Name: טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו שיטה לטיהור והתרחבות של תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים (iNKT) מטחול עכברים. הפרוטוקול מאפשר הרחבה פי 30 של התאים הנדירים לשימוש במחקרים in vitro ו-in vivo בתוך שבועיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפאולו דלבונה וג'וליה קאסורטי על התמיכה המדעית והקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למתקן הליבה של NIH Tetramer עבור טטרמר CD1d עכבר. המחקר מומן על ידי פונדזיון קריפלו גרנט 2018-0366 (ל- M.F.) והאגודה האיטלקית לחקר הסרטן (AIRC) 2019-22604 (ל- G.D.).

הנהלים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) (מס '1048) במכון המדעי סן רפאלה.
הערה: כל ההליכים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים. כל הריאגנטים המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.
1. עיבוד טחול
<ol><li>המתת חסד iVα14-Jα18 עכברים על ידי שאיפת CO2 על פי המדיניות המוסדית. הערה: עכברי iVα14-Jα18 חייבים להיות בני 8 שבועות ומעלה. כדי למנוע דחייה של התאים מהעברת in vivo של התאים, שקול כי תאים מבודדים מעכברים נקבות ניתן להעביר באופן מאמץ הן אצל נמענים זכריים והן נקבות, בעוד תאים מבודדים מעכברים זכרים ניתן להעביר רק אצל נמענים זכרים. לניסויים במבחנה, אין לקחת בחשבון הטיה מגדרית. ניתן לאגד עכברים נוספים על מנת להשיג תאים נוספים.</li>
	<li>לנתח את טחול העכבר ולרסק אותו דרך מסננת תא 70 ננומטר כדי לקבל השעיה של תא יחיד ב 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם 2% סרום בקר עוברי (FBS).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את supernatant על ידי היפוך ולעבד עם מאגר תמיסת אריתרוציטים. Resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של ACK סטרילי (אמוניום-כלוריד-אשלגן) חוצץ ליסינג, דגירה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ולחסום עם 5 מ"ל של PBS עם 2% FBS. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות. הערה: ACK זמין מסחרית; הוא מורכב מפתרון של 0.15 M NH4Cl, 10 מ"מ KHCO3, ו 0.1 מ"מ Na2EDTA (חומצה אתילנדימינטראצטית) מומס H2O דו-ליסטיל, pH 7.2-7.4. אם תוצרת בית, לעקר על ידי סינון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>הסר את סופר-טבעי על ידי היפוך. resuspend גלולה התא ב 3 מ"ל של PBS עם 2% FBS ולהסיר שאריות שומן על ידי pipetting. במידת הצורך, מאגר התאים המגיעים מעכברים שונים.</li>
	<li>ספר את התאים ולשמור 50 μL לניתוח FACS.</li>
</ol>2. העשרת תאי T
הערה: עבור שלבי העשרה, לעבוד מהר, לשמור על התאים קרים ולהשתמש פתרונות מקוררים מראש ב 4 °C (4 °F) לילה ולאחר מכן המשיך על קרח
<ol><li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>resuspend כל התאים בכמות המתאימה של PBS עם 2% FBS (500 μL עבור 107 תאים) וחוסם Fc (2.5 μL x 107 תאים); דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>יש לשטוף עם 1-2 מ"ל של מאגר הפרדת MACS (MB) לכל 107 תאים וצנטריפוגה בסך הכל ב-300 x גרם למשך 10 דקות. הערה: מאגר MACS זמין מסחרית. הוא מורכב PBS pH 7.2, 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA), ו 2 mM EDTA. אם תוצרת בית, לעקר על ידי סינון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>הסר את supernatant על ידי היפוך ולהכתים את התאים עם CD19-FITC ו H2(IAb)-FITC (להשתמש 5 μL x 107 תאים ב 100 μL של MB). מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך ב 4 -8 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף תאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 107 תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.</li>
	<li>פיפטה את supernatant לחלוטין resuspend גלולה התא ב 90 μL של MB לכל 107 תאים סה"כ. הוסף 10 μL של מיקרו-אבקסיסים נגד FITC לכל 107 תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך ב 4 -8 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 107 תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.</li>
	<li>פיפטה את supernatant לחלוטין resuspened עד 1.25 x 108 תא ב 500 μL של MB.</li>
	<li>מקם עמודת LD בשדה המגנטי של מפריד MACS כדי להמשיך לדלדול. כדי להימנע מסתימה, החל מסנן לפני הפרדה על עמודת LD ושטוף ב- 2 מ"ל של MB.</li>
	<li>כאשר מאגר העמודות ריק, החל את ההשעיה של התא על המסנן. אסוף את התאים הלא עם תווית שעוברים דרך העמודה.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של MB, רק כאשר מאגר העמודות ריק. לאסוף את השפכים הכוללים, אשר יועשר בתאי T, ולספור את התאים. שמור תמיד 50 μL לניתוח FACS.</li>
</ol>3. העשרת תאי iNKT
<ol><li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant על ידי היפוך.</li>
	<li>להכתים את התאים עם CD1d-tetramer-PE (עכבר PBS57-CD1d-טטרמר), על פי טיטציה נוגדן ב 50 μL של MB לכל 106 תאים. מערבבים היטב ודגרה במשך 30 דקות בחושך על קרח. הערה: ההליך יכול להתבצע גם עם tetramers mCD1d עם תווית APC וחרוזים נגד APC; התאמת הפלואורכרום המשמש את הכתמים הבאים בהתאם. בפרוטוקול הנוכחי השתמשנו בעכבר PBS-57-CD1d-tetramers שסופקו על ידי NIH. αgalactosylceramide (αGal-Cer) הוא אנטיגן טיפוסי המוכר על ידי תאי iNKT; PBS-57 הוא אנלוגי של αGal-Cer עם מסיסות משופרת9; מתקן NIH Tetramer מספק ליגנד PBS-57 המורכב מטטרמה CD1D. עם זאת, דימרים CD1d אחרים / tetramers / dextramers זמינים מסחרית והוא יכול להיות טעון עם אנטיגן שומנים כמו αGal-Cer. אנו מדמיינים את האפשרות להתאים את הפרוטוקול לשימושם.</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 107 תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.</li>
	<li>Pipette את supernatant לחלוטין resuspend גלולה התא ב 80 μL של MB לכל 107 תאים כוללים. הוסף 20 μL של מיקרואורגניזמים נגד PE לכל 107 תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך ב 4 -8 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף תאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 107 תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.</li>
	<li>פיפטה את supernatant לחלוטין resuspened עד 108 תאים ב 500 μL של MB. אחרת אם תאים עולים על 108, להתאים את עוצמת הקול בהתאם.</li>
	<li>על פי ספירת התאים, מקם עמודת LS (עד 108) או MS (עד 107) בשדה המגנטי של מפריד MACS. לשטוף את העמודה עם MB (3 מ"ל עבור LS, 500 μL עבור MS).</li>
	<li>החל את ההשעיה של התא על העמודה.</li>
	<li>לאסוף תאים ללא תווית שעוברים. לשטוף את העמודה 3 פעמים על-ידי הוספת הכמות המתאימה של MB (3 x 3 מ"ל עבור עמודת LS, 3 x 500 μL עבור עמודת MS) רק כאשר מאגר העמודות ריק. הקולחים הכוללים הוא השבר השלילי.</li>
	<li>הסר את העמודה מהשדה המגנטי והצב אותה על צינור אוסף חדש.</li>
	<li>Pipette MB בעמודה (5 מ"ל עבור עמודת LS או 1 מ"ל עבור עמודת MS); לדחוף את הבוכנה שסופקה לתוך העמודה לשטוף את השבר החיובי (מועשר בתאי iNKT).</li>
	<li>כדי להגדיל עוד יותר את התאוששות תאי iNKT, צנטריפוגה השבר השלילי ב 300 x g במשך 10 דקות ולחזור על שלבים 3.6-3.7 עם עמודה חדשה LS או MS. איחד את השברים החיוביים וקבע את ספירת התאים. שמור 50 μL של שברים חיוביים ושליליים לניתוח FACS.</li>
	<li>בדוק את שלבי הטיהור על-ידי ניתוח FACS. הדגימות כוללות: טחול ex-vivo, שבר מועשר בתא T, שבר חיובי iNKT ושבר שלילי iNKT. להכתים את התאים עם: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC ו- DAPI. הערה: ההתאוששות הצפויה מעכבר iVα14-Jα18 הוא 2x106 תאי iNKT .</li>
</ol>4. הפעלה והרחבה של תאים iNKT
<ol><li>הפעל תאי iNKT מטוהרים עם עכבר T activator נגד CD3/ CD28 חרוזים מגנטיים ביחס של 1:1.<ol>
<li>צנטריפוגה שבר חיובי תא iNKT ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>בינתיים להעביר את הנפח המתאים של חרוזים מגנטיים נגד CD3 /CD28 לצינור ולהוסיף נפח שווה של PBS, מערבולת במשך 5 שניות. מניחים את הצינור על מגנט במשך דקה אחת ומשליכים את supernatant.</li>
		<li>הסר את הצינור מן המגנט ו resuspend החרוזים המגנטיים שטף בנפח הנכון של RPMI מלא (RPMI 1640 בינוני, 10% FCS מומת בחום, 1 mM נתרן pyruvate, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 10 פניציללין U /ml וסטרפטומיצין, 50 μM β-Mercaptoethanol) כדי לקבל 5 x 105 תאי iNKT ב 1 מ"ל. השתמש במתלה זה כדי resuspend שבר חיובי iNKT צנטריפוגה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צלחת 1 מ"ל של השעיית התא (5 x 105 תאי iNKT) וחרוזים מגנטיים נגד CD3/CD28 בלוח 48 טוב עם 20 U /mL IL-2 ודגרה ב 37 °C (5 °F).</li>
	<li>לאחר 5 ימים, להוסיף 10 ננוגרם / מ"ל IL-7.</li>
	<li>לפצל את התאים 1:2 כאשר הם מגיעים 80-90% מפגש, תמיד להוסיף 20U / מ"ל IL-2 ו 10 ng / mL IL-7. בתנאים אלה, תאי iNKT ניתן להרחיב עד 15 ימים.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
<li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li>
<li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li>
<li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li>
<li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+CD40%2FFas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
<li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li>
<li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מראים פרוטוקול לשחזור וישים כדי להשיג מיליוני תאי iNKT מוכנים לשימוש. בשל המחסור של תאים אלה ב vivo, שיטה להרחיב אותם היה נחוץ מאוד. הפרוטוקול שאנו מציעים אינו דורש מכשור מסוים ולא מספר גבוה של עכברים. ניצלנו עכברים מהונדסים iVα14-Jα18 בכוונה כדי להפחית את מספר העכברים הדרושים להליך.
פרוטוקול מוצלח נוסף להרחבת תאי iNKT מ- iVα14-Jα18 עכברים מהונדסים זמין בספרות10. פרוטוקול זה כרוך בדור, 6 ימים לפני טיהור תאי iNKT, של תאים דנדריטיים טריים שמקורם במח העצם, ואז עמוס...

תאי T קטלניים טבעיים Invariant (תאי iNKT) הם לימפוציטים דמויי T מולדים המבטאים קולטן תאי T חצי אינבריאנט (TCR), שנוצר בעכברים על ידי שרשרת Vα14-Jα18 בשילוב עם קבוצה מוגבלת של שרשראות Vβ מגוונות1, אשר ספציפי עבור אנטיגנים שומנים המוצגים על ידי סוג MHC מולקולה הקשורה I CD1d2. תאי iNKT עוברים תוכנית בחירה אגוניסטית וכתוצאה מכך רכישת פנוטיפ מפעיל מופעל / מולד כבר התימוס, אשר מתרחשת דרך מספר שלביהתבגרות 3,4, הפקת CD4+ ו CD4- קבוצת משנה. באמצעות תוכנית זו, תאי iNKT לרכוש פנוטיפים מחולל T מובחנים (TH),כלומר TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) ו TH17 (iNKT17), לזיהוי על ידי הביטוי של גורמי שעתוק T-bet, GATA3, PLZF, ו RORγt, בהתאמה5. תאי iNKT מזהים מגוון של שומנים מיקרוביאליים אך הם גם מגיבים בעצמם נגד שומנים אנדוגניים כי הם upregulated בהקשר של מצבים פתולוגיים של מתח התא ונזק לרקמות, כגון סרטן ו autoimunity2. עם ההפעלה, תאי iNKT לווסת את הפונקציות של תאים אחרים מחוללי מערכת החיסון המולדת והסתגלותית באמצעות מגע ישיר וייצור ציטוקינים2.
החקירות של תאי iNKT כבר הקלו על ידי דגמי עכבר, כולל CD1d-לקוי או עכברים Jα18-לקוי, ועל ידי ייצור של tetramers CD1D טעון אנטיגן בתוספת הדור של נוגדנים חד שבטיים (mAbs) ספציפי עבור TCR חצי invariant האנושי. עם זאת, הדור של קו תא iNKT עכבר ראשי הוכיח קשה. כדי לאפיין טוב יותר את פונקציות האנטיטומור של תאי iNKT ולהשתמש בהם לטיפול תאי מאמץ, הקמנו פרוטוקול לטיהור והרחבת תאי iNKT טחול של iVα14-Jα18 עכברים מהונדסים (iVα14Tg)6, שבו תאי iNKT שכיחים פי 30 מאשר בעכברים מסוג בר.
תאי iNKT מורחבים ניתנים לניצול לבדיקות במבחנה, וב-vivo עם המעבר חזרה לעכברים. בהגדרה זו, למשל, הראינו את ההשפעות החזקות שלהם נגד הגידול7. יתר על כן, אין ויטרו מורחב iNKT תאים נוחים לשינוי פונקציונלי באמצעות העברתגניםאו עריכה לפני הזרקתם ב vivo 8 , המאפשר ניתוח פונקציונלי תובנה של מסלולים מולקולריים, כמו גם לסלול את הדרך לטיפולים תאים מתקדמים.

<table><tbody><tr><td>תמיסת אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK)</td><td>בבית</td><td></td><td>0.15M NH4Cl, 10 מ"מ KHCO3, 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.2-7.4</td></tr><tr><td>אנטי-FITC מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים נגד PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>שיבוט 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetramer -PE</td><td>NIH עכבר מתקן ליבת טטרמר</td><td>PBS57-Cd1d-tetramers</td>CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 שיבוט RM4-5 חוסם Fc BD Bioscience 553142 סרום בקר עוברי (FBS)Euroclone ECS0186L מושבת בחום ומסונן .22 לפני השימוש FOXP3 מאגר צביעת גורם שעתוק <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td></td><td>שיבוט 114406 AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD עמודות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>עמודות</td><td>LS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מאגר MACS (MB)</td><td>בבית</td><td></td><td>0.5% אלבומין סרום בקר (BSA; Sigma-Aldrich) ו-2 מ"מ EDTA</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין (Pen-Strep)</td> <td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מסנני מלח (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>מסנני הפרדה מראש (30 ומיקרו; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Recombinat Mouse IL-7</td><td>R& D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 עם גלוטמקס</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>שיבוט H57-597</td></tr><tr><td>&alpha; CD3CD28 עכבר T מפעיל Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור והתרחבות של עכבר invariant טבעי רוצח תאי t עבור במבחנה ו in vivo מחקרים

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

תאי T (iNKT) Invariant Natural Killer הם לימפוציטים דמויי T מולדים המבטאים קולטן תאי T חצי-אינבראנטים שמורים (TCR) הספציפי לאנטיגנים שומנים עצמיים או מיקרוביאליים המוצגים על ידי המולקולה הלא פולימורפית מסוג MHC I הקשורה למולקולה CD1d. מחקרים פרה-קליניים וקליניים תומכים בתפקיד לתאי iNKT בסרטן, אוטואימוניות ומחלות זיהומיות. תאי iNKT נשמרים מאוד בכל המינים והחקירה שלהם התאפשרה על ידי מודלים של עכברים, כולל עכברים לקויי CD1D או iNKT לקויים, ואת האפשרות לזהות אותם באופן חד משמעי בעכברים וגברים עם tetramers CD1d או mAbs ספציפי עבור TCR חצי invariant. עם זאת, תאי iNKT הם נדירים ויש להרחיב אותם כדי להגיע למספרים הניתנים לניהול עבור כל מחקר. מכיוון שהדור של קו תאי iNKT הראשי של העכבר במבחנה הוכח כקשה, הקמנו פרוטוקול חזק לטיהור והרחבת תאי iNKT טחול מהעכברים מהונדסים iVα14-Jα18 (iVα14Tg), שבו תאי iNKT שכיחים פי 30. אנו מראים כאן כי תאי iNKT iVα14Tg הטחול העיקריים יכולים להיות מועשרים באמצעות תהליך הפרדה אימונומגנטי, המניב כ 95-98% תאי iNKT טהורים. תאי iNKT המטוהרים מגורים על ידי חרוזי אנטי CD3/CD28 בתוספת IL-2 ו- IL-7, וכתוצאה מכך התרחבות פי 30 ביום +14 של התרבות עם טוהר של 85-99%. תאי iNKT המורחבים ניתנים למניפולציה גנטית בקלות, ומספקים כלי רב ערך לנתח מנגנוני הפעלה ותפקוד במבחנה, וחשוב מכך, גם עם העברה מאמצת ב- vivo.

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר להעשיר תאי iNKT מהטחול של עכברים מהונדסים iVa14-Ja18 באמצעות תהליך הפרדה אימונומגנטי המסוכם באיור 1A. תאי T הטחול הכולל נבחרים לראשונה באופן שלילי על ידי דלדול תאי B ומונוציטים, ואחריו מיון אימונומגנטי חיובי של תאי iNKT עם Tetramers CD1d טעון של אנטיגן אנטיגן PBS-57, המאפשרים להכתים במיוחד רק תאי iNKT. פרוטוקול זה מניב כ 2 x 106 של 95-98% תאי iNKT טהורים מהטחול של עכבר iVa14-Ja18 Tg יחיד. לא ניתן לזהות או מעט מאוד תאי iNKT בשבר השלילי<strong class...

אנו מתארים פרוטוקול מהיר וחזק להעשרת תאי T (iNKT) של הרוצח הטבעי invariant מטחול העכבר ולהרחיב אותם במבחנה למספרים מתאימים למחקרי מבחנה ומחקרי ויוו.

טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

פרוטוקול זה מאפשר טיהור של תאי T דיו, שהם נדירים מאוד, ומאפשר הרחבה של פי 30 במספרם. הטיהור יכול להתבצע ביום אחד ולייצר מספר רב של תאי דיו T מוכנים לשימוש עבור in vivo ומחקרים במבחנה בעוד שבועיים. תוכיח את ההליך תהיה גלוריה דלפנטי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה.לאחר ניתוח טחול העכבר, לרסק אותו דרך מסננת תא 70 ננומטר כדי לקבל השעיה תא יחיד ב 10 מיליליטר של PBS עם 2%FBS. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם מיליליטר אחד של אמוניום כלוריד חוצץ אשלגן ליצין סטרילי.לדגור על התאים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לחסום עם חמישה מיליליטר של PBS עם 2% FBS. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר הסרת supernatant, resuspend גלולה התא בשלושה מיליליטר של PBS עם 2%FBS ולהסיר שאריות שומן על ידי pipetting.עבור צעדי העשרה, לשמור על התאים קרים ולהשתמש פתרונות מקוררים מראש בארבע מעלות צלזיוס ולאחר מכן המשיך על קרח. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. resuspend כל התאים בכמות המתאימה של PBS עם 2%FPS וחוסם Fc ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לשטוף עם אחד עד שני מיליליטר של מאגר הפרדת MACS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. לאחר הסרת supernatant, להכתים את התאים עם CD19-FITC ו H2-IAb-FITC ודגרה במשך 15 דקות בחושך בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. לשטוף תאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.הסר supernatant ו resuspend גלולה התא ב 90 microliters של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. הוסף 10 מיקרוליטרים של מיקרואורגניזמים נגד FITC לכל 10 מיליון תאים. מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס.לשטוף את התאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend עד 125 מיליון תאים ב 500 microliters של מאגר MACS. מקם עמודת LD בשדה המגנטי של מפריד MACS.כדי למנוע סתימה, החל מסנן לפני הפרדה על עמודת LD ושטוף אותו בשני מיליליטר של מאגר MACS. החל את ההשעיה של התא על המסנן ואסוף את התאים הלא עם תווית העוברים דרך העמודה. לשטוף את מאגר העמודים הריק שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר MACS.לאסוף את הקולח המועשר של תאי T ולספור את התאים, שמירה על 50 microliters לניתוח FACS. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, להסיר את supernatant ולהכתים את התאים עם CD1d tetramer-PE. מערבבים היטב ודגרה במשך 30 דקות בחושך על קרח.לשטוף את התאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות, להסיר את supernatant ו resuspend את גלולה התא ב 80 microliters של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. הוסף 20 מיקרוליטרים של מיקרואורגניזמים נגד PE לכל 10 מיליון תאים.מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. לשטוף תאים על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend עד 100 מיליון תאים ב 500 microliters של מאגר MACS.בהתאם לספירת התאים, מקם את העמודה LS או MS בשדה המגנטי של מפריד MACS ושטוף את העמודה במאגר MACS. החל את ההשעיה של התא על העמודה, לאסוף תאים ללא תווית העוברים ולשטוף את העמודה שלוש פעמים כמתואר קודם לכן. זהו השבר השלילי.הסר את העמודה מהשדה המגנטי והצב אותה על צינור אוסף חדש. Pipette MACS חוצצים על העמודה ודוחפים את הבוכנה שסופקה לעמודה כדי לשטוף את השבר החיובי המועשר בתאי ה- INK T. כדי להגדיל עוד יותר את שחזור תאי ה- INK T, צנטריפוגה של השבר השלילי ב- 300 פעמים G במשך 10 דקות וחזר על השלבים הקודמים עם עמודת LS או MS חדשה.משוך את השברים החיוביים וקבע את ספירת התאים. שמור 50 מיקרוליטרים של שברים חיוביים ושליליים לניתוח FACS כדי לבדוק את הטוהר. כדי להפעיל תאי INK T ביחס של אחד לאחד, העבר את הנפח המתאים של חרוזים מגנטיים נגד CD3 ו- CD28 לצינור ובנפח שווה של PBS, ולאחר מכן מערבולת למשך חמש שניות.מניחים את הצינור על מגנט למשך דקה אחת ומשליכים את הסופר-נט. הסר את הצינור מן המגנט ו resuspend החרוזים המגנטיים שטף בנפח הנכון של RPMI. צנטריפוגה מטוהרת דיו T-תאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות ולערבב אותם עם עכבר T-activator נגד CD3 או CD28 חרוזים מגנטיים.צלחת מיליליטר אחד של השעיית התא, נגד CD23 ו- CD28 חרוזים מגנטיים בצלחת 48-well עם 20 יחידות למיליליטר IL-2, ולאחר מכן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמישה ימים, להוסיף 10 ננוגרם למיליליטר IL-7. לפצל את התאים לשניים כאשר הם מגיעים 80 עד 90% מפגש, תמיד הוספת 20 יחידות למיליליטר IL-2 ו 10 ננוגרם למיליליטר IL-7.בתנאים אלה, ניתן להרחיב את תאי ה- INK T למשך עד 15 יום. באמצעות פרוטוקול זה, תאי דיו T מועשרים מטחול העכברים מהונדסים באמצעות תהליך הפרדה אימונומי. לאחר ההעשרה, ניתן להרחיב את התאים עם חרוזי אנטי CD3 ו- CD28, וכתוצאה מכך התרחבות של פי 30 בממוצע ביום 14 של התרבות.ההפעלה החזקה עם חרוזי אנטי-CD3 ואנטי-תקליטור גרמה לירידה בביטוי TCR של תאי T IMK על פני התא והופיעה אוכלוסייה שלילית כפולה. רוב תאי ה-INK המורחבים הם מסוג CD4 שליליים. אפיון גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת היוחם PLZF ו- ROR gamma T אפשר לזהות את הפנוטיפים NKT1, NKT2 ו- NKT17 על תאי T מועשרים של INK ביום אפס ו -14.תאי ה-INK המועשרים מציגים פנוטיפ אפקטים דמוי T80, אשר נשמר לאחר 14 ימים של התרחבות כפי שאושר על ידי הפרשת גמא אינטרפרון ו- IL-4 לאחר גירוי PMA ו- ionomycin. במהלך שלבי הטיהור, זכרו לעבוד מהר עם פתרונות מקוררים מראש ולהיפטר מכל שאריות שומן שניתן לראות בזמן צנרת. ניתן לנצל תאי T מורחבים של INK לבדיקות במבחנה ולהעברות in vivo לעכברים, גם לאחר שינויים פונקציונליים באמצעות העברת גנים או עריכה.הרחבה במבחנה של תאי T דיו מתגברת על המגבלה שניתנת על ידי המחסור, מה שהופך אותם לניצול במחקרים פרה-קליניים בתחומי המעקב החיסוני של הגידול, מחלות זיהומיות וחסינות אוטומטית.

purification-expansion-mouse-invariant-natural-killer-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

סרטון זה מדגים בידוד של לימפוציטים, כולל תאי הרג טבעיים או תאי NK, מרקמת כבד אנושית לצורך התרחבות סלקטיבית. עיכול אנזימטי ומכני, ואחריו הפרדת שיפוע צפיפות, מקדם בידוד לימפוציטים, כולל תאי NK. הלימפוציטים שנאספו יכולים לשמש עוד יותר להרחבה סלקטיבית של תאי NK.

בידוד תאי הרג טבעי מרקמת הכבד להרחבה סלקטיבית

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים, הידועים גם בשם תאי iNKT. ההליך מתחיל בהזרקת גליקוליפיד סינתטי לעכבר כדי לעורר את ההפעלה וההתרבות של תאי iNKT בטחול. לאחר מכן, מתלים חד-תאיים מוכנים מהטחול ומודגרים עם קומפלקסים מזהי תאי iNKT המסומנים בפלואורופורים, ולאחר מכן הפרדה מבוססת חרוזים מגנטיים, כדי לבודד את תאי ה-iNKT.

בידוד תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים ממודל עכבר

תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה.  ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם שניתן להשתמש בו כדי ליצור מספר רב של תאי T רוצחים טבעיים קבועים של עכברים מטחול עכבר. הפרוטוקול מתאר גישה שבאמצעותה ניתן להעשיר תאי iNKT טחול, לבודד ולהרחיב אותם במבחנה באמצעות מספר מוגבל של בעלי חיים וריאגנטים.

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

אנו מתארים כאן הזרימה cyvivo try מבוסס בתוך שיטת ההרג המאפשרת לבדוק את החיסונית של האימונוטוקסיט T לימפוציטים (CTL) התגובות של הגידול מודל אנטיגן. אנו מספקים דוגמאות לאופן השימוש בבחינה אלגנטית זו למחקרים מכניסטיים ולבדיקת יעילות בסמים.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

זוהי שיטה לבודד תאי לימפה הרחם מעכברים בהריון ולא בהריון. שיטה זו יכולה לשמש עבור יישומים במורד הזרם מרובים כגון פנוטיפינג FACS, מיון תאים, בדיקות פונקציונליות, RNA-seq, ופרוטומיקה. הפרוטוקול כאן מדגים כיצד פנוטיפ קבוצה 1 תאי לימפה מולדים הרחם על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

למדו שיטה לטיהור והתרחבות של תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים (iNKT) מטחול עכברים. הפרוטוקול מאפשר הרחבה פי 30 של התאים הנדירים לשימוש במחקרים in vitro ו-in vivo בתוך שבועיים.

טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים

גלה סרטונים נוספים