אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי הוא משתמש בחומר המטופל. אם החולה חולה במחלה, השימוש בתאים שלו צריך לשקף בצורה מדויקת יותר את התגובה הביולוגית של המטופל. טכניקה זו היא פשוטה לביצוע, פשוטה, ואינה דורשת ציוד מתוחכם.

שיטות אלה יכולות לשמש לאבחון, למשל, כדי להוכיח כי מוטציה RYR1 משנה תפקודית הומאוסטזיס סידן, כמו גם כדי לבדוק את הפונקציה הטיפולית הפוטנציאלית של תרכובת. בהתאם לידע ולמיומנויות הטכניות של החוקר הבודד, ניסויי בדיקה צריכים להתבצע לפני השימוש בדגימות המטופל בפועל. כדי לעקוב אחר שינויים בריכוז הסידן התאי של לימפוציטים B שעברו טרנספורמציה של EBV, חידשו את תאי ה-B המונצחים במהירות של פי 10 עד 10 עד התאים השביעיים לריכוז מיליליטר בתמיסה של קרבס רינגר ובפורה-2 לפנות בוקר לריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים לדגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי centrifugation, ו resuspened הכדור בתמיסה של קרבס רינגר טרי בשתי פעמים 10 עד התא השישי לריכוז מיליליטר. רגע לפני תחילת הניסוי, צנטריפוגה התאים שוב, במהירות resuspened התאים ב 1.5 מיליליטר של הפתרון של קרבס רינגר בתוספת EGTA 0.5 מילימולר אבל לא סידן נוסף. העבר את התאים לכוס, ספקטרופלואורומטר 3 מיליליטר cuvette, ולתעד את יחס פלואורסצנטיות על ספקטרופלואורומטר מצויד stirrer מגנטי להגדיר במהירות מקסימלית 37 מעלות צלזיוס במשך כ 30 שניות.

כדי להעריך את תגובת שחרור הסידן בתאים בודדים, צלחת פעם אחת 106 Fura-2 AM תאים טעונים במיליליטר אחד של הפתרון של קרבס רינגר בתוספת סידן כלוריד מילימולר אחד על פתקי כיסוי זכוכית מצופים פולי-L-ליסין בודדים, ודגרה את החלקות הכיסוי ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית תאים לחה במשך 30 דקות. כאשר התאים מחוברים, מניחים להחליק כיסוי לתוך תא זלוף, ולהתחיל זלוף התאים בשני מיליליטר של הפתרון של קרבס רינגר בתוספת סידן מילימולר אחד לדקה קצב זרימה. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במטרה טבילת שמן פי 40 והמסננים המתאימים, הקלט מדידות מקוונות עם קובץ מצורף למצלמת התקן הנשלט על-ידי תוכנה, במרווחי זמן של שנייה אחת, בזמן חשיפה קבוע.

כדי להשיג גירוי התא, להשתמש ממריץ זלוף תא עם 12 שסתומים כדי להוסיף את הריכוזים השונים של אגוניסט. כדי לבודד מיוטיובים מביופסיות שרירים אנושיות, תחילה לשטוף את הביופסיה עם PBS סטרילי כדי להסיר כל עודף דם לפני כריית הרקמה לתוך שברים קטנים, 0.5 עד מילימטר אחד. מניחים שניים עד שלושה שברים לתוך תוספות בודדות בכל באר של צלחת תרבית רקמות של שש באר המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום צמיחת שריר אנושי לבאר ו -500 מיקרוליטרים של מדיום לכל הוספה, ומניחים את הצלחת לתוך החממה של תרבית התא.

כדי למדוד שינויים ביטוי סידן myotubes אנושי, כאשר myotubes multinucleated ניתן לראות, להחליף את supernatants תרבות myotube עם בינוני בידול טרי בתוספת 10 microliters של Fura-2 AM מילימולרי אחד עבור דגירה של 30 דקות בחממה תרבית התא. בסוף הדגירה, להעביר את תרבות כיסוי זכוכית אחת לתא זלוף, ולשטוף את התאים עם הפתרון של קרבס רינגר בתוספת סידן כלורי שני מילימולר. לאחר מכן לבצע מדידות סידן באינטרנט כפי שהוכח באמצעות מטרה טבילת מים פעמים 20.

בניתוח מייצג זה, עלייה מהירה בסידן נצפתה בלימפוציטים B מונצחים EBV לאחר תוספת של אגוניסט כי לאט לאט ירד בחזרה לרמות מנוחה לאורך זמן. בניסוי דומה, התוספת של 400 ננו-מולרי thapsigargin גרם סידן ארעי גדול שהגיע ערך פלואורסצנטי שיא של 2.4 יחידות שרירותיות. ערך פלואורסצנטי זה נחשב 100%כאשר עקומת תגובת המינון המתאימה נבנתה.

בניתוח זה, תאי B מונצחים היו מגורה עם קפאין חמישה מילימולרי במשך 20 שניות, וכתוצאה מכך עלייה מיידית ביחס פלואורסצנטיות 340 ו 380 ננומטר. עבור כל ריכוז קפאין שנבדק, שיא המושרה קפאין ביחס של 340 על ידי 380 ננומטר של פלואורסצנטיות חושב ושימש לבניית עקומת תגובת מינון. שחרור סידן מ myotubes מובחן ניתן גם להעריך בתגובה שטיפה עם אשלגן כלורי, ריכוזים שונים של אגוניסט, ו /או קפאין, עקומות תגובת מינון נורמלי ניתן ליצור.

חשוב לוודא כי התאים נטענים כראוי עם Fura-2 וכי הן אורכי הגל 340 ו 380 ננומטר להגיב לתוספת של אגוניסט. מדידות סידן תאיות עם אינדיקטורים סידן פלואורסצנטי ניתן לחקור ברוב תאי היונקים והוא יכול להיות מיושם על המחקר של שינויים סידן תאי בתגובה לגירויים שונים.