גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

פרוטוקול זה יכול לשמש לייצור חלקיקי שומנים אנקפסולציה חומצת גרעין עם רבייה גבוהה ומהירות ונפחים נמוכים. ניתן לכוונן את פרמטרי הניסוח כדי להשיג הפצה ביולוגית רצויה המבוססת על היישום הקליני. עיצוב הרינגבון הסטנדרטי של מחסנית המיקרופלואידית מאפשר זרימת למינאר מהירה, מדויקת ומבוקרת במהלך הערבוב.

השיטה מקובלת על קנה המידה ומייצרת חלקיקים אחידים, מאוד עטופים. עם רוב מוצרי ריפוי גנטי שאושרו מסחרית מסתמכים על שיטות ויראליות, הליך זה יכול לספק תובנה על אספקת גנים, כמו הגישה הלא ויראלית שלה מאפשרת יישומים שעבורם מנון חוזר יש צורך. התחל על ידי הוספת הכמות המתאימה של כל פתרון מלאי נוזלי בקבוקון זכוכית עם מערבולת לסירוגין.

כפי שצוין בטבלה, ואחריו תוספת של 200 אתנול הוכחה לנפח סופי של 533 מיקרוליטרים. לאחר מכן להוסיף את הכמות המתאימה של מלאי mRNA לדלל עם חוצץ ציטוט כדי להשיג נפח סופי של 1.5 מיליליטר בריכוז הרצוי. כדי להפעיל את הערוצים המיקרופלואידיים, הזינו תחילה את הפרמטר priming לתוכנת המכשיר כפי שמתואר בטבלה.

לאחר מכן, פתח את מכסה המכשיר והכנס מחסנית מיקרופלואידית לתוך הבלוק המסתובב. לטעון לפחות 500 microliters של אתנול לתוך מזרק 1 מיליליטר, לטפל בכך שאין בועות או מרווחי אוויר בקצה המזרק ולהכניס את המזרק לתוך הכניסה הימנית של המחסנית. לטעון מזרק חמישה מיליליטר עם 1.5 מיליליטר של חוצץ סיטראט, דואג כי אין בועות אוויר או פערים, ולהכניס את המזרק לתוך הכניסה השמאלית של המחסנית.

מניחים שני צינורות חרוטיים 15 מיליליטר לתוך מחזיקי קליפ לשמש מיכלי פסולת ולחץ Go "כדי לערבב את הפתרונות. כאשר המכשיר מפסיק להתגבש כפי שצוין על ידי האור הכחול התחתון כיבוי, לפתוח מאוחר כראוי להיפטר הצינורות החרוט ומזרקים. להיווצרות חלקיקי שומנים בדם, להגדיר את הפרמטרים ניסוח המתאים כפי שצוין בטבלה לטעון מזרק 1 מיליליטר עם תערובת שומנים שהוכן בעבר.

הסר את כל מרווחי האוויר או בועות בקצה המזרק ולהכניס את המזרק לצד ימין של המחסנית. לטעון את פתרון חומצת גרעין שהוכן בעבר לתוך מזרק 3 מיליליטר, לטפל בכך שאין בועות או מרווחי אוויר בקצה המזרק, ולהכניס את המזרק לתוך הכניסה השמאלית של המחסנית. מניחים צינור חרוט ללא RNAase 15 מיליליטר שכותרתו עם שם המדגם לתוך קליפ הצינור השמאלי ומניחים חרוט פסולת 15 מיליליטר בסרטון הצינור הימני.

סגור את מכסה המכשיר ולחץ Go.פתרונות השומנים וה- mRNA יזרמו דרך המחסנית המיקרופלואידית ופתרון הננו-חלקיקים השומנים ייאסף בצינורות החרוט. שמור על הצינור החרוט בסוף תהליך ניסוח, ולאחר מכן לדלל את חלקיקי השומנים עם 5 מיליליטר של PBS וארון בטיחות ביולוגי. כדי לבצע חילופי חיץ, תחילה לשטוף מראש מסנן נקבוביות בגודל 100 קילודלטון אולטרה צנטריפוגה עם 2 מיליליטר של PBS, צנטריפוגה, ולאחר מכן לרוקן את PBS מהתא התחתון.

הוסף את חלקיקי השומנים המדוללים לתא העליון של מסנן האולטרה-צנטריפוגה שנשטף מראש לשלושה שטיפות צנטריפוגות, תוך השלכת הזרימה דרך והוספת 5 מיליליטר של PBS למסנן האולטרה-צנטריפוגה לאחר שתי השטיפות הראשונות. לאחר הכביסה האחרונה, pipette פתרון ננו חלקיקים שומנים על הקירות של מסנן ultracentrifuge כמה פעמים כדי למזער את אובדן הננו-חלקיקים לפני העברת פתרון הננו-חלקיקים לחתונה ללא נוקלאז. לאחר מכן להוסיף PBS להביא את ההשעיה ננו-חלקיקים לריכוז ניסיוני מתאים ונפח לפי הצורך.

כדי להעריך את יעילות אנקפסולציה של חלקיקי השומנים, ראשית להכין דילול סדרתי כפול של פתרון חומצת גרעין עבודה PBS כדי ליצור עקומה סטנדרטית, החל 500 ננוגרם למיליליטר ועושה לפחות חמישה דילולים. לאחר מכן, להכין את דילול מדגם חלקיקים ב- PBS כדי להשיג ריכוז תיאורטי מתאים השוכן סביב נקודת האמצע של העקומה הסטנדרטית. לאחר מכן להכין את ריאגנט RNA ירוק ריבו כדי לזהות נוכחות של RNA בתוך ומחוץ חלקיק השומנים על ידי ערבוב הכמויות המתאימות של ריאגנט RNA, טריטון X100 ו- PBS.

לאחר מכן, כדי לזהות את נוכחותו של RNA מחוץ לחלקיק הנוזלי, לערבב את הכמויות המתאימות של ריאגנטים RNA ו- PBS בלבד. עומס משכפל את הפתרונות הסטנדרטיים של חומצת הגרעין וננו-חלקיקי השומנים ללוח 96 באר שחור בעל יכולת פלואורסצנטיות, ולאחר מכן הוסף נפח שווה של ריאגנט כימות RNA עם, וללא טריטון X100 לשכפולים הסטנדרטיים והמדגמיים. לנער את הצלחת בקורא הלוח במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור כדי לקבל ערבוב יסודי של הדגימות, ולאחר מכן למדוד את הפלואורסצנטיות על קורא מיקרו-לוח אורך גל עירור של 480 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר.

כדי למדוד את הגודל ההידרודינמי ואת פיזור פולי של חלקיקי השומנים, תחילה לדלל את פתרון הננו-חלקיקים 40 פעמים ב- PBS ולהוסיף את הפתרון למיקרו cuvette למחצה. טען את cuvette על Zetasizer ולבחור הליך הפעלה סטנדרטי כדי להגדיר את המכשיר כדי למדוד את הננו-חלקיקים על פי החומר שלהם, פיזור, טמפרטורה וסוג התא. לאחר מכן לחץ על התחל"כדי למדוד את הגודל ההידרודינמי ואת פיזור פולי של חלקיקי השומנים.

כדי למדוד את פוטנציאל זטה של חלקיקי שומנים בדם, לדלל את פתרון הננו-חלקיקים 40 פעמים במים ללא נוקלאז ולהעמיס את הפתרון לתוך cuvette לקו המילוי. טען את cuvette לתוך מנתח פוטנציאלי זטה, דואג כי האלקטרודות ליצור קשר עם המכשיר, ולהגדיר את המכשיר כדי למדוד את הפוטנציאל זטה על פי האיפור הספציפי של חלקיקי השומנים. לאחר מכן לחץ על התחל"כדי למדוד את פוטנציאל הננו-חלקיקים השומנים של זטה.

בניתוח זה, קבוצות מרובות של חלקיקי שומנים בדם עם אותו ניסוח שומנים ויחס אמין לפוספט פותחו בימים נפרדים כדי להדגים את יכולת הרבייה של הטכניקה. כפי שנצפה, אצוות אחת ושתיים הציגו התפלגות גודל חופפת עם פיזור פולי דומה, ללא הבדלים משמעותיים שנצפו בגודל או ביעילות אנקפסולציה בין האצוות. בדרך כלל, שינויים בפרמטרים ניסוח לגרום כמה הבדלים קטנים אך משמעותיים סטטיסטית.

לדוגמה, הפחתת יחס האמין לפוספט גורמת לירידה של 4% ביעילות האנקפסולציה, עם עלייה במקביל בקוטר ההידרודינמי של הננו-חלקיקים. חלקיקי שומנים בדם מנוסחים עם שומנים שונים, אך אותו יחס אמין לפוספט, מציגים שינוי משמעותי ביעילות אנקפסולציה, כמו גם הבדלים קלים בקוטר החלקיקים. אנקפסולציה של DNA plasmid תוצאות חלקיקים גדולים יותר לעומת mRA אנקפסולציה חלקיקי שומנים, אם כי שני סוגי חלקיקים להפגין יעילות אנקפסולציה דומה.

שינויים בפרמטר תהליך קצב הזרימה, עם זאת, אינם משפיעים על התפתחות הננו-חלקיקים של השומנים. חלקיקי השומנים יש יישומים גדולים, הדוגמה המושלמת להיות חיסוני COVID-19 שאושרו לאחרונה. טכניקה זו משמשת ערכת כלים נהדרת וסוללת את הדרך ליישומים עתידיים על ידי מתן אפשרות להקרנת ניסוח גפיים תחתונות.