Name: ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למדו פרוטוקול לכימות סינתזת שומנים נייטרליים ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות תיוג מטבולי וכרומטוגרפיה שכבה דקה. השיטה מאפשרת ניתוח מדויק של מטבוליזם שומנים ורגולציית אנזימים בחיידקי שמרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדת חן על עזרה וייעוץ רעיוני בסיום מחקר זה. W.M.H. נתמך על ידי כספים מקרן וולש (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), קרן המחקר הרפואי Ara Paresghian, ותוכנית המלומדים UT Southwestern ניחן. S.R נתמך על ידי מענק תוכנית T32 (5T32GM008297).

1. צמיחה ותיוג של תאי שמרים עם 14חומצה אצטית C
<ol><li>לחסן תרבות שמרים על ידי בחירת מושבה מצלחת וחלוקתה לתוך 20 מ"ל של מדיה סינתטית מלאה (SC) המכילה 2% דקסטרוז (ראה קובץ משלים למתכון של מדיה SC). דגירה ב 30 °C (50 °F) ללילה עם רועד ב 200 סל"ד. הערה: מצב הצמיחה, נפח המדגם והטיפול יהיו שונים בהתבסס על השומנים של עניין. לפני ביצוע ניסויים מלאים, תנאי צמיחה אופטימליים ונפחי תרבות צריכים להיקבע אמפירית. פרוטוקול זה דן radiolabeling של תרביות שמרים גדל לשלב נייח, שלב צמיחה כאשר ביו-ממברנה וצמיחת התא מאט, וסינתזה NL פעיל מאוד.</li>
	<li>למדוד את OD600 של תרבות הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר לדלל את תרבית תאי שמרים כדי ODסופי 600 של 0.2 ב 50 מ"ל של מדיה SC טרי המכיל 2% דקסטרוז. לגדל את התאים במשך 24 שעות, או עד שהם הגיעו לשלב הנייח (אשר מוגדר בדרך כלל על ידי בטנה שטוחה של התא הכפלת OD600 מדידה).</li>
	<li>לפני איסוף התאים, בצע את מאגר ההרוואות (ראה קובץ משלים לקבלת פרטים). הפוך שני aliquots 20 מ"ל של מאגר מרווה עבור כל מדגם (כלומר, 40 מ"ל מרווה חוצץ עבור כל מדגם) ולפצל באופן שווה לשני צינורות חרוט 50 מ"ל). אחסן את עליכות המאגר המרוותות ב- -80 °C (80 °F) לשימוש עתידי.</li>
	<li>לאחר שהתרביות הגיעו לשלב OD או הצמיחה הרצוי, לאסוף את התאים על ידי centrifuging ב 4,100 x g במשך 10 דקות. בעוד דגימות נמצאות בצנטריפוגה, להכין מדיה radiolabeling על ידי הוספת [1-14C] מלח נתרן חומצה אצטית לתקשורת SC ללא דקסטרוז בריכוז סופי של 10 μCi / mL. אזהרה: יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) בכל עת בעת עבודה עם חומרים רדיואקטיביים. פעל תמיד על פי הנחיות מקומיות לאחסון, שימוש וסילוק נאותים של חומרים רדיואקטיביים. הערה: הן הריכוז של 14C-חומצה אצטית במדיה תיוג ואת זמן הדגירה radiolabeling צריך להיות מותאם על פי מטבוליטים(ים) של עניין. כאן, 20 דקות דגירה דופק radiolabeling משמש, אשר מספיק כדי לתייג מינים NL עם מגוון של שפע.</li>
	<li>הסר את supernatant מן התאים כדורי, לשטוף את גלולה התא פעם אחת עם 20 מ"ל של מדיה SC ללא דקסטרוז על ידי שימוש חוזר את הכדור עם pipette. לאסוף את התאים שוב על ידי centrifuging ב 4,100 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>resuspend התאים ב 1 מ"ל של תקשורת SC ללא דקסטרוז, ולהעביר את התאים לצינור microcentrifuge 2 מ"ל שכותרתו. לאסוף את התאים שוב על ידי centrifuging ב 4,100 x g במשך 2 דקות.</li>
	<li>resuspend התאים שוב ב 500 μL של מדיה SC ללא דקסטרוז. מצנטריפוגה מצנטריפוגה המצוידת בצינורות חרוטים של 50 מ"ל עד -10 מעלות צלזיוס או על הגדרת הטמפרטורה הנמוכה ביותר.</li>
	<li>התחל את תקופת ההשעיה של רדיולייבל על ידי הוספת 500 μL במהירות של מדיה radiolabeling לכל 500 μL של השעיית תא (ריכוז חומצה אצטית 14C הסופי = 5 μCi / mL). לדגור על הצינורות באינקובטור מסתובב ב 30 °C (50 °F) במשך 20 °C 2 דקות לפני סוף תקופת התיוג, להעביר אחד 20 מ"ל aliquot של חיץ מרווה עבור כל דגימה מהמקפיא -80 °C לדלי קרח</li>
	<li>לאחר שתקופת ההבלים הסתיימה, השתמש בצינור כדי לצלול את כל דגימת 1 מ"ל לתוך 20 מ"ל של חוצץ מרווה קר. מערבולת הצינורות החרוטים עבור 5-10 s כדי להבטיח כי המדגם כבר מעורבב ביסודיות עם חוצץ מרווה. לדגור את הדגימות במאגר מרווה במשך 2 דקות על קרח.</li>
	<li>לאסוף את גלולה התא על ידי ספינינג בצנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 3 דקות להגדיר -10 °C (50 °F) או על הגדרת הטמפרטורה הנמוכה ביותר. בזמן שצינורות מדגם מסתובבים, העבר קבוצה נוספת של עליקוט מאגר מרווה מהמקפיא של 80 מעלות צלזיוס לדלי מלא בקרח (כלומר, צינור אחד של 20 מ"ל של חיץ מרווה לכל דגימה).</li>
	<li>הסר את חיץ מרווה supernatant מכדורי התא ולהחליף אותו עם 20 מ"ל רענן, קר, מרווה חוצץ. מערבולת ומנערים את הדגימות עד שהכדור התנתק מתחתית הצינור החרוט והוצמד מחדש במלואו במאגר מרווה. צנטריפוגות הדגימות שוב ב 5,000 x g במשך 3 דקות ב -10 °C (50 °F) כדי לאסוף את התאים.</li>
	<li>לאחר שהתאים הם גלולה, ביסודיות להסיר את כל חוצץ מרווה מן הדגימות על ידי שפיכת supernatant והסרת עודף עם pipette. לאחסן צינורות ב -80 °C (70 °F) לעיבוד נוסף.</li>
</ol>2. בידוד של שומנים מוחלטים מן שמרים
הערה: הפרוטוקול הבא לבידוד שומנים מבוסס על שיטה מבוססת היטב בשימוש תכוף כי ביעילות מחלץ את רוב מיני השומניםנייטרלי 17,18. אזהרה: בעת שימוש בממס אורגני, תמיד ללבוש PPE מתאים ולעבוד בתוך מכסה המנוע אדים במידת האפשר. במהלך מיצוי שומנים בדם, להימנע משימוש בפלסטיק שאינם תואמים ממסים אורגניים. צינורות פוליפרופילן מתאימים לפרוטוקול הבא.
<ol><li>שקול 0.3 גרם של חרוזי זכוכית שטף חומצה עבור כל מדגם ולאחסן אותם 2 mL צינורות microcentrifuge על קרח. הסר את כדורי התא מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס ולשמור אותם על קרח. הוסף 350 מתנול μL ו 700 μL כלורופורם לכל דגימה, resuspend, ולהעביר צינורות microcentrifuge המכיל חרוזי זכוכית שקל מראש.</li>
	<li>תאי ליזה על ידי צינורות מתסיסים על מערבולת 3x במשך 1 דקות, עם 30 של דגירה על קרח בין תסיסה. לחלופין, תאים יכולים להיות lysed באמצעות מקצף חרוזים מיני במשך שלושה מחזורים 1 דקות. שמור 25-30 μL של כל תא lysate בצינור נפרד לספירת נוצצים. הערה: הליזט שנשמר ישמש לקביעת הכמות היחסית של רדיואיזוטופ שנלקח על ידי כל דגימה במהלך תקופת הדופק, אשר ישפיע על כמות כל דגימה שנטענה על צלחת TLC. זה נדון בהמשך בשלב 3.2.</li>
	<li>יוצקים את כל התוכן של צינור המיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית 15 מ"ל [Tube A]. לשטוף את צינורות microcentrifuge 2 מ"ל על ידי הוספת 1 מ"ל של מתנול מערבולת עבור 10-15 s. העבר את שטיפת מתנול 1 מ"ל לצינור A ולהוסיף 2 מ"ל של כלורופורם לצינור A ואחריו 400 μL של מים עבור נפח מדגם סופי של 4.45 מ"ל.</li>
	<li>דגימות מערבולת במשך דקה אחת ואחריהן צנטריפוגה של 5 דקות ב-1,000 x גרם. לאחר צנטריפוגה, השלבים מימיים (עליונים) ואורגניים (נמוכים) צריכים להיות מופרדים חזותית בבירור עם פסולת תאים שוכבת בממשק.</li>
	<li>באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, לאסוף את השלב האורגני מצינור A ולעבור צינור צנטריפוגה זכוכית 15 מ"ל חדש (Tube B). הוסף 1 מ"ל של 1M KCl לצינור B. כדי צינור A, להוסיף 1 מ"ל של מתנול ו 2 מ"ל של כלורופורם, ו 200 μL MiliQ מים. חזור על מדרגות המערבולת והמרכז בצינור A.</li>
	<li>שוב לאסוף את השלב האורגני מצינור A ולהוסיף אותו צינור B. להיפטר צינור A במיכל מתאים. צינור מערבולת B למשך דקה אחת ואחריו צנטריפוגה של 5 דקות ב 1,000 x g.</li>
	<li>הסר את השכבה מימית העליונה מצינור B ולהיפטר. הוסף 1 מ"ל של 1 M KCl טרי בחזרה לצינור B ולחזור על שלב המערבולת / צנטריפוגה. לאחר הפרדת השכבות, אסוף בזהירות את כל השכבה האורגנית התחתונה לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ"ל שכותרתו. הערה: בשלב זה, תמציות שומנים ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F), או הפרוטוקול ניתן להמשיך עבור הפרדת TLC של שומנים.</li>
</ol>3. הפרדה וכימות של NLs עם תווית רדיואיזוטופ על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה
<ol><li>אם תמציות שומנים הונחו ב -80 מעלות צלזיוס, לאט להביא לטמפרטורת החדר על ידי דגירה על קרח ולאחר מכן על ספסל. לאדות לחלוטין ממס מתמציות שומנים על ידי ייבוש ואקום או באמצעות זרם עדין של גז אינרטי (למשל, ארגון או חנקן). בינתיים, מחממים תנור ל-145 מעלות צלזיוס לחימום צלחת TLC.</li>
	<li>לפני שניתן לטעון דגימות על צלחת TLC, לקבוע כמויות יחסיות של radiolabel נלקח על ידי התאים. Pipette 10 μL של התא כולו ליסייט מן שלב 2.2 לתוך בקבוקון נצנצים זכוכית 6 מ"ל, להוסיף 6 מ"ל של נוזל נוצץ ולהניח בקבוקונים בארון תקשורת. השתמש במונה נוצץ כדי למדוד את עלות לאלף חשיפות או dpm של כל דגימה באמצעות האפשרות ספירת ארון תקשורת יחיד המוגדרת לזמן ספירה של דקה אחת. מדוד כל תא שלם lysate בכפילות כדי לקבל ממוצע עבור כל מדגם. התאמת כמות הטעינה בהתאם לסוג פראי או לדגימת הפניה הערה: ניתן לקבוע את כמות כל דגימה לטעינה על לוח TLC באמצעות המשוואה הבאה: (ממוצע ספירות מדגם)/(ממוצע ספירות הפניות) x נפח הטעינה הרצוי. לדוגמה, אם 20 μL של מדגם הייחוס הוא להיות טעון על צלחת TLC, ויש לו ספירה ממוצעת של 1,000, אז מדגם ניסיוני עם ספירה ממוצעת של 2,000 יהיה 10 μL טעון על צלחת TLC.</li>
	<li>ליישב מחדש את השומנים מדגם ב 40-50 μL של 1:1 (v/v%) כלורופורם:מתנול על ידי מערבולת במשך 5 דקות. הכן 101 מ"ל של ממס פאזה ניידת בגליל בוגר זכוכית (ראה סעיף תוצאות מייצגות לדוגמה של הפרדת מינים NL גדול על ידי 50:40:10:1 (v / v / v / v%) Hexane:אתר נפט:אתר דיאתיל:ממס חומצה אצטית).</li>
	<li>יוצקים את הממס לתא TLC מזכוכית המכיל כרית רוויה של 20 x 20 TLC ומכסה צמוד. הכן ג'ל סיליקה 20 x 20 סיליקה 60 G על ידי סימון בעדינות קו 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של הצלחת באמצעות עיפרון. הקו קובע את המקור ואת המקום שבו השומנים ייטענו. מתחת לקו, סמן בעדינות את המדגם שייטען בכל נתיב. לאחר צלחת TLC כבר מוכן, לדגור על הצלחת בתנור 145 °C לפחות 30 דקות כדי לחמם מראש את הצלחת ולהסיר כל לחות עודפת.</li>
	<li>לאחר הצלחת כבר מחומם מספיק, ואת כרית רווי TLC רווי ממס, להסיר את צלחת TLC מהתנור מיד להמשיך לטעון את צלחת TLC. טעינת הצלחת בזמן שהיא חמה מבטיחה אידוי ממס מהיר. עבור כל מינים שומנים של עניין, לטעון 5-20 מיקרוגרם של תקן שומנים מטוהרים על נתיב של צלחת TLC כדי לעקוב אחר הפרדה ומרחק הגירה צפוי. באמצעות פיפטה, לזהות 5μL של מדגם על המקור של כל נתיב הממוקם 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של צלחת TLC. טעינה חוזרת של 5 נקודות μL עד 20-40 μL של מדגם כבר טעון לתוך כל נתיב. הערה: 5-20 מיקרוגרם של שומנים מטוהרים ללא תווית ניתן להוסיף לכל נתיב מדגם כמו עקבות שניתן להכתים ודמיינו לאחר הפרדת TLC של שומנים. נוכחותו של תקן מוכתם מאפשרת מעקב קל ו excision של רצועות שומנים radiolabeled לספירת הניקוד הבאים. אילו סטנדרטים מטוהרים נטענים על הצלחת ייקבעו על ידי מינים מעניינים NL. עיין בסעיף התוצאה הייצוגית לדוגמה של הפרדת חומצה אולאית (FFA), 1,2 דיאולאויל-גליצל (DG), טריולין (TG), כולסטרול (כול), כולסטריל-לינולאט (SE) וסקוואלן בנתיבים הסמוכים לנתיבי המדגם.</li>
	<li>לאחר הטעינת התקן והדגימות הניסיוניות, מניחים את הצלחת בתא המתפתח וממתינים עד שהממס יגיע לראש הצלחת (40-60 דקות). לאחר הצלחת מפותחת במלואה, להסיר אותו מהתא ולאפשר לו להתייבש במכסה המנוע אדים במשך 20 דקות.</li>
	<li>לאחר הצלחת מיובשת, לכסות אותו עם סרט פלסטיק ומניחים אותו בקלטת מתפתחת עם מסך אוטוקרדיוגרפיה. אפשר לצלחת להתפתח עם המסך במשך 24-48 שעות.</li>
</ol>4. הדמיה וכימות של שומנים מופרדים TLC
<ol><li>הסר את המסך מהקלטת המתפתחת והצב בתוך צלם זרחן. בחר באפשרות הדמיית זרחן ופתח ב- V 800-1000. הערה: הדמיית זרחן מעניקה תצוגה איכותית של שומנים עם תווית רדיו על צלחת TLC. עם זאת, כימות של שומנים radiolabeled הוא הטוב ביותר מושגת על ידי ספירת נוצץ, אשר מתואר לאחר מכן.</li>
	<li>מערבבים 100 מ"ל של ריאגנט p-anisaldehyde (ראה קובץ משלים)ומפקידים בבקבוק ספריי זכוכית. מרססים את צלחת TLC עם ריאגנט p-אניסלדהיד עד שהסיליקה רוויה. אופים את הצלחת בתנור 145 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, או עד להקות הופיעו.</li>
	<li>כדי לכמת מינים בודדים של שומנים באמצעות ספירת נוצץ radiolabel, השתמש בסכין גילוח כדי לגרד את ג'ל הסיליקה מצלחת TLC הזכוכית. מעבירים כל רצועת ג'ל סיליקה המתאימה למין שומנים עם תווית רדיו אחת ללוויה נוצצת מזכוכית ומוסיפים נוזל נוצצת של 6 מ"ל. מערבולת במרץ עד הלהקה סיליקה צומצמה לחתיכות קטנות.<ol>
<li>לחלופין, שומנים ניתן לחלץ מרצועת ג'ל סיליקה באמצעות פרוטוקול מיצוי השומנים בסעיף 3. אם שומנים מופקים מג'ל סיליקה, לאדות את הממס לחלוטין כמו בשלב 3.1, ולהוסיף 6 מ"ל נוזל נצנוץ שומנים מיובשים. מניחים את המדף המכיל בקבוקוני נצנצים לתוך דלפק נוצץ. בחר באפשרות ספירת ארון תקשורת יחיד והתאם את זמן הספירה ל- 2 דקות לכל מתקן. תוצאות מדלפק הניצוץ יודפסו וניתן יהיה לדמייןן כגרף עמודות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li>
<li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li>
<li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li>
<li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+atherosclerosis%3A+A+perspective+for+the+1990s%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li>
<li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet%3A+A+conserved+cellular+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li>
<li>Wältermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes%3A+How+bacteria+fatten+up%3A+Lipid-body+formation+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li>
<li>Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li>
<li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).</li>
<li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li>
<li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li>
<li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+%5BRNQ%2B%5D+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Separations%22%5BJournal%5D)">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006(2018).</li>
<li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).</li>
<li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li>
<li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Bligh+and+Dyer%22+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים בהכנת כתב יד זה.

כאן, פרוטוקול radiolabeling תכליתי תכליתי כדי לפקח כמותית על הסינתזה של מינים NL בשמרים מוצג. פרוטוקול זה הוא מודולרי מאוד, המאפשר לסיים את ההליך בתוך 3-6 ימים. בנוסף, שפע של ספרות קיים על השימוש TLC להפריד מינים שומנים ומטבוליטים, אשר אמור לאפשר למשתמש לזהות כמה מינים שומנים של עניין עם שינוי פשוט של מערכות ממס TLC16,19. פרוטוקול זה תורם להפרדה, איתור וכימות של שומנים עם כיתוב רדיו. זה יכול גם להיות יחד עם תקופת מרדף במדיה לא מתויגת כדי לזהות את זמן המחזור של NL...

אצטיל-CoA הוא אבן הבניין הבסיסית של ביומולקולות מגוונות כולל שומנים ניטרליים (NLs), המשמשים מטבע ביומולקולרי רב-תכליתי לבניית ממברנות, יצירת ATP, ויסות איתות תאים1,2. הזמינות של NLs להיות מנודה לתוך כל אחד מהמסלולים האלה בהתאמה הוא, בחלקו, מוסדר על ידי האחסון שלהם. טיפות שומנים בדם (LDs), אברונים ציטופלסמיים המורכבים מלטיבות הידרופוביות של טריגליצרידים (TGs) ואסטרים סטרול (SEs), הם תאי האחסון העיקריים של רוב ה- NLs הסלולריים. ככזה, LDs לבודד ולווסת NLs, אשר ניתן להשפיל ולאחר מכן מנוצל לתהליכים ביוכימיים ומטבוליים3,4. זה ידוע כי הרגולציה השגויה של חלבונים הקשורים NL ו- LD מתואמת עם תחילת פתולוגיות כולל lipodystrophy ותסמונות מטבוליות5,6. בגלל זה, מחקר LD הנוכחי מתמקד מאוד על איך סינתזה NL מוסדר מרחבי, זמני, ועל פני רקמות נפרדות של אורגניזמים רב תאיים. בשל התפקידים התאיים בכל מקום עבור NLs, אנזימים רבים האחראים על סינתזה ורגולציה של NLs נשמרים ברחבי eukaryotes7. ואכן, אפילו כמה פרוקריוטים מאחסנים NLs ב- LDs8. לכן, אורגניזמים מודל מתיחה גנטית כגון Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים) היו שימושיים לחקר סינתזה ורגולציה NL.
ההפרדה וכימות של NLs מתמציות תאים ניתן לבצע במספר עצום של דרכים, כולל ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה גז (GC-MS), כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), וספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC-MS)9,10,11. אולי השיטה הפשוטה ביותר להפרדת NLs היא באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC), המאפשרת כימות צפיפות לאחר מכן מעקומה סטנדרטית12,13. למרות TLC מספק רק הפרדה מגורענת כמובן של NLs, זה נשאר טכניקה חזקה כי זה זול, וזה מאפשר הפרדה מהירה של NLs מכמה דגימות בו זמנית. שניים מהאתגרים הבולטים ביותר העומדים בפני המחקר של NLs באמצעות TLC הם: 1) המגוון הרחב של שפע תאי של מינים NL והמתווכים שלהם, ו -2) מגוון ההידרופיליות / הידרופוביה של מתווכים שומנים בתוך מסלולי סינתזה NL. כתוצאה מכך, הכימות של מינים NL באמצעות TLC מוגבל בדרך כלל למינים הנפוצים ביותר; עם זאת, הקדמה של 14C-חומצה אצטית radiolabel יכול לשפר באופן משמעותי את הזיהוי של מתווכים שפע נמוך בתוך מסלולי NL. חומצה אצטית מומרת במהירות לאצטיל-CoA על ידי אצטיל-CoA סינתטאז ACS214, מה שהופך 14חומצה C-אצטית מצע רדיובליבלי מתאים בשמרים15. בנוסף, הפרדה של NLs הידרופובית ומתווכים הידרופיליים של NLs ניתן להשיג על ידי TLC באמצעות מערכות ממס מרובות16. כאן, שיטה מוצגת להפרדה של NLs באמצעות 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי בשמרים. שומנים המסומנים במהלך תקופת הדופק מבודדים לאחר מכן על ידי פרוטוקול בידוד שומנים מוחלט מבוסס היטב17, ואחריו ההפרדה של מינים NL על ידי TLC. פיתוח לוחות TLC על ידי אוטורדיוגרפיה כדי לדמיין שומנים מסומנים, ותרסיס כימי כדי לדמיין שומנים מוחלטים, מאפשר שיטות מרובות של כימות. רצועות שומנים בודדות ניתן גם לחלץ בקלות מצלחת TLC באמצעות סכין גילוח, וספירת נוצץ יכול לשמש כדי לכמת את כמות החומר radiolabeled בתוך הלהקה.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] חומצה אצטית פעילות ספציפית למלח נתרן: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול מוחלט</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית שטופים בחומצה 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>נורות ענבר לפיפטות פסטור</td><td>פישר</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום גופרתי >99%</td> <td>סיגמא</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>בקמן LS6500 מונה נצנוץ</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם (דרגת HPLC)</td><td>פישר</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול >99%</td> <td>סיגמא</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>כולסטריל-לינולאט >98%</td> <td>סיגמא</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית מרוכזת</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning צינורות חרוטיים 50 מ"ל, פוליפרופילן עם כובע צנטריסטאר</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז, כיתה נטולת מים</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl אתר נטול מים כיתה</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>תנור ייבוש</td><td>פישר</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>נוזל נצנוץ EcoLume</td><td></td> צנטריפוגה <td>VWR</td> IC88247001 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R</td><td>פישר</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE מסך זרחן אחסון</td><td>סיגמא</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE טייפון FLA9500 הדמיה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית בדרגת ACS</td><td>סיגמא</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית 6 מ"ל בקבוקוני נצנוץ</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>מכסי צינור צנטריפוגה זכוכית</td><td>פישר</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה מזכוכית</td><td>פישר</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה מזכוכית פסטר</td><td>פישר</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן, סיגמא נטול מים</td><td></td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-אדנין >99%</td> <td>סיגמא</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-אלנין >98%</td> <td>סיגמא</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>ל-ארגינין >99%</td> <td>סיגמא</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>ל-אספרגין >98%</td> <td>סיגמא</td><td>A0884</td><td></td></tr>, <tr><td>ל-אספרטט >98%</td> <td>סיגמא</td><td>A9256</td><td></td></tr>, <tr><td>ל-ציסטאין >97%</td> <td>סיגמא</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>ל-גלוטמית, מלח מונוסודיום מונוהידרט >98%</td> <td>סיגמא</td><td>49621</td><td></td></tr>, <tr><td>ל-גלוטמין >99%</td><td>סיגמא</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-גליצין >99%</td> <td>סיגמא</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-היסטידין >99%</td> <td>סיגמא</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-איזולאוצין >98%</td> <td>סיגמא</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין >98%</td> <td>סיגמא</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>ל-ליזין >98%</td> <td>סיגמא</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>ל-מתיונין,</td><td>סיגמא</td> <td>בדרגת HPLCM9625</td><td></td></tr><tr><td>L-פנילאלנין, בדרגת ריאגנט</td><td>, Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr>, <tr><td>L-פרולין >99%</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr>, <tr><td>L-סרין >99%</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr>, <tr><td>L-תרונין, בדרגת ריאגנט</td><td>, Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr>, <tr><td>L-טריפטופן >98%</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr>, <tr><td>L-טירוזין >98%</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracil >99%</td> <td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine >98%</td> <td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr> מתנול, חומצה אולאית <tr><td>בדרגת ACS</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>>99%</td> <td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-anisaldehyde</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>אתר נפט, סיגמא בדרגת ACS</td><td></td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>פוספטידילכולין, דיפלמיטואיל >99%</td> <td>סיגמא</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות</td><td>אפנדורף</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי,</td> כדורי נתרן הידרוקסיד <td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td>בדרגת ACS</tr>, חומצה סוקסינית <tr><td>מאושרת, ACS</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>סקוואלן >98%</td> <td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td> גבישי / מוסמך</td><td>פישר</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>כרית רוויה TLC</td><td>סיגמא</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLC סיליקה ג'ל 60 גרם צלחת מתעלות זכוכית</td><td>פישר</td><td>NC9825743</td><td>ללא מחוונים פלואורסצנטיים</td></tr><tr><td>שקיפות סרט פלסטיק</td><td>אפולו</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>טריצ'ין</td><td>סיגמא</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>טריאולאין >99%</td> <td>סיגמא</td><td>מערבל מערבולת T7140</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>קלטת חשיפה של ווטמן</td><td>סיגמא</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים ללא אמוניום גופרתי וחומצות אמינו</td><td>סיגמא</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

שומנים ניטרליים (NLs) הם סוג של ביומולקולים הידרופוביים ללא תשלום הממלאים תפקידי מפתח באנרגיה והומאוסטזיס שומנים בדם. NLs הם מסונתז דה נובו מאצטיל-CoA והם נוכחים בעיקר אאוקריוטים בצורה של טריגליצרידים (TGs) ו אסטרים סטרול (SEs). האנזימים האחראים על הסינתזה של NLs נשמרים מאוד מ Saccharomyces cerevisiae (שמרים) לבני אדם, מה שהופך שמרים אורגניזם מודל שימושי לנתח את הפונקציה ואת הרגולציה של אנזימי חילוף החומרים NL. בעוד הרבה ידוע על איך אצטיל-CoA מומר קבוצה מגוונת של מינים NL, מנגנונים לוויסות אנזימי חילוף החומרים NL, וכיצד ויסות שגוי יכול לתרום פתולוגיות הסלולר, עדיין מתגלים. שיטות רבות לבידוד ואפיון של מינים NL פותחו ושימשו במשך עשרות שנים של מחקר; עם זאת, פרוטוקול כמותי ופשוט לאפיון מקיף של מינים NL גדולים לא נדון. כאן, שיטה פשוטה ומסתגלת לכמת את סינתזת דה נובו של מינים NL גדולים בשמרים מוצגת. אנו מיישמים 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי בשילוב עם כרומטוגרפיה שכבה דקה כדי להפריד ולכומת מגוון רחב של NLs חשוב מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם בקלות ללמוד בשיעורי התגובה vivo של אנזימי NL או השפלה של מינים NL לאורך זמן.

בפרוטוקול זה, הוכחנו כי תיוג, זיהוי וכימות של מינים NL יכול להתבצע על ידי 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי. מינים NL העיקריים ניתן להפריד במערכת ממס של 50:40:10:1 (v /v/v/v%) Hexane:אתר נפט:אתר Diethyl:חומצה אצטית (איור 1A, B). הדמיית זרחן מאפשרת הדמיה חזותית של חומצת שומן חופשית מסומנת (FFA), טריאציליגליצרול (TG), דיאקיליגליצרול (DG), כולסטרול (Chol) וסקוואלן (SQ)(איור 1A). למרות SEs ניתן להפריד ממיני NL אחרים בממס זה, אף אחד לא מזוהה aut...

כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

טכניקה זו משתמשת במכשירים הנמצאים בדרך כלל ברוב סביבות המעבדה ומאפשרת ניתוח של מספר דגימות בו זמנית. שיטה זו יכולה לספק תובנות מרכזיות כיצד אנזימי חילוף החומרים של השומנים מוסדרים בהקשר תאי וברקע גנטי שונה. לחסן מושבה מצלחת תרבות שמרים לתוך 20 מיליליטר של מדיה SC המכיל 2%דקסטרוז ודגורה ב 30 מעלות צלזיוס ללילה עם רועד ב 200 סל"ד.למחרת, לדלל את התרבות ב 50 מיליליטר של מדיה טרייה למנת יתר סופית של 0.2 ולהגדיל אותו במשך 24 שעות עד לשלב הנייח הגיע. הכן שני aliquots 20 מיליליטר של מאגר מרווה עבור כל מדגם ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. בו זמנית, להכין מדיה radiolabeling על ידי הוספת מלח נתרן חומצה אצטית כדי דקסטרוז חינם SC מדיה בריכוז הסופי של 10 מיקרוקורי למיליליטר.לאסוף את התאים על ידי centrifuging ב 4, 100 x g במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף את גלולה התא פעם אחת עם 20 מיליליטר של מדיה SC חינם דקסטרוז. לאסוף את התאים שוב על ידי צנטריפוגה ב 4, 100 x g במשך חמש דקות ולהעביר אותם לצינור microcentrifuge שני מיליליטר שכותרתו באמצעות מדיה חופשית dextrous.צנטריפוגה התאים לעוד שתי דקות. Resuspend התאים ב 500 microliters של מדיה SC חינם דקסטרוז ולהתחיל את תקופת radiolabeling על ידי הוספת במהירות 500 microliters של מדיה radiolabeling לכל מתלה תא. לדגור על הצינורות באינקובטור מסתובב ב 30 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.בינתיים, מראש לקרר את הצנטריפוגה מצויד 50 מיליליטר צינורות חרוט למינוס 10 מעלות צלזיוס ולהפשיר אחד 20 מיליליטר aliquots של חיץ מרווה. לאחר שתקופת ההבלים הסתיימה, השתמש בצינור כדי לצלול את כל דגימת המיליליטר לתוך חיץ מרווה מופשר על קרח. לאסוף את גלולה התא על ידי ספינינג בצנטריפוגה מקורר מראש ב 5, 000 x g במשך שלוש דקות ולהוסיף 20 מיליליטר של חוצץ מרווה קר טרי.מערבולת ולנער את הדגימות כדי resuspend אותם במלואו חוצץ מרווה צנטריפוגות הדגימות שוב כדי לאסוף את התאים. לאחר שהתאים הם גלולה, ביסודיות להסיר את כל חוצץ מרווה מן הדגימות על ידי שפיכת supernatant והסרת עודף עם pipette. לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס לעיבוד נוסף.שוקלים 0.3 גרם של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה עבור כל דגימה ומאחסנים אותם בשני צינורות מיקרוצנטריפוגה של מיליליטר על קרח. מוציאים את כדורי התא מהמקפיא של מינוס 80 מעלות ומניחים אותם על קרח. לאחר מכן, להוסיף 350 microliters של מתנול ו 700 microliters של כלורופורם לכל מדגם ו resuspend התאים.מעבירים אותם לצינורות צנטריפוגות זעירים המכילים חרוזי זכוכית ששוקל מראש. ללקק את התאים על ידי מערבולת שלוש פעמים במשך דקה אחת, עם דגירה של 30 שניות על קרח בין תסיסה. יוצקים את התאים לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית 15 מיליליטר ולתייג את הצינור כמו צינור A.Wash צינור microcentrifuge עם מיליליטר אחד של מתנול, מערבולת זה, ויוצקים את המתנול לתוך צינור A.Add שני מיליליטר של כלורופורם ואחריו 400 microliters של מים צינור A עבור נפח מדגם סופי של 4.45 מיליליטר.מערבולת הדגימות במשך דקה אחת ואחריו צנטריפוגה של חמש דקות ב 1000 x g כדי להפריד בבירור את השלבים מימיים ואורגניים עם פסולת תאים שוכב בממשק. באמצעות פיפטה מרעה זכוכית, לאסוף את השלב האורגני לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית חדשה שכותרתו B ולהוסיף מיליליטר אחד של אשלגן כלורי טוחן אחד. הוסף מיליליטר אחד של מתנול ושני מיליליטר של כלורופורם לצינור A ולחזור על מערבולות וצעדי צנטריפוגה.מערבולת וצינור צנטריפוגה B כדי להפריד את השלב מימי ואורגני. מוציאים את השכבה מימית העליונה ואוספים את כל השכבה האורגנית התחתונה ל בקבוקון זכוכית של ארבעה מיליליטר. מתאדים לחלוטין את הממס מתמציות השומנים על ידי ייבוש תחת גז אינרטי לחמם תנור ל 145 מעלות צלזיוס לחימום צלחת TLC.לקבוע כמויות יחסיות של radiolabel נלקח על ידי התאים לפני טעינת אותם על צלחת TLC. ליישב מחדש את השומנים מדגם ב 40 עד 50 microliters של כלורופורם ומתנול מעורבב ביחס של אחד לאחד על ידי מערבולת במשך חמש דקות. הכן 101 מיליליטר של ממס פאזה ניידת בגליל בוגר זכוכית.לאחר מכן, יוצקים את הממס לתוך תא TLC זכוכית המכיל כרית רוויה 20 על 20 TLC ומכסה הולם הדוק. הכן צלחת 20 על 20 סיליקה ג'ל 60G ולסמן קו 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של הצלחת באמצעות עיפרון. לאחר הצלחת כבר מחומם מספיק ואת כרית רווי TLC רווי ממס, להסיר את צלחת TLC מהתנור מיד להמשיך לטעון אותו.באמצעות פיפטה, לזהות חמישה microliters של מדגם על המקור של כל נתיב הממוקם 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של צלחת TLC וטעינה חוזרת עד 20 עד 40 microliters של מדגם כבר טעון לתוך כל נתיב. לאחר התקן ואת הדגימות כבר טעון, למקם את הצלחת בתא המתפתח ולחכות עד הממס הגיע לחלק העליון של הצלחת. כאשר הצלחת מפותחת במלואה, להסיר אותו מהתא ולאפשר לו להתייבש במכסה המנוע אדים במשך 20 דקות.לאחר הצלחת מיובשת, לכסות אותו עם סרט פלסטיק ומניחים אותו בקלטת מתפתחת עם מסך אוטוקרדיוגרפיה. הסר את המסך מהקלטת המתפתחת והצב אותו בתוך צלם זרחן. מרססים את צלחת TLC עם ריאגנט p-Anisaldehyde עד שהסיליקה רוויה, ואז אופים אותה בתנור של 145 מעלות במשך חמש דקות או עד שהלהקות הופיעו.כדי לכמת מינים שומנים, לגרד את ג'ל סיליקה המכיל מינים בודדים שומנים ולהעביר אותם בקבוקונים נוצצת זכוכית. מוסיפים שישה מיליליטרים של נוזל נוצץ ומערבולת במרץ עד רצועת סיליקה צומצמה לחתיכות קטנות. מניחים את המדף עם בקבוקוני הניקוד לתוך דלפק נוצץ וסופרים על ידי התאמת זמן הספירה לשתי דקות לכל בקבוקון.הדמיית זרחן מאפשרת הדמיה של autoradiogram של חומצת שומן ללא תווית, triacylglycerol, דיאקיליגליצרול, כולסטרול, סקוואלן. הוכח כי מינים שומנים מטוהרים ניתן להפריד בשיטה זו ולאחר מכן לדמיין על ידי ריסוס של צלחת TLC עם ריאגנט p-Anisaldehyde. מינים חזותיים כוללים את כל השומנים שהוזכרו בעבר בנוסף לאסטרים סטריליים.על ידי החלת תקופת מרדף של 10 דקות במדיה נטולת רדיובל בעקבות הדופק, זה נצפה בבריכה העיקרית של סקוואלן נעלם והכולסטרול הכולל היה גבוה. באופן דומה, המראה של diacylglycerol בתקופת המרדף בקורלציה עם ירידה אות חומצות שומן חופשיות. לפני ביצוע הפרוטוקול המלא, חשוב לקבוע אם התאים ספיגת radiolabel חומצה אצטית במצב הצמיחה ורקע גנטי של עניין.

analysis-neutral-lipid-synthesis-saccharomyces-cerevisiae-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות...

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להשיג את השומנים droplet אינדקס (אינדקס LD) ללמוד את הדינמיקה של triacylglycerols בתאים בתרבית בניסויים תפוקה גבוהה. LD אינדקס וזמינותו היא שיטה קלה ומהימנה של המשתמשת BODIPY 493/503. Assay הזה אינו צריך שאיבת השומנים dispendious או ניתוח מיקרוסקופ.

השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

למדו פרוטוקול לכימות סינתזת שומנים נייטרליים ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות תיוג מטבולי וכרומטוגרפיה שכבה דקה. השיטה מאפשרת ניתוח מדויק של מטבוליזם שומנים ורגולציית אנזימים בחיידקי שמרים.

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

גלה סרטונים נוספים