טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים

אנו מתארים פרוטוקול מהיר וחזק להעשרת תאי T (iNKT) של הרוצח הטבעי invariant מטחול העכבר ולהרחיב אותם במבחנה למספרים מתאימים למחקרי מבחנה ומחקרי ויוו.

פרוטוקול זה מאפשר טיהור של תאי T דיו, שהם נדירים מאוד, ומאפשר הרחבה של פי 30 במספרם. הטיהור יכול להתבצע ביום אחד ולייצר מספר רב של תאי דיו T מוכנים לשימוש עבור in vivo ומחקרים במבחנה בעוד שבועיים. תוכיח את ההליך תהיה גלוריה דלפנטי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה.

לאחר ניתוח טחול העכבר, לרסק אותו דרך מסננת תא 70 ננומטר כדי לקבל השעיה תא יחיד ב 10 מיליליטר של PBS עם 2%FBS. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם מיליליטר אחד של אמוניום כלוריד חוצץ אשלגן ליצין סטרילי.

לדגור על התאים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לחסום עם חמישה מיליליטר של PBS עם 2% FBS. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר הסרת supernatant, resuspend גלולה התא בשלושה מיליליטר של PBS עם 2%FBS ולהסיר שאריות שומן על ידי pipetting.

עבור צעדי העשרה, לשמור על התאים קרים ולהשתמש פתרונות מקוררים מראש בארבע מעלות צלזיוס ולאחר מכן המשיך על קרח. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. resuspend כל התאים בכמות המתאימה של PBS עם 2%FPS וחוסם Fc ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לשטוף עם אחד עד שני מיליליטר של מאגר הפרדת MACS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. לאחר הסרת supernatant, להכתים את התאים עם CD19-FITC ו H2-IAb-FITC ודגרה במשך 15 דקות בחושך בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. לשטוף תאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.

הסר supernatant ו resuspend גלולה התא ב 90 microliters של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. הוסף 10 מיקרוליטרים של מיקרואורגניזמים נגד FITC לכל 10 מיליון תאים. מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס.

לשטוף את התאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend עד 125 מיליון תאים ב 500 microliters של מאגר MACS. מקם עמודת LD בשדה המגנטי של מפריד MACS.

כדי למנוע סתימה, החל מסנן לפני הפרדה על עמודת LD ושטוף אותו בשני מיליליטר של מאגר MACS. החל את ההשעיה של התא על המסנן ואסוף את התאים הלא עם תווית העוברים דרך העמודה. לשטוף את מאגר העמודים הריק שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר MACS.

לאסוף את הקולח המועשר של תאי T ולספור את התאים, שמירה על 50 microliters לניתוח FACS. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, להסיר את supernatant ולהכתים את התאים עם CD1d tetramer-PE. מערבבים היטב ודגרה במשך 30 דקות בחושך על קרח.

לשטוף את התאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות, להסיר את supernatant ו resuspend את גלולה התא ב 80 microliters של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. הוסף 20 מיקרוליטרים של מיקרואורגניזמים נגד PE לכל 10 מיליון תאים.

מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. לשטוף תאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend עד 100 מיליון תאים ב 500 microliters של מאגר MACS.

בהתאם לספירת התאים, מקם את העמודה LS או MS בשדה המגנטי של מפריד MACS ושטוף את העמודה במאגר MACS. החל את ההשעיה של התא על העמודה, לאסוף תאים ללא תווית העוברים ולשטוף את העמודה שלוש פעמים כמתואר קודם לכן. זהו השבר השלילי.

הסר את העמודה מהשדה המגנטי והצב אותה על צינור אוסף חדש. Pipette MACS חוצצים על העמודה ודוחפים את הבוכנה שסופקה לעמודה כדי לשטוף את השבר החיובי המועשר בתאי ה- INK T. כדי להגדיל עוד יותר את שחזור תאי ה- INK T, צנטריפוגה של השבר השלילי ב- 300 פעמים G במשך 10 דקות וחזר על השלבים הקודמים עם עמודת LS או MS חדשה.

משוך את השברים החיוביים וקבע את ספירת התאים. שמור 50 מיקרוליטרים של שברים חיוביים ושליליים לניתוח FACS כדי לבדוק את הטוהר. כדי להפעיל תאי INK T ביחס של אחד לאחד, העבר את הנפח המתאים של חרוזים מגנטיים נגד CD3 ו- CD28 לצינור ובנפח שווה של PBS, ולאחר מכן מערבולת למשך חמש שניות.

מניחים את הצינור על מגנט למשך דקה אחת ומשליכים את הסופר-נט. הסר את הצינור מן המגנט ו resuspend החרוזים המגנטיים שטף בנפח הנכון של RPMI. צנטריפוגה מטוהרת דיו T-תאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות ולערבב אותם עם עכבר T-activator נגד CD3 או CD28 חרוזים מגנטיים.

צלחת מיליליטר אחד של השעיית התא, נגד CD23 ו- CD28 חרוזים מגנטיים בצלחת 48-well עם 20 יחידות למיליליטר IL-2, ולאחר מכן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמישה ימים, להוסיף 10 ננוגרם למיליליטר IL-7. לפצל את התאים לשניים כאשר הם מגיעים 80 עד 90% מפגש, תמיד הוספת 20 יחידות למיליליטר IL-2 ו 10 ננוגרם למיליליטר IL-7.

בתנאים אלה, ניתן להרחיב את תאי ה- INK T למשך עד 15 יום. באמצעות פרוטוקול זה, תאי דיו T מועשרים מטחול העכברים מהונדסים באמצעות תהליך הפרדה אימונומי. לאחר ההעשרה, ניתן להרחיב את התאים עם חרוזי אנטי CD3 ו- CD28, וכתוצאה מכך התרחבות של פי 30 בממוצע ביום 14 של התרבות.

ההפעלה החזקה עם חרוזי אנטי-CD3 ואנטי-תקליטור גרמה לירידה בביטוי TCR של תאי T IMK על פני התא והופיעה אוכלוסייה שלילית כפולה. רוב תאי ה-INK המורחבים הם מסוג CD4 שליליים. אפיון גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת היוחם PLZF ו- ROR gamma T אפשר לזהות את הפנוטיפים NKT1, NKT2 ו- NKT17 על תאי T מועשרים של INK ביום אפס ו -14.

תאי ה-INK המועשרים מציגים פנוטיפ אפקטים דמוי T80, אשר נשמר לאחר 14 ימים של התרחבות כפי שאושר על ידי הפרשת גמא אינטרפרון ו- IL-4 לאחר גירוי PMA ו- ionomycin. במהלך שלבי הטיהור, זכרו לעבוד מהר עם פתרונות מקוררים מראש ולהיפטר מכל שאריות שומן שניתן לראות בזמן צנרת. ניתן לנצל תאי T מורחבים של INK לבדיקות במבחנה ולהעברות in vivo לעכברים, גם לאחר שינויים פונקציונליים באמצעות העברת גנים או עריכה.

הרחבה במבחנה של תאי T דיו מתגברת על המגבלה שניתנת על ידי המחסור, מה שהופך אותם לניצול במחקרים פרה-קליניים בתחומי המעקב החיסוני של הגידול, מחלות זיהומיות וחסינות אוטומטית.