Name: אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: למד פרוטוקול ניתוחי לחשיפת גזע המוח בעכברים בוגרים מצד הגב, המאפשר הדמיית סידן in vivo באמצעות עדשות GRIN. השיטה מאפשרת מעקב אחר פעילות נוירונים בזית תחתון ללא פגיעה במבנים חיוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאנדרו סקוט ממרכז המדיה של OIST על עזרתו בהקלטת וידאו ועריכה. כמו כן, אנו מודים להוגו הודמייקר על עזרתו בפיתוח הניתוח לחשיפת גזע המוח וד"ר קווין דורגנס על עזרתו בשרטוט דיאגרמות לדמויות. בנוסף, תודה רבה לסלבטורה לאקאבה על קריינות הקריינות שלו, כמו גם לכל חברי nRIM וחיות המחמד על התמיכה המתמשכת ברווחה בזמנים הקשים של COVID-19.

<ol><li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+signals+in+vivo%3A+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+brain+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice.</a> Nature Methods. , (2019).</li>
<li>Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).</li>
<li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+In+vivo+Calcium+Imaging+with+a+Head-Mount+Miniaturized+Microscope+in+the+Amygdala+of+Freely+Behaving+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse.</a> Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).</li>
<li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+the+light+that+we+can+see%3A+a+new+era+in+miniaturized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li>
<li>Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li>
<li>Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li>
<li>Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+L+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , e61023(2020).</li>
<li>Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+alone+and+combined+with+diazepam+or+xylazine+in+laboratory+animals%3A+A+10+year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience.</a> Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+andn+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li>
<li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).</li>
<li>Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+nucleus+MdV+mediates+skilled+forelimb+motor+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine%2FXylazine%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ketamine/Xylazine.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIN1PIPE%3A+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li>
<li>Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li>
<li>Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/zhoupc/CNMF_E">https://github.com/zhoupc/CNMF_E</a> (2020).</li>
<li>De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+olive%3A+All+ins+and+outs%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+the+Cerebellum+and+Cerebellar+Disorders%22%5BJournal%5D)">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li>
<li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כמו ההליך הכירורגי כרוך פעולות שבוצעו באזור הגרון עם מבנים קריטיים חיוניים רבים (עורקים, עצבים), זה חיוני כי הוא מנוהל על ידי חוקר עם מיומנויות כירורגיות ברמה גבוהה. באופן הבא, אנו מדגישים ומעירים על מספר נקודות מפתח של ההליך; עם זאת, יש להזכיר כי שום כמות של עצה בכתב לא יכולה להחליף את החוויה, המיומנות והאינטואיציה של החוקר.
הצעד הקריטי ביותר בניתוח הוא קנה הנשימה. זה כרוך בחיתוך קנה הנשימה, החלפת isoflurane מן חרוט האף לצינור אינטובציה, הבטחת קנה הנשימה לעור החזה ותיקון קנה הנשימה ואת צינור אינטובציה יחד. כל הפעולות הללו חייבות להסתיים בצורה חלקה ומהירה כדי למנוע תאונות, כגון הרדמה לקויה, זרימת נוזלים לקנה הנשימה או החלקה של צינור אינטובציה. יש לזכור את הפרוטוקול לפני חיתוך קנה הנשימה.
דימום הוא אחד הגורמים העיקריים למוות של בעלי חיים בניתוח זה. מאז אזור הצוואר הוא צפוף עם כלי הדם, לחתוך צריך להתבצע רק כאשר קו הראייה ברור, כדי למנוע חיתוך ורידים ועורקים בלתי נראים. לכן, יש להסיר שרירים ורקמות חיבור המטשטשים את הראייה, ויש לנקות דם מנחמים שבורים לפני שמתקדמים.
בעלי חיים יכולים להישמר בחיים במשך זמן רב (יותר מ 8 שעות) מתחילת הניתוח. עם זאת, חשוב לסיים את ההליך הכירורגי במהירות ולכן יש יותר זמן לבחון נוירונים גזע המוח כאשר מצבם הפיזיולוגי של בעלי החיים הוא טוב. חוקר מיומן יכול לסיים את כל ההליך ב 70 דקות.
בעוד השיטה מספקת תצוגה נקייה של משטחי המוח הגחוני, למרבה הצער זה בלתי אפשרי לעשות זאת מבלי לבצע tracheotomy, כמו גם הסרת כמות משמעותית של רקמה באזור הגרון. לכן, לא ניתן לאפשר לחיה להתעורר מהרדמה. יתר על כן, למרות שניתן לשמור על החיה בחיים במשך שעות רבות עם התאמה זהירה של אספקת הרדמה, שמירה על טמפרטורת הגוף לחות, זה בלתי נמנע כי ניסויים ממושכים יוביל בסופו של דבר להיחלשות מצב החיה. נותר למומחיותו של החוקר לשקול את משך הזמן המקסימלי של הקלטות יציבות.
מגבלה אפשרית נוספת של השיטה כמתואר כאן היא כי כמו עדשת GRIN אינו מוכנס לתוך parenchyma המוח, רק נוירונים שטחיים יחסית (~ 150-200 מיקרומטר) ניתן לבדוק. בעוד השתלה כירורגית של עדשת GRIN אפשרית מבחינה טכנית, שיטת ניתוח חריפה אינה מאפשרת מספיק זמן לנוירונים להתאושש מלחץ חמצוני ונוכחות של דם לאחר ההשתלה סביר להניח לפגוע באיכות התמונה מעבר מקובל.
למרות החששות לעיל, אנו מאמינים שזו הפעם הראשונה שיטה להדמיה in vivo של נוירונים IO מוצג. זה מאפשר בדיקה של פעילות spatiotemporal בתאי העצב IO בהקשר vivo בנוכחות כניסות afferent שלם ממערכות חושיות, כמו גם את האותות מן הגרעינים המוח הקטן ואת צומת mesodiencephalic22, הישג שלא היה אפשרי עד כה. בשיטה זו, הפונקציה של IO עכשיו ניתן לחקור לעומק יותר עם שילוב של גירוי חושי ואופטוגנטי. יש לציין כי עם האבולוציה של הדמיית מתח (כגון השיטה האחרונה שלנו להדמיית מתח ב- IO 23), אנו מקווים שהשיטה הכירורגית המוצגת תעורר חוקרים רבים לקחת על האתגר של חקירת האופן שבו ה- IO תורם ליצירת קוצים מורכבים במוח הקטן.

המטרה העיקרית של מדעי המוח במערכות היא להבין כיצד דפוסי פעילות מרחבית של רשתות עצביות תורמים ליצירת התנהגות בעלי חיים. לפיכך, מתודולוגיית הדמיה פלואורסצנטית העושה שימוש בבדיקות רגישות לסידן הפכה בעשור האחרון לכלי מרכזי לבחינת פעילות רשת עצבית בבעליחיים 1,2 , שכן היא מאפשרת הדמיה שלדינמיקהכזו על פני קשקשים מרחביים החל מתאים בודדים ועד מעגלים מזוקלים. בשנים האחרונות, הגישה הנפוצה שבה מעגלים עצביים במבני מוח שטחיים (כגון קליפות מוח או מוחיות) מצוידים דרךחלון גולגולתי שקוף 3 הושלם עם השימוש של אינדקס שביר שבירה (GRIN) עדשות4 המאפשר בדיקה של דינמיקת הרשת במבני מוח עמוקים. עדשות GRIN הזמינות כיום מאפשרות להגיע למבנים בעומק של כמה מילימטרים, כגון האמיגדלה של העכבר, ההיפוקמפוס והגרעינים הבסיסיים5. עם זאת, אזורים רבים של עניין כגון גרעינים שונים במדולה הגחוני לשכב עמוק יותר באופן משמעותי, הצבת אותם בקצה של עדשת GRIN להגיע.
כאן, אנו מתארים כיצד להתגבר על קושי זה על ידי ניצול הנגישות הקלה יחסית של medulla דרך ההיבט הגחוני של המוח. באמצעות עכברים בוגרים שבהם הזית הנחות (IO), גרעין במדולה הגחונית, נחתך ויראלית עם חיישן סידן GCaMP6s, אנו מתארים את הצעדים הכירורגיים (שונה מהשיטה המתוארת במקור Khosrovani et al. 20076) כדי למקם עדשת GRIN על פני השטח הגחוני של המוח של עכבר מורדם. באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, אנו מדגימים את ההיתכנות של רישום פעילות עצבית באזורי מוח גחוני כל כך. בעוד ההליך הוא בהכרח ניתוח שאינו הישרדות ולא ניתן לבצע ניסויים בבעלי חיים ערים, השיטה מאפשרת בדיקה של דינמיקת רשת שלמה בהקשר של גירוי מסלול חושי או אפרנטי אחר, ומספקת יתרונות ברורים על פני גישות אקס ויוו כגון שימוש בתכשירי פרוסה חריפים.

<table><tbody><tr><td>AAV. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, ארה"ב</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>תפר נספג עם מחט חצי עיגול 6 מ"מ</td><td>Natume, יפן</td><td>L6-60N2</td><td>מחט וו עם חוט</td></tr><tr><td>משולשי ספיגה</td><td>FST, גרמניה</td><td>18105-03</td><td>ספוגים כירורגיים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופים סטריאו</td><td>לייקה, גרמניה</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט קצה מעוקל Castroviejo עם מנעול</td><td>FST, גרמניה</td><td>12061-01</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>צמר גפן</td><td>Sanyo, יפן</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים לקשירת תפרים</td><td>FST, גרמניה</td><td>11063-07</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>מלקחיים לקשירת תפרים עדינים</td><td>FST, גרמניה</td><td>11063-07</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 מלקחיים</td><td>FST, גרמניה</td><td>11251-35</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>מספריים לקשתית עדינה</td><td>FST, גרמניה</td><td>14060-09</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>פרידמן-פירסון rongeur קצה מעוקל</td><td>FST, גרמניה</td><td>16221-14</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>ספוג ג'לטין נספג ג'ל</td><td>פייזר, ארה"ב</td><td>0315-08</td><td>ספוג ג'לטין המוסטטי</td></tr><tr><td>זכוכית-ננו-הזרקה נימית</td><td>נוירוסטאר , גרמניה</td><td>n/a</td><td>להזרקת וקטור וירוס</td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe עם קצה משונן</td><td>FST, גרמניה</td><td>11052-10</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>מוט השתלה</td><td>Inscopix, ארה"ב</td><td>n/a</td><td>הוא חלק ממערכת nVoke2. הוא נועד להרכיב עליו microscpe מיניאטורי ועדשת GRIN nVoke2</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis, UK</td><td>n/a</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>KETALAR להזרקה תוך שרירית</td><td>Daiichi Sankyo, יפן</td><td>n/a</td><td>קטמין</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>קימברלי-קלארק, ארה"ב</td><td></td><td>ניקוי רקמות</td></tr> מכשיר <tr><td>מושך מיקרופיפטה מבוסס לייזר</td><td>, ארה"ב</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Beveler</td><td>Sutter Instrument, ארה"ב</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוטקסי ממונע המבוסס על Kopf, דגם 900</td><td>Neurostar, גרמניה</td><td>n/a</td> עכבר <td>מסגרת סטריאוטקסית</td></tr><tr><td>OxPlus עם חיישן טמפרטורת פי הטבעת ומד דופק מהדק ירך</td><td>Starr Life Sciences, PA, ארה"ב</td><td>MouseOxPlus</td><td>מודד דופק של בעלי חיים, ריווי חמצן עורקי (SpO2), קצב נשימה וטמפרטורה</td></tr><tr><td>מערכת מיקרו מצלמות הדמיית סידן nVoke2 משולבת</td><td>Inscopix, ארה"ב</td><td>1000-003026</td><td>מיקרוסקופ מיניאטורי</td></tr><tr><td>Ohaus מאזניים קומפקטיים</td><td>Ohaus, ארה"ב</td><td>CS 200</td><td>משקל המשמש למשקל בעלי חיים</td></tr><tr><td>Otsuka Normal Saline</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory, יפן</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בקר טמפרטורה פיזיולוגית-ביולוגית</td><td>SuperTech Instruments, הונגריה</td><td>TMP-5b</td><td>כרית תרמית לעכבר</td></tr><tr><td>ProView Lens Probe קוטר 1.0 מ"מ, אורך 9.0 מ"מ</td><td>Inscopix, ארה"ב</td><td>1050-002214</td><td>עדשת מקדם שבירה שיפוע (GRIN)</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP נימי זכוכית</td><td>Sutter Instrument, ארה"ב</td><td>112017</td><td>מותאם אישית&nbsp; נימי זכוכית קוורץ</td></tr><tr><td>בטיחות IV קטטר 20G</td><td>B. בראון, גרמניה</td><td>4251652-03</td><td>קטטר 20 מד המשמש להכנת צינור</td></tr> <tr>אינטובציה<td>נייר חול</td><td>ESCO, יפן</td><td>EA366MC</td><td>משמש לליטוש קצה מחט 25G להכנת מחט מעוקלת וקהה</td></tr><tr><td>להב אזמל</td><td>Muromachi Kikai, יפן</td><td>10010-00</td><td>משמש לחיתוך קצה פיפטת זכוכית קוורץ</td></tr><tr><td>מערכת הרדמה בשאיפה בזרימה נמוכה SomnoSuite קנט</td><td>סיינטיפיק, ארה"ב</td><td>SOMNO</td><td>מספק שליטה מדויקת בזרימת איזופלורן</td></tr><tr><td>מקדחה כירורגית XT Plus</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>למזרק הזרקת וקטור וירוסים</td></tr><tr><td>1 מ"ל</td><td>Terumo, יפן</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק 25G</td><td>למעלה, יפן</td><td>00819</td><td>משמש לייצור מחט מחט קהה וכפוף</td></tr><tr><td>מחט 26G</td><td>Terumo, יפן</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Professional Trimmer</td><td>Thrive, יפן</td><td>n/a</td><td>מכונת גילוח</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; מספריים אביביים bingen</td><td>FST, גרמניה</td><td>15004-08</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Hayashi Pure Chemical, יפן</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet עור רגיש</td><td>Veet, קנדה</td><td>n/a</td><td>קרם להסרת שיער</td></tr><tr><td>ג'לי Xylocaine 2% 30 מ"ל</td><td>אספן יפן,&nbsp; יפן</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

זית נחות (IO), גרעין במדולה הגחונית, הוא המקור היחיד לסיבים מטפסים היוצרים את אחד משני מסלולי הקלט הנכנסים למוטל המוח הקטן. IO הוצע זמן רב להיות חיוני עבור שליטה מוטורית ופעילותה נחשבת כיום במרכז השערות רבות של תפקודים מוטוריים וקוגניטיביים של המוח הקטן. בעוד הפיזיולוגיה והתפקוד שלה נחקרו היטב יחסית ברמה חד-תאית במבחנה, כיום אין דיווחים על ארגון פעילות רשת IO בבעלי חיים חיים. זאת בעיקר בשל המיקום האנטומי המאתגר ביותר של ה- IO, מה שמקשה על הכפוף לשיטות הדמיה פלואורסצנטיות קונבנציונליות, שבהן יש ליצור נתיב אופטי דרך המוח כולו הממוקם באופן דורסי לאזור העניין.
כאן אנו מתארים שיטה חלופית להשגת נתוני דימות סידן ברמה העדכנית ביותר מרשת ה- IO. השיטה מנצלת את המיקום הגחוני הקיצוני של ה- IO וכוללת הליך כירורגי להחדרת עדשת אינדקס שבירה הדרגתית (GRIN) דרך הקרביים בצוואר כדי לבוא במגע עם פני השטח הגחוניים של חיישן הסידן GCaMP6s-מבטא IO בעכברים מורדמים. הקלטת דימות סידן מייצגת מוצגת כדי להדגים את ההיתכנות להקליט פעילות נוירון IO לאחר הניתוח. אמנם מדובר בניתוח שאינו הישרדותי ויש לבצע את ההקלטות בהרדמה, אך הוא מונע פגיעה בגרעיני גזע המוח הקריטיים לחיים ומאפשר לבצע מגוון רחב של ניסויים החוקרים דפוסי פעילות מרחבית ושילוב קלט בקלט. הליך זה עם שינויים יכול לשמש להקלטות באזורים אחרים, סמוכים של גזע המוח הגחוני.

כאן אנו מציגים הקלטה מייצגת שהושגה עם השיטה כמתואר. איור 6a מציג את המיקום של תאי IO בעלי תווית בהירה שהמחישו במהלך הניסוי. הפסים האלכסוניים הכהים הם כלי דם. שים לב לבהירות המשתנה של תאים בודדים, הנובעת מיעילות transfection משתנה. בחלונית איור 6b אנו מציגים את עקבות עוצמת הפלואורסצנטיות המנורמלת הממוצעת (deltaF/F) המתקבלות מהסומאטה המצוינת בצבעים ובמספרים בחלונית a. הסטות כלפי מעלה מייצגות עליות חולפות בסידן תאי. שים לב כיצד רמה שונה של ביטוי GCaMP6s (המשתקף בבהירות התא בחלונית a) מובילה ליחסי אות לרעש (SNR) משתנים.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> איור 6: הקלטה לדוגמה של פעילות של תאי עצב מסוג IO בעכבר מורדם. (א) מסגרת דוגמה מייצגת מהקלטה לאחר סינון מרחבי. נקודות אור הן סומאטה עצבית IO, כמה מהם צוינו כאזורי אינטרסים (ROIs, מספרים צבעוניים). פסים כהים הם כלי דם. (ב)עקבות דלתאF/F לדוגמה שהתקבלו מה- ROIs שצוינו בחלונית a. הסטות כלפי מעלה משקפות עליות באות הסידן. סרגל קנה מידה ב- a = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

זית נחות הוא החלק הגחוני ביותר של המדולה, ולכן קשה מאוד להגיע לחיה חיה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של העכבר הבוגר מהצד הגחוני, ולהשתמש בעדשות GRIN כדי לתעד פעילות עצבית בנוירוני הזית הנחותים המבטאים חיישני סידן. שיטה זו מונעת פגיעה בגזע המוח הקריטי לחיים, ומאפשרת חקירות של דפוסי פעילות מרחבית-זמנית ושילוב קלט בזית הנחות.מאז הניתוח מבוצע באזור הגרון המורכב עם מבנים חיוניים רבים, זה חיוני כי הוא מנוהל על ידי חוקר עם מיומנויות כירורגיות ברמה גבוהה. הכן צינור אינטובציה על ידי חיתוך 5 עד 6 מילימטר ארוך ו 0.8 מילימטר רחב חריץ מקצה קטטר 20 מד. מכינים מחט קהה ומעוגלת על ידי חיתוך הקצה, חול משטח השבר, לכופף אותו עם הצבת.זה ישמש כדי לתמוך קנה הנשימה במהלך קנה הנשימה. לדלל 15 מיליגרם לכל קטמין מיליליטר עם מלוחים ל 15%להרכיב כלי ניתוח מתכלים. הגדר כרית חימום ל 38 מעלות צלזיוס.סובב את האף ב-180 מעלות אופקית במסגרת סטראוטקסית. לשקול את העכבר שהזית הנחות שלו היה חתוך בעבר על ידי GCaMP6s נושא וירוס, ולחשב את כמות קטמין מדולל להזרקה. תיבת אינדוקציה למילוי מראש ב- 5%isoflurane והמרדמה של העכבר.טען את העכבר במסגרת הסטראוטקסית, בצד הגחוני כלפי מעלה. לגלח את גרונו של העכבר ואת אזור הירך. הסר את השיער שיורית עם קרם להסרת שיער.למרוח ג'לי קסילוקאין על עור הגרון. נטר את טמפרטורת העכבר באמצעות חיישן תרמי רקטלי. להזריק מיליליטר אחד מראש מחומם מלוחים תוך-פרטנית.להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטה חזקה על בהונות hindlimb. אין לעורר תגובה הניתנת לגילוי. בצע חתך אנכי בעור הגרון לאורך קו האמצע.יש להפריד את עור הצוואר מפני הקרביים שמתחתו באמצעות שיטת ניתוח קהה ולחתוך את העור. בלוטות רוק חינם מרקמת חיבור, ולהפוך אותם לרוחב כדי לחשוף את קנה הנשימה מכוסה שרירים sternothyroid. תוך-פרטית להזריק את המנה הראשונה של קטמין מדולל בחמישה מיליליטר לקילוגרם של משקל בעלי חיים.בזהירות לפצל שריר עצם החזה לאורך קו האמצע עם קצה של מלקחיים בסדר לחשוף קנה הנשימה. נתק קנה הנשימה מכלי הדם והוושט עם מלקחיים בשיטת ניתוח בוטה. להזריק מנה שנייה של קטמין מדולל ב 2.5 מיליליטר לקילוגרם של משקל בעלי חיים.תכניסו מחט קהה מתחת לקנה הנשימה. הרם קנה הנשימה עם המחט הקהה. הפוך את חוט התפירה ללכת סביב טבעת קנה הנשימה השלישית, caudal בלוטת התריס, עם מחט חצי עיגול.תעשה ארבעה קשרים על הטבעת הזאת. לנקב את עור החזה עם אותה מחט חצי עיגול ולהוביל את החוט דרך העור. בעדינות להרים את קנה הנשימה עם החוט, לחתוך את קנה הנשימה caudal לבלוטת התריס.משוך את קנה הנשימה לכיוון עור החזה. הרם את פתיחת קנה הנשימה על ידי הוספת חתיכה קטנה של ספוג כירורגי מתחתיה. הסר כל נוזל שנותר בתוך קצה הפתיחה של קנה הנשימה עם רצועה דקה של רקמת ניקוי.העבר את זרימת ה- isoflurane מאף סטראוטקסי לצינור הצנרור. הכנס את צינור הצנרור לקנה הנשימה. ודא שחלק מהסיד בצינור נשאר מחוץ לקנה הנשימה כדי לאפשר נשימה.לתקן את קנה הנשימה לעור החזה של העכבר על ידי ביצוע שלושה עד ארבעה קשרים מכשיר. לקשור את קנה הנשימה עם חוט התפר כדי לאבטח את צינור אינטובציה. חתך את שריר העצם לאורך סיבי השריר עם מלקחיים עדינים.חותכים את החלק המבודד עם מספריים האביב. בזהירות חינם שאריות קנה הנשימה וגרון מן השריר כדי למזער את הנזק על כלי הדם בשריר. הסר שאריות קנה הנשימה וגרון.ושט חינם מרקמות מחוברות עם מלקחיים לחתוך אותו עם מספריים באביב. הסר את שריר האורך המכסה את גזע המוח ואת הקשת הגחונית של האטלס. הסר את השריר המכסה את קשת הגחון האטלס ואת פקעת קפם.חותכים את קשתות הגחון של האטלס עם rongeur. הסר את פקעת האטלס החיצונית. הסר את הדם והנוזל כדי להציג את מגנום פורמן ואת גזע המוח.הרחב את מגנום המזחלות על ידי הסרת עצם העורף עם הרונגור. הסר את הסחוס, ולקלף בזהירות את השכבה periosteal של דורה מאטר עם מלקחיים עדינים יש תצוגה ברורה של גזע המוח הגחוני. מהדק את חיישן SpO2 על הירך של העכבר כדי לפקח על סימנים חיוניים כגון קצב הלב, רוויית חמצן וקצב נשימה.הר את עדשת GRIN על מוט ההשתלה. נקה את העדשה בזהירות עם רקמת ניקוי ספוגה באתנול של 70%. לתקן את מוט ההשתלה על מסגרת סטראוטקסית ולהרכיב את המיקרוסקופ המיניאטורי על מוט ההשתלה.הוסף כמה טיפות של מלוחים באזור גזע המוח לטבילה של עדשת GRIN. התקרב לגזע המוח עם עדשת GRIN. GCaMP6s המבטא נוירוני זית נחותים באזור השטחי ניתן למצוא באזור בצורת מלבן, על 0.5 עד 1.7 מילימטר rostral אטלס הנותרים, ועל 2.6 כדי 1.1 מילימטר לרוחב לקו האמצע.הפעל את הנורית הכחולה של העירור במיקרוסקופ מיניאטורי כדי לאתר נוירוני זית נחותים של GCaMP6s. הנוירונים מראים עוצמת פלואורסצנטיות בסיסית שונה עקב רמת ביטוי GCaMP6s שונים. השינוי של רמת הסידן של סומטה נוירון זית נחות בעיגול בסרטון בצד שמאל יראה לנו דלתא F מחולק על ידי עקבות F בצד ימין.למרות העכבר נשמר חם hydrated, זה יהיה בהכרח נחלש על ידי הרדמה ממושכת וניתוח. זה חיוני כדי לשמור על משך הניתוח קצר כך מצב פיזי העכבר יהיה טוב להקלטה. חוקר מיומן יכול לסיים את הניתוח בתוך 70 דקות.שיטה זו, עם שינויים, ניתן להשתמש כדי ללמוד אזורים סמוכים אחרים של גזע המוח הגחוני.

in-vivo-calcium-imaging-in-mouse-inferior-olive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

מקור: Shannonhouse, J.,  et al. In vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גב שלמים. J. Vis. Exp. (2023). הסרטון מדגים טכניקת הדמיית סידן in vivo לניטור פעילות עצבית בגרעיני השורש הגבי (DRG) של עכבר טרנסגני. נוירונים DRG מבטאים אינדיקטור סידן המגביר את עוצמת הקרינה בעת הקישור לסידן. גירויים מכניים או תרמיים המופעלים על כפה אחורית מייצרים פוטנציאל פעולה המתפשט ל-DRG, גורם לזרימת סידן בתאי העצב וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטיות מוגברת.

הדמיית סידן in vivo של הרכבים עצביים בגרעיני השורש הגבי השלמים של עכבר

מקור: Lee, H. et. al., הדמיית סידן מוצלחת in vivo עם מיקרוסקופ ממוזער המותקן על הראש באמיגדלה של עכבר שמתנהג בחופשיות. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית סידן in vivo בעכבר באמצעות מקדם שבירה שיפוע, או עדשת GRIN, ומיקרוסקופ ממוזער. המערך משלב קיבוע ראש בתוך מערכת כלובים ניידת ללא חיכוך, מגרה נוירונים ומעורר זרם יוני סידן. עדשת GRIN לוכדת איתות סידן במוח, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית.

הדמיית סידן מיקרואנדוסקופית בזמן אמת בעכבר הנע בחופשיות

פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס מבצעת תפקידים חיוניים ומובחנים בלמידה ובזיכרון. פרוטוקול זה מתאר סדרה של הליכים חזקים ויעילים להדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת בעכברים הנעים בחופשיות.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

פרוטוקול זה מפרט הדמיית סידן ב-vivo של נוירונים היפותלמיים באמצעות מיקרוסקופ מוקטן (מיניסקופ) בעכברים המתנהגים בחופשיות במהלך מניפולציה של מצב חברתי (בידוד חברתי ואיחוד חברתי). שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה של נוירון יחיד של פעילות ההיפותלמוסית שמייצגת צורך חברתי וסיפוק חברתי, ומאפשרת מחקרים מכניים של הומאוסטזיס חברתי.

In Vivo הדמיית סידן עם מיקרוסקופ מיניאטורי בהיפותלמוס להבנת התנהגויות חברתיות בעכברים

למד פרוטוקול ניתוחי לחשיפת גזע המוח בעכברים בוגרים מצד הגב, המאפשר הדמיית סידן in vivo באמצעות עדשות GRIN. השיטה מאפשרת מעקב אחר פעילות נוירונים בזית תחתון ללא פגיעה במבנים חיוניים.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

גלה סרטונים נוספים