זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

ההקרנה של תרכובות אורגניות קטנות יותר הנקראות שברים באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא שיטה יעילה לזיהוי מולקולות שהן נקודות התחלה לגילוי תרופות או פיתוח תרכובות של כלים ביוכימיים. הקרנת שברים קריסטלוגרפיים חשפה לא רק את הזהות, אלא גם היכן וכיצד השברים נקשרים על פני השטח של החלבון תחת מחקר. טכניקה זו יכולה לשמש על כל יעד חלבון ביוכימי או רפואי רלוונטי שעבורו ניתן לגדל גבישי חלבון מתאימים.

איכות התוצאות קשורה קשר הדוק לאיכות הטיפול במדגם. אנו מאמינים כי ההדגמה החזותית הבאה תסייע לחוקרים לבצע ניסויים באיכות גבוהה. הדגמת ההליך תהיה טטיאנה ברתל, דוקטורנטית וסטודנטית לדוקטורט במעבדה שלי.

כדי להתחיל, לחתוך לפתוח את התיק של צלחת ההקרנה מראש מחומם לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את המכסה ואת נייר הכסף מצלחת ההקרנה. תדקנו את תמיסת ההשריה של 5 מיליליטר במאגר ריאגנט. לאחר מכן מלאו כל אחד מ-96 המאגרים של הצלחת ב-40 מיקרוליטרים של תמיסת השרייה בעזרת פיפטה של 12 ערוצים.

הנח את מסגרת הגישה הקלה על גבי לוחית ההקרנה ואבטח אותה עם המהדקים הכלולים על-ידי החלקתם לצד השמאלי והימני של המכשיר. הנח את לוח ההקרנה ואת מסגרת הגישה הקלה מתחת למיקרוסקופ והחלק פתח את הבאר הראשונה על-ידי הזזת אריח הזכוכית האקרילי בהתאמה של המסגרת. הוסף 0.4 מיקרוליטרים של פתרון השרייה מהמאגר לרסיס המכיל היטב באמצעות קצה פיפטה טרי.

ודא שהטיפה מכסה את השבר המיובש. מניחים את צלחת ההתגבשות המכילה את הגבישים הגדולים ביותר תחת המיקרוסקופ השני וחותכים את רדיד האיטום באחת הבארות. באמצעות לולאה בגודל מתאים, להעביר גביש לבאר של צלחת ההקרנה תחת המיקרוסקופ הראשון.

לשטוף את הלולאה בצלחת ספוט זכוכית מוכן, ולאחר מכן לייבש אותו על ידי נגיעה בעדינות אותו לרקמה. לעשות זאת לאחר כל העברה כדי למנוע זיהום צולב. השתמש במיקרוסקופ כדי להבטיח כי הגביש הונח כראוי.

חזור על ההליך עבור הגביש השני. לעבור לבאר הבאה, ולחזור על ההליך עבור כל הבארות הנותרות. לאחר שהקריסטלים הועברו לכל 96 הבארות בלוח ההקרנה, הסירו את לוחית ההקרנה יחד עם מסגרת הגישה הקלה מתחת למיקרוסקופ והניחו אותה על הספסל או השולחן.

לאחר מכן הסירו את מסגרת הגישה הקלה מלוח ההקרנה, אטמו את צלחת ההקרנה בנייר איטום, והניחו אותה באינקובטור ההתגבשות או בארון כדי להדגיר לזמן ההשריה הממוטב. שעתיים של דגירה מספיקות, אבל לילה עשוי להיות נוח יותר. מכינים את קצף Unipuck דיואר עם שלושה מכסים Unipuck וחצי למלא אותו עם חנקן נוזלי, שמירה אותו על הקרקע.

מעבירים את דיואר החצי מלא לספסל, וממלאים אותו לגמרי עד הקצה. שמור אותו מלא לקצה העליון במהלך הניסוי כולו, ולהחליף את החנקן הנוזלי לעתים קרובות. מוציאים את לוחית ההקרנה מהחממה ומסירים את נייר הכסף שלה.

מקם את מסגרת הגישה הקלה למעלה. השקופית פתחה את הבאר הראשונה. קציר גביש אחד מהטיפה פלאש לקרר אותו חנקן נוזלי על ידי צלילה עם תנועה אנכית מהירה.

הכנס את הדגימה למיקום הדיסקית הנכון ורשם הערות רלוונטיות בגיליון המעקב לדוגמה. חזור על ההליך עבור הגביש השני. עבור לבאר הבאה וחזור על המיקום של גבישים אחרים עד שכל שלושת הדיסקיות מלאות.

מצננים מראש את בסיסי Unipuck בחנקן נוזלי, ומוסיפים אותם על גבי העפעפיים. אחסן את Unipucks בארון תקשורת אחסון בתחבורה דיואר או אחסון דיואר. שמור אותם חנקן נוזלי בטמפרטורות קריוגניות עד המדידה.

חזור על אותו הליך של קצירת ואחסון הגבישים ב Unipucks עבור הדגימות הנותרות בצלחת ההקרנה. השונות של מורפולוגיות הגביש לאחר ביצוע רסיס השריית וקצירת גביש מוצג כאן. אפילו גבישים שנראים התדרדרו במקצת נכללו, שכן הם עדיין גורמים לנתונים שימושיים.

הנתונים נאספו בקווי הקורה 14.1 ו-14.2 בסנכרון BESSY II. איסוף נתוני עקיפה בוצע עבור כל דגימה. הנתונים נותחו באמצעות FragMAXapp, תוך התמקדות בשילוב של XDSAPP לעיבוד, fspipeline עבור עידון מבנה, ו PenDA למציאת פגע.

זה הביא 15 להיטים על קומפלקס חלבון AR באמצעות מצב השרייה ללא DMSO. בקמפיין הקודם של מסך הכניסה F2X נגד אותו יעד, כולל DMSO במצב השרייה, נמצאו 20 כניסות. משמעות הדבר היא שניתן לזהות 75% מהלהיטים אם DMSO מושמט.

להצלחת הניסוי, חיוני שהקריסטלים יטופלו כראוי ובזהירות בכל שלב של ההליך. הקרנת שברים קריסטלוגרפיים התבגרה לטכניקה בשימוש נרחב, אשר מיושמת לעתים קרובות באקדמיה ובתעשיית התרופות.