ייצור והרחבה של קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים

זהו מתקני פרוטוקול מקיפים, ייצור מגביר גלם, ולהשתמש בהסתערות של מטופל ספציפי, תרבויות מתאי דם מונונוקלאריים היקפיים. טקטיקות אלה ניתנות לשחזור וקל לעקוב אחריהן, במיוחד למתחילים. ואל תדרוש, מומחיות מיוחדת בבלדות תאי גזע, או רפואת לב וכלי דם.

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי ליצור קרדיומיוציטים ספציפיים למטופלים מתוך בדיקת דם אחת שניתן להשתמש בהן למידול מחלות לב וכלי דם ובדיקת רעילות הלב של תרופות חדשניות. פרוטוקול זה דורש מחויבות ארוכת שנים לתכנות מחדש של תאי גזע לתחזוקה ובידול מכוון. עם זאת, אתה באמת מעריך את המאמצים שלך.

כאשר אתה רואה להכות קרדיומיוציטים בצלחת. כאשר מושבות IPSC האנושיות מגיעות ליותר מ-90% השפעה, יש לשטוף כל אחת מהבאר בשלושה מיליליטר של DPBS לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של 0.5 מילימטר EDTA ב- DPBS לבאר ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש עד שמונה דקות, להוסיף מיליליטר אחד של iPSC עובר מדיום לכל באר באופן ידני להסיר את התאים.

העבר 600 עד 900 מיקרוליטרים של התאים לבארות בודדות יש קרום מרתף מצופה שש צלחת באר עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ואז לרענן את התרבויות עם שני מיליליטר של מדיום E8 מלא כל יום במשך שלושה עד ארבעה ימים. כאשר התרבות הגיעה למפגש, החליפו את המדיום בשני מיליליטרים של מדיום בידול קרדיומיוצייט, שניים לבאר.

ביום השני, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני אחד. ביום השלישי, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני שלוש. ביום החמישי.

החלף את supernatant עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני אחד. ביום השביעי עד העשירי, החלף את הסופר-נט בשני מיליליטר של בידול קרדיומיוצייט בינוני ארבע. בימים 11 ו-13.

כאשר תאים מתכווצים נצפים, להחליף את supernatant עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני חמש. בימים 15, 17, 19 ו-21. החלף את supernatant עם שני מיליליטר של בידול לבומיוצייט בינוני ארבע.

לאחר טרום-תרבות עם מדיום דם מלא לשבעה ימים, PBMC של להיות גדול עם גרעינים גלויים ציטופלסמה המציין כי הם מוכנים transfection עם וירוס סנדאי תכנות גורמים תכנות מחדש. עם היכרות עם מדיום E8 מלא. התאים המתוכנתים מחדש לחלוטין יתחברו ויתחילו ליצור מושבות.

לאחר ארבעה עד חמישה מעברים, מושבות IPSC טהורות מאוד ייווצרו מהתאים המתוכנתים מחדש עם מעט מאוד תאים מובחנים שנצפו. בשלב זה, רוב התאים הם OCT4 ו NANOG חיובי מעיד על pluripoteny שלהם. להכות קרדיומיוציטים נצפים בדרך כלל לאחר 12 ימים של בידול.

לאחר רעב גלוקוז, ותערוכות iPSC cardiomyocytes תערוכות, מכות ספונטניות, ומבנה סרקומר מיושר עם טרופונין לב משולב T וביטוי אלפא אקטינין. המושבות שומרות על טוהרן כפי שמעיד ביטוי טרופונין טי שלהן. למרות iPSC cardiomyocytes הם יחסית לא בוגרים בהשוואה cardiomyocytes למבוגרים.

הם מדגימים פוטנציאל פעולה חדרית ואירוזים כפי שהם נמדדים על ידי תיקון סיטונאי, מהדק. קרדיומיוציטים חדריים מבטאים שרשרת אור מיוסין 2, ואילו קרדיומיוציטים iPSC מפרזדורים מסומנים על ידי ביטוי NR2F2. הפעלת Wnt מעוררת חלוקת תאים ומקדמת את הביטוי של רגולטורים של מחזור התא.

מעניין, הפעלת Wnt גם מעוררת את ההתפשטות החזקה של cardiomyocytes iPSC מוקדם עבור שני קטעים לעומת פקדים, אם כי יכולת שגשוג זה פוחתת עם הזמן. ודא כי PBMS מוגדלים עם גרעין ברור ציטופלסמה לפני וקטורים תכנות iPSC מוצגים כמו המצב של PBMs הוא קריטי עבור תכנות מחדש IPSC. קרדיומיוציטים ספציפיים למטופל הם בעלי ערך למידול מחלות לב וכלי דם במבחנה ולספק המון תאים תורמים לטיפול בתאי גזע לבביים.