ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

טכניקה זו משתמשת במכשירים הנמצאים בדרך כלל ברוב סביבות המעבדה ומאפשרת ניתוח של מספר דגימות בו זמנית. שיטה זו יכולה לספק תובנות מרכזיות כיצד אנזימי חילוף החומרים של השומנים מוסדרים בהקשר תאי וברקע גנטי שונה. לחסן מושבה מצלחת תרבות שמרים לתוך 20 מיליליטר של מדיה SC המכיל 2%דקסטרוז ודגורה ב 30 מעלות צלזיוס ללילה עם רועד ב 200 סל"ד.

למחרת, לדלל את התרבות ב 50 מיליליטר של מדיה טרייה למנת יתר סופית של 0.2 ולהגדיל אותו במשך 24 שעות עד לשלב הנייח הגיע. הכן שני aliquots 20 מיליליטר של מאגר מרווה עבור כל מדגם ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. בו זמנית, להכין מדיה radiolabeling על ידי הוספת מלח נתרן חומצה אצטית כדי דקסטרוז חינם SC מדיה בריכוז הסופי של 10 מיקרוקורי למיליליטר.

לאסוף את התאים על ידי centrifuging ב 4, 100 x g במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף את גלולה התא פעם אחת עם 20 מיליליטר של מדיה SC חינם דקסטרוז. לאסוף את התאים שוב על ידי צנטריפוגה ב 4, 100 x g במשך חמש דקות ולהעביר אותם לצינור microcentrifuge שני מיליליטר שכותרתו באמצעות מדיה חופשית dextrous.

צנטריפוגה התאים לעוד שתי דקות. Resuspend התאים ב 500 microliters של מדיה SC חינם דקסטרוז ולהתחיל את תקופת radiolabeling על ידי הוספת במהירות 500 microliters של מדיה radiolabeling לכל מתלה תא. לדגור על הצינורות באינקובטור מסתובב ב 30 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

בינתיים, מראש לקרר את הצנטריפוגה מצויד 50 מיליליטר צינורות חרוט למינוס 10 מעלות צלזיוס ולהפשיר אחד 20 מיליליטר aliquots של חיץ מרווה. לאחר שתקופת ההבלים הסתיימה, השתמש בצינור כדי לצלול את כל דגימת המיליליטר לתוך חיץ מרווה מופשר על קרח. לאסוף את גלולה התא על ידי ספינינג בצנטריפוגה מקורר מראש ב 5, 000 x g במשך שלוש דקות ולהוסיף 20 מיליליטר של חוצץ מרווה קר טרי.

מערבולת ולנער את הדגימות כדי resuspend אותם במלואו חוצץ מרווה צנטריפוגות הדגימות שוב כדי לאסוף את התאים. לאחר שהתאים הם גלולה, ביסודיות להסיר את כל חוצץ מרווה מן הדגימות על ידי שפיכת supernatant והסרת עודף עם pipette. לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס לעיבוד נוסף.

שוקלים 0.3 גרם של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה עבור כל דגימה ומאחסנים אותם בשני צינורות מיקרוצנטריפוגה של מיליליטר על קרח. מוציאים את כדורי התא מהמקפיא של מינוס 80 מעלות ומניחים אותם על קרח. לאחר מכן, להוסיף 350 microliters של מתנול ו 700 microliters של כלורופורם לכל מדגם ו resuspend התאים.

מעבירים אותם לצינורות צנטריפוגות זעירים המכילים חרוזי זכוכית ששוקל מראש. ללקק את התאים על ידי מערבולת שלוש פעמים במשך דקה אחת, עם דגירה של 30 שניות על קרח בין תסיסה. יוצקים את התאים לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית 15 מיליליטר ולתייג את הצינור כמו צינור A.Wash צינור microcentrifuge עם מיליליטר אחד של מתנול, מערבולת זה, ויוצקים את המתנול לתוך צינור A.Add שני מיליליטר של כלורופורם ואחריו 400 microliters של מים צינור A עבור נפח מדגם סופי של 4.45 מיליליטר.

מערבולת הדגימות במשך דקה אחת ואחריו צנטריפוגה של חמש דקות ב 1000 x g כדי להפריד בבירור את השלבים מימיים ואורגניים עם פסולת תאים שוכב בממשק. באמצעות פיפטה מרעה זכוכית, לאסוף את השלב האורגני לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית חדשה שכותרתו B ולהוסיף מיליליטר אחד של אשלגן כלורי טוחן אחד. הוסף מיליליטר אחד של מתנול ושני מיליליטר של כלורופורם לצינור A ולחזור על מערבולות וצעדי צנטריפוגה.

מערבולת וצינור צנטריפוגה B כדי להפריד את השלב מימי ואורגני. מוציאים את השכבה מימית העליונה ואוספים את כל השכבה האורגנית התחתונה ל בקבוקון זכוכית של ארבעה מיליליטר. מתאדים לחלוטין את הממס מתמציות השומנים על ידי ייבוש תחת גז אינרטי לחמם תנור ל 145 מעלות צלזיוס לחימום צלחת TLC.

לקבוע כמויות יחסיות של radiolabel נלקח על ידי התאים לפני טעינת אותם על צלחת TLC. ליישב מחדש את השומנים מדגם ב 40 עד 50 microliters של כלורופורם ומתנול מעורבב ביחס של אחד לאחד על ידי מערבולת במשך חמש דקות. הכן 101 מיליליטר של ממס פאזה ניידת בגליל בוגר זכוכית.

לאחר מכן, יוצקים את הממס לתוך תא TLC זכוכית המכיל כרית רוויה 20 על 20 TLC ומכסה הולם הדוק. הכן צלחת 20 על 20 סיליקה ג'ל 60G ולסמן קו 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של הצלחת באמצעות עיפרון. לאחר הצלחת כבר מחומם מספיק ואת כרית רווי TLC רווי ממס, להסיר את צלחת TLC מהתנור מיד להמשיך לטעון אותו.

באמצעות פיפטה, לזהות חמישה microliters של מדגם על המקור של כל נתיב הממוקם 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של צלחת TLC וטעינה חוזרת עד 20 עד 40 microliters של מדגם כבר טעון לתוך כל נתיב. לאחר התקן ואת הדגימות כבר טעון, למקם את הצלחת בתא המתפתח ולחכות עד הממס הגיע לחלק העליון של הצלחת. כאשר הצלחת מפותחת במלואה, להסיר אותו מהתא ולאפשר לו להתייבש במכסה המנוע אדים במשך 20 דקות.

לאחר הצלחת מיובשת, לכסות אותו עם סרט פלסטיק ומניחים אותו בקלטת מתפתחת עם מסך אוטוקרדיוגרפיה. הסר את המסך מהקלטת המתפתחת והצב אותו בתוך צלם זרחן. מרססים את צלחת TLC עם ריאגנט p-Anisaldehyde עד שהסיליקה רוויה, ואז אופים אותה בתנור של 145 מעלות במשך חמש דקות או עד שהלהקות הופיעו.

כדי לכמת מינים שומנים, לגרד את ג'ל סיליקה המכיל מינים בודדים שומנים ולהעביר אותם בקבוקונים נוצצת זכוכית. מוסיפים שישה מיליליטרים של נוזל נוצץ ומערבולת במרץ עד רצועת סיליקה צומצמה לחתיכות קטנות. מניחים את המדף עם בקבוקוני הניקוד לתוך דלפק נוצץ וסופרים על ידי התאמת זמן הספירה לשתי דקות לכל בקבוקון.

הדמיית זרחן מאפשרת הדמיה של autoradiogram של חומצת שומן ללא תווית, triacylglycerol, דיאקיליגליצרול, כולסטרול, סקוואלן. הוכח כי מינים שומנים מטוהרים ניתן להפריד בשיטה זו ולאחר מכן לדמיין על ידי ריסוס של צלחת TLC עם ריאגנט p-Anisaldehyde. מינים חזותיים כוללים את כל השומנים שהוזכרו בעבר בנוסף לאסטרים סטריליים.

על ידי החלת תקופת מרדף של 10 דקות במדיה נטולת רדיובל בעקבות הדופק, זה נצפה בבריכה העיקרית של סקוואלן נעלם והכולסטרול הכולל היה גבוה. באופן דומה, המראה של diacylglycerol בתקופת המרדף בקורלציה עם ירידה אות חומצות שומן חופשיות. לפני ביצוע הפרוטוקול המלא, חשוב לקבוע אם התאים ספיגת radiolabel חומצה אצטית במצב הצמיחה ורקע גנטי של עניין.