kushnir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+calcium+leak+in+circulating+B-lymphocytes+as+a+biomarker+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure.</a> Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).</li>
<li>Zullo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+ryanodine+receptor+sequence+variants+using+a+metabolic+assay+in+immortalized+B-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes.</a> Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).</li>
<li>Hoppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermetabolism+in+B-lymphocytes+from+malignant+hyperthermia+susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals.</a> Scientific Reports. 6, 33372(2016).</li>
<li>Monnier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homozygous+splicing+mutation+causing+a+depletion+of+skeletal+muscle+RYR1+is+associated+with+multi-minicore+disease+congenital+myopathy+with+ophthalmoplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia.</a> Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).</li>
<li>Schartner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dihydropyridine+receptor+%28DHPR%2C+CACNA1S%29+congenital+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy.</a> Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).</li>
<li>Ullrich, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+excitation-contraction+coupling+and+excitation+coupled+Ca2%2B+entry+in+human+myotubes+carrying+CAV3+mutations+linked+to+rippling+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease.</a> Human Mutation. 32, 1-9 (2010).</li>
<li>Rokach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+skeletal+muscle-+derived+cell+line%3A+biochemical%2C+cellular+and+electrophysiological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization.</a> Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RYR1+mutations+in+core+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Characterization of RYR1 mutations in core myopathies.</a> Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).</li>
<li>Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proton+release+from+cultured+human+myotubes+to+identify+malignant+hyperthermia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility.</a> Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה נוצלו בהצלחה על ידי מספר מעבדות כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות RYR1 על הומאוסטזיס סידן. הצעדים הקריטיים של הגישות המתוארות במאמר זה עוסקים בעקרות, מיומנויות וטכניקות פולחן תאים וזמינות של חומר ביולוגי. באופן עקרוני, השימוש בלימפוציטים B מונצחים EBV הוא פשוט יותר ומאפשר אחד ליצור קווי תאים המכילים ערוצי RyR1 מוטנטי. התאים יכולים להיות קפואים ומאוחסנים בחנקן נוזלי במשך שנים רבות ותרבויות ניתן להתחיל מחדש בכל עת. בנוסף, ניתן לבחור אם לפקח על הומאוסטזיס סידן באוכלוסיות תאים או ברמת התא הבודד. הש...

עד כה זוהו יותר מ-700 גרסאות RYR1 באוכלוסייה האנושית וקשורות להפרעות נוירו-שריריות שונות, כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה (MHS), פעילות גופנית המושרה rhabdomyolysis, מחלת ליבה מרכזית (CCD), מחלת רב-מיני-קור (MmD), מיופתיה סנטרונוקלארית (CNM)1,2,3 ; עם זאת, מחקרים לאפיון ההשפעות התפקודיות שלהם מפגרים ורק כ -10% מהמוטציות נבדקו באופן פונקציונלי. ניתן להשתמש בגישות ניסיוניות שונות כדי להעריך את ההשפעה של גרסה RyR1 נתון, כולל transfection של תאים הטרולוגיים כגון HEK293 ו COS-7 תאים עם קידוד plasmid עבור WT מוטציה RYR1 cDNA4,5, טרנסדוקציה של פיברובלסטים עכבר דיפדי עם plasmids וקטורים קידוד עבור WT מוטציה RYR1 cDNA, ואחריו טרנסדוקציה עם myo-D ובידול לתוך myotubes6 דור של מודלים חייתיים מהונדסים הנושאים מוטציה RyR1s7,8,9, אפיון תאים מחולים המבטאים את גרסת RYR1 אנדוגני10,11,12. שיטות כאלה עזרו לקבוע כיצד מוטציות שונות משפיעות מבחינה פונקציונלית על ערוץ RyR1 Ca2+ .
כאן, שיטות שפותחו כדי להעריך את ההשפעות הפונקציונליות של מוטציות RYR1 מתוארים. פרמטרים שונים של הומאוסטזיס סידן תאי נחקרים בתאים אנושיים מבטאים אנדוגני את ערוץ הסידן RyR1, כולל מיוטיוב ווירוס אפסטין בר (EBV) לימפוציטים מונצחים B. תאים מתקבלים מחולים, מורחבים בתרבית ועמוסים במדדי סידן פלואורסצנטיים יחסטריים כגון Fura-2 או indo-1. פרמטרים אשר דווחו להיות שונה בגלל מוטציות RYR1 פתוגניים כולל מנוחה [Ca2 +], הרגישות אגוניסטים רוקח שונים ואת הגודל של מאגרי Ca2 + תאי נמדדים או ברמת התא הבודד, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, או באוכלוסיות תאים באמצעות פלואורימטר. לאחר מכן, התוצאות המתקבלות בתאים מנשאי מוטציה משווות את התוצאות של בני משפחה בשליטה בריאה. גישה זו הוכיחה כי: (i) מוטציות רבות הקשורות ל- MHS מובילות לעלייה במנוחה [Ca2+] ומעבר שמאלה בעקומת תגובת המינון להפעלה של דה-קוטביות הנגרמת על ידי KCl או להפעלת RyR1 פרמקולוגית עם 4-כלורו-m-קרסול10,11,12,13; (ii) מוטציות הקשורות ל- CCD מובילות לירידה בשיא [Ca2+] שפורסמו על ידי הפעלה פרמקולוגית של RyR1 וירידה בגודל אם Ca2 + תאיים חנויות12,13,14,15; (iii) גרסאות מסוימות אינן משפיעות על Ca2 + הומאוסטזיס13. היתרונות של גישה ניסיונית זו הם: חלבון RyR1 אינו מבוטא יתר על המידה ורמות פיזיולוגיות קיימות, ניתן להנציח תאים (הן תאי שריר והן לימפוציטים B) המספקים קווי תאים המכילים מוטציות. חסרונות מסוימים מתייחסים לעובדה כי חולים עשויים לשאת מוטציות ביותר מחלבונים קידוד גן אחד המעורבים סידן הומאוסטזיס ו /או צימוד התכווצות עירור (ECC) וזה עלול לסבך מסקנות ניסיוניות. לדוגמה, שתי גרסאות JP-45 זוהו ב- MHS ואוכלוסיית הבקרה ונוכחותם הוכחו כמשפיעות על הרגישות של קולטן הדיהידרופרידין (DHPR) להפעלה16. חולים צריכים להיות זמינים, חומר ביולוגי צריך להיות שנאסף טרי ויש לקבל היתרים אתיים מוועדת האתיקה המקומית.

<table><tbody><tr><td>4-chloro-m-cresol</td><td>Fluka</td><td>24940</td><td></td></tr><tr><td>צינורות איסוף דם</td><td>Sarstedt</td><td>172202</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>קפאין</td><td>Merk</td><td>102584</td><td></td></tr><tr><td>Cascade 125+ מצלמת CCD</td><td>פוטומטריה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפל 128+ CCD</td><td>פוטומטריה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C-3630</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fluka</td><td>3778</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen Life Sciences</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11382II</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Lanthanum</td><td>Fluka</td><td>61490</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקרופרפוזיה</td><td>ALA-Scientific</td><td>DAD VM 12 סעפת שסתומים</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מקור</td><td>OriginLab Corp</td><td>תוכנה</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco מדעי החיים</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>תא זלוף POC-R</td><td>Pecon</td><td>000000-1116-079</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td></td> ספקטרופלואורמטר 21875091 <td></td>מדעי</tr><tr><td></td><td>פרקין אלמר</td><td>LS50</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית רקמות</td><td>Falcon</td><td>353107</td><td></td></tr><tr><td>תרבית רקמות מוסיף</td><td>תמיסת Falcon</td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>Software</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 מיקרוסקופ טלוויזיה</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss כיסויי זכוכית</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>0727-016</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון פונקציונלי של גרסאות ryr1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

יותר מ -700 גרסאות בגן RYR1 זוהו בחולים עם הפרעות עצביות-שריריות שונות כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה, מיופתיות ליבה ומיופתיה centronuclear. בגלל פנוטיפים מגוונים הקשורים מוטציות RYR1 זה בסיסי לאפיין את ההשפעות התפקודיות שלהם כדי לסווג וריאנטים נישאים על ידי חולים להתערבויות טיפוליות עתידיות ולזהות וריאנטים שאינם פתוגניים. מעבדות רבות התעניינו בפיתוח שיטות לאפיון תפקודי של מוטציות RYR1 המתבטאות בתאי המטופלים. לגישה זו יתרונות רבים, כולל: מוטציות מתבטאות באנדוגניות, RyR1 אינו מתבטא יתר על המידה, השימוש בתאי RyR1 הטרולוגיים המבטאים נמנע. עם זאת, מאז חולים עשויים להציג מוטציות בגנים שונים מלבד RYR1, חשוב להשוות תוצאות מחומר ביולוגי מאנשים מחסה אותה מוטציה, עם רקע גנטי שונה. כתב היד הנוכחי מתאר שיטות שפותחו כדי לחקור את ההשפעות התפקודיות של גרסאות RYR1 המובעות באנדוגניות ב: (א) וירוס אפשטיין בר הנציח לימפוציטים B אנושיים ו -(ב) תאי לווין הנגזרים ביופסיות שרירים ומובחנים לתוך מיוטיוב. שינויים בריכוז הסידן התאי המופעלים על ידי תוספת מפעילי RyR1 פרמקולוגיים מנוטרים לאחר מכן. סוג התא שנבחר נטען עם מחוון סידן פלואורסצנטי יחסטרי ושינויים תאיים [Ca2+] מנוטרים או ברמת התא הבודד על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר. המנוחה [Ca2+], עקומות תגובת מינון אגוניסטיות משווות לאחר מכן בין תאים משליטה בריאה וחולים מחסה וריאנטים RYR1 המוביל תובנה לתוך ההשפעה התפקודית של גרסה נתונה.

[Ca2+]i מדידות באוכלוסיות של לימפוציטים B מונצחים EBV לימפוציטים B-לימפוציטים ראשוניים מבטאים את איזופורם RyR1 המתפקד כערוץ שחרור Ca2 + במהלך קולטן אנטיגן של תאי B מגורה תהליכי איתות17. הנצחה של תאי B עם EBV, הליך המשמש באופן שגרתי על ידי גנטיקאים כדי להשיג קווי תאים המכילים מידע גנומי של חולים, מספק את היתרון של יצירת קווי תאים המבטאים מוטציה RyR1 Ca2 + ערוצים בחולי...

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי הוא משתמש בחומר המטופל. אם החולה חולה במחלה, השימוש בתאים שלו צריך לשקף בצורה מדויקת יותר את התגובה הביולוגית של המטופל. טכניקה זו היא פשוטה לביצוע, פשוטה, ואינה דורשת ציוד מתוחכם.שיטות אלה יכולות לשמש לאבחון, למשל, כדי להוכיח כי מוטציה RYR1 משנה תפקודית הומאוסטזיס סידן, כמו גם כדי לבדוק את הפונקציה הטיפולית הפוטנציאלית של תרכובת. בהתאם לידע ולמיומנויות הטכניות של החוקר הבודד, ניסויי בדיקה צריכים להתבצע לפני השימוש בדגימות המטופל בפועל. כדי לעקוב אחר שינויים בריכוז הסידן התאי של לימפוציטים B שעברו טרנספורמציה של EBV, חידשו את תאי ה-B המונצחים במהירות של פי 10 עד 10 עד התאים השביעיים לריכוז מיליליטר בתמיסה של קרבס רינגר ובפורה-2 לפנות בוקר לריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים לדגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי centrifugation, ו resuspened הכדור בתמיסה של קרבס רינגר טרי בשתי פעמים 10 עד התא השישי לריכוז מיליליטר. רגע לפני תחילת הניסוי, צנטריפוגה התאים שוב, במהירות resuspened התאים ב 1.5 מיליליטר של הפתרון של קרבס רינגר בתוספת EGTA 0.5 מילימולר אבל לא סידן נוסף. העבר את התאים לכוס, ספקטרופלואורומטר 3 מיליליטר cuvette, ולתעד את יחס פלואורסצנטיות על ספקטרופלואורומטר מצויד stirrer מגנטי להגדיר במהירות מקסימלית 37 מעלות צלזיוס במשך כ 30 שניות.כדי להעריך את תגובת שחרור הסידן בתאים בודדים, צלחת פעם אחת 106 Fura-2 AM תאים טעונים במיליליטר אחד של הפתרון של קרבס רינגר בתוספת סידן כלוריד מילימולר אחד על פתקי כיסוי זכוכית מצופים פולי-L-ליסין בודדים, ודגרה את החלקות הכיסוי ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית תאים לחה במשך 30 דקות. כאשר התאים מחוברים, מניחים להחליק כיסוי לתוך תא זלוף, ולהתחיל זלוף התאים בשני מיליליטר של הפתרון של קרבס רינגר בתוספת סידן מילימולר אחד לדקה קצב זרימה. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במטרה טבילת שמן פי 40 והמסננים המתאימים, הקלט מדידות מקוונות עם קובץ מצורף למצלמת התקן הנשלט על-ידי תוכנה, במרווחי זמן של שנייה אחת, בזמן חשיפה קבוע.כדי להשיג גירוי התא, להשתמש ממריץ זלוף תא עם 12 שסתומים כדי להוסיף את הריכוזים השונים של אגוניסט. כדי לבודד מיוטיובים מביופסיות שרירים אנושיות, תחילה לשטוף את הביופסיה עם PBS סטרילי כדי להסיר כל עודף דם לפני כריית הרקמה לתוך שברים קטנים, 0.5 עד מילימטר אחד. מניחים שניים עד שלושה שברים לתוך תוספות בודדות בכל באר של צלחת תרבית רקמות של שש באר המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום צמיחת שריר אנושי לבאר ו -500 מיקרוליטרים של מדיום לכל הוספה, ומניחים את הצלחת לתוך החממה של תרבית התא.כדי למדוד שינויים ביטוי סידן myotubes אנושי, כאשר myotubes multinucleated ניתן לראות, להחליף את supernatants תרבות myotube עם בינוני בידול טרי בתוספת 10 microliters של Fura-2 AM מילימולרי אחד עבור דגירה של 30 דקות בחממה תרבית התא. בסוף הדגירה, להעביר את תרבות כיסוי זכוכית אחת לתא זלוף, ולשטוף את התאים עם הפתרון של קרבס רינגר בתוספת סידן כלורי שני מילימולר. לאחר מכן לבצע מדידות סידן באינטרנט כפי שהוכח באמצעות מטרה טבילת מים פעמים 20.בניתוח מייצג זה, עלייה מהירה בסידן נצפתה בלימפוציטים B מונצחים EBV לאחר תוספת של אגוניסט כי לאט לאט ירד בחזרה לרמות מנוחה לאורך זמן. בניסוי דומה, התוספת של 400 ננו-מולרי thapsigargin גרם סידן ארעי גדול שהגיע ערך פלואורסצנטי שיא של 2.4 יחידות שרירותיות. ערך פלואורסצנטי זה נחשב 100%כאשר עקומת תגובת המינון המתאימה נבנתה.בניתוח זה, תאי B מונצחים היו מגורה עם קפאין חמישה מילימולרי במשך 20 שניות, וכתוצאה מכך עלייה מיידית ביחס פלואורסצנטיות 340 ו 380 ננומטר. עבור כל ריכוז קפאין שנבדק, שיא המושרה קפאין ביחס של 340 על ידי 380 ננומטר של פלואורסצנטיות חושב ושימש לבניית עקומת תגובת מינון. שחרור סידן מ myotubes מובחן ניתן גם להעריך בתגובה שטיפה עם אשלגן כלורי, ריכוזים שונים של אגוניסט, ו /או קפאין, עקומות תגובת מינון נורמלי ניתן ליצור.חשוב לוודא כי התאים נטענים כראוי עם Fura-2 וכי הן אורכי הגל 340 ו 380 ננומטר להגיב לתוספת של אגוניסט. מדידות סידן תאיות עם אינדיקטורים סידן פלואורסצנטי ניתן לחקור ברוב תאי היונקים והוא יכול להיות מיושם על המחקר של שינויים סידן תאי בתגובה לגירויים שונים.

functional-characterization-endogenously-expressed-human-ryr1

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

יישוב הדור הבא רצפי היא גישה זמן - ו וחסכוניים זה נהיה יותר ויותר פופולרי לחקר מחלות והן אבחון קליני. הפרוטוקול המתואר כאן מציג את זרימת העבודה המורכבים הדרושים עבור רצף והתהליך ביואינפורמטיקה המשמש לזיהוי גנטי גרסאות שתורמים למחלות.

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את העיצוב ואת הביצועים של ניסויים vivo ב Drosophila ילה melanogaster כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של משתנים גנים נדירים הקשורים למחלות האדם.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

מוצג כאן הוא הליך צעד צעד עבור הבידול במבחנה של keratinocytes האדם העיקרי על ידי עיכוב מגע ואחריו אפיון ברמה המולקולרית על ידי ניתוח RNA-seq.

אפיון של בידול במבחנה של Keratinocytes האדם העיקרי על ידי ניתוח RNA-Seq

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

שיטה פשוטה ומדרגית פותחה כדי להעריך את המשמעות התפקודית של גרסאות missense ב- Ube3a, גן שאובדן ורווח תפקודו קשורים הן לתסמונת אנג'למן והן להפרעת ספקטרום האוטיזם.

שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a

מחקר זה מציג מסגרת רב-ממדית, המשתרעת מ-DNA לתפקוד חלבון והתנהגות עצבית. הוא מציג גישה חדשה לחקירת מוטציות פתוגניות חזויות בתת-היחידה של קולטן GABAA , ומשער כי מוטציות אפילפטוגניות ומוטציות פרוקסימליות, הצפויות כפתולוגיות, עשויות לייצר השפעות דומות על מודל הנוירונים הפירמידליים CA1.

זיהוי וסיווג של גרסאות missense של תת-יחידה לקולטן GABAA ספציפיות לתפקידן בנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס

למדו איך לחקור את ההשפעות הפונקציונליות של מוטציות RYR1 בתאים שמקורם בחולים באמצעות לימפוציטים B ותאי לוויין שריר. שיטה זו מאפשרת הערכת הומאוסטזיס סידן ובדיקת טיפולים פוטנציאליים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

גלה סרטונים נוספים