Name: אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: למד את שיטת האלוטרנספלנטציה של גידולים ב-Drosophila melanogaster באמצעות מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות. שיטה זו משפרת את היעילות, המהירות והתפוקה במחקרי סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי המעבדה לשעבר ד"ר שנג-אן יאנג ולמר חואן-מרטין פורטייה על תרומתם בפיתוח פרוטוקול זה. אנו אסירי תודה למעבדתו של ד"ר יאן סונג בבית הספר למדעי החיים של אוניברסיטת פקין על שיתוף הפרוטוקול שלהם בנושא הקצאה ידנית. אנו מודים גם למר קאלדר אלסוורת' ולמר אוורסט שפירו על הקריאה הביקורתית בכתב היד.
נשק להשמדה המונית קיבל מימון (GM072562, CA224381, CA227789) עבור עבודה זו מהמכון הלאומי לבריאות (https://www.nih.gov/) ומימון (IOS-155790) מהקרן הלאומית למדע (htps://nsf.gov/). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בהחלטה על פרסום או בהכנת כתב היד.

1. הכנת גידול טבעת דמיוני SG
<ol><li>צלב זבובים בוגרים עם גנוטיפים של UAS-NICD (זכר: 10-15 זבובים) ו - Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (נקבה בתולה: 10-15 זבובים) ומאפשר להם להתרבות במשך יום אחד ב -18 מעלות צלזיוס. הזבובים הבוגרים שנבחרו צריכים להיות בני 5-9 ימים כדי להבטיח פוריות גבוהה.</li>
	<li>אפשרו לזבובים הבוגרים להטיל ביצים במזון הזבובים הכלול בבקבוקונים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס, ואז הסירו את הזבובים הבוגרים. הערה: מזון זבובים מוכן באמצעות מתכון מזון קמח תירס סטנדרטי ממרכז Drosophila Stock 8. כל בקבוקון צריך להכיל כ-10 מ"ל של מזון זבובים.</li>
	<li>אפשרו לביצים לדגור במשך 6 ימים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. במהלך תקופה זו, הזחלים יבקעו.</li>
	<li>מעבירים את הבקבוקונים המכילים זחלים לחממה של 29 מעלות צלזיוס ואינקובציה למשך 7 ימים נוספים. הערה: שלב דגירה זה הוא אופציונלי בהתאם לתכנון הניסוי הספציפי.</li>
</ol>2. הכנת דרוזופילה מסוג בר בוגר להקצאת אלוטרנספלנטציה
<ol><li>מרדימים זבובים בוגרים מסוג פראי או מוטנטיים מתאימים עם 100% CO2 וממיינים זבובים על בסיס מינים. זבובים זכריים ונקביים כאחד יכולים לשמש כמארחי גידול.</li>
	<li>הצמידו פיסת סרט דבק באורך 5 ס"מ לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הדביק למעלה על ידי תיקון שלה עם שתי חתיכות קטנות יותר של סרט הדבקה, אחת בכל קצה.</li>
	<li>שתקו את הזבובים על ידי הצמדת כנפיהם לקלטת. השתמש במלקחיים תוך כדי תמרון הזבובים.<ol>
<li>חזור על השלב הנ"ל עבור 60-80 זבובים בוגרים המשמשים כמקבלי allograft. הערה: עדיף לארגן זבובים בשורות מסודרות, כאשר ציר הגוף שלהם מיושר במקביל זה לזה לתהליך הזרקה יעיל יותר בזמן מאוחר יותר. איור 1 מציג שורות של זבובים מארחים מודבקים כלפי מטה באופן זה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הרכבת מנגנון האוטו-איניג'קטור
<ol><li>חברו גם את מנגנון ההתקן האוטומטי וגם את כבל החשמל לתיבת הבקר.<ol>
<li>הגדר את נפח ההזרקה ל- 59.8 nL. זה יעזור לשמור על הכמות המתאימה של כוחות יניקה והזרקה במהלך allotransplantation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את תיבת הבקר ואת ה- autoinjector בצדדים מנוגדים של מיקרוסקופ האור. הערה: עבור מפעילים ימניים, יש למקם את תיבת הבקרה בצד שמאל של המיקרוסקופ עם המזרק בצד ימין. להיפך עבור מפעילים שמאליים.</li>
	<li>הכינו את נימי הזכוכית בגודל 3.5 אינץ' לשימוש על ידי חיתוך הקצה הסגור עם מלקחיים.<ol>
<li>לעבד קצה אחד של נימי הזכוכית באמצעות מושך מיקרופיפט בן ארבעה שלבים וחום לקצה צר וסגור באמצעות המפרטים הבאים במכשיר: חום = 650, כוח = 200, ומרחק = 8. מקם בצורה מסודרת את הנימים במנגנון המושך והפעל את התוכנית לאחר הזנת ההגדרות לעיל.</li>
		<li>השתמש במלקחיים כדי לחתוך את הנימים בזווית של כ-60° כדי ליצור קצה חד יותר לכניסה קלה לבטן הזבוב הבוגר1. ראו איור 2 דוגמה לנימי נכים חתוכים היטב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שחררו קלות את הכובע של המזרק. הצמידו את כפתור ה-Empty כדי לקדם את מחט המזרק עד שיראו 70%-80% מאורכו הכולל. כדי להאיץ את התקדמות הנימים, לחץ על לחצן מילוי פעם אחת תוך לחיצה בו-זמנית על הלחצן 'ריק '.</li>
	<li>השתמש במזרק כדי למלא את נימי הזכוכית בשמן מינרלי. לאחר מכן, הכנס בזהירות את נימי הזכוכית על מחט המזרק עד שהראשון מחובר בחוזקה לפקק הגומי של המזרק. עכשיו תברגו את מכסה המזרק חזק.<ol>
<li>נגבו את שאריות השמן המינרלי על פני השטח החיצוניים של כיסוי נימי הזכוכית כדי למנוע זיהום של המדיום במהלך ההקצאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. דיסקציה של גידול הטבעת הדמיונית SG
<ol><li>בחר אחד מהזחלים והעביר אותו לצלחת דיסקציה מלאה ב-100 מיקרול'ס מדיום של שניידר כדי להתכונן לנתיחה של גידול טבעתי דמיוני של SG. הערה: רק הדגימות המכילות את הגידול יישארו כזחלים. הסיבה לכך היא שצמיחת הגידול מעכבת את התפתחות הזחל ואתהתקדמותו 9. שני שלישים מהדגימות לא יאכלו את הגידול ולכן יתקדמו לגלמים/מבוגרים.<ol>
<li>למטרות כריתה והקצאה, השתמש בסטריאומיקרוסקופ עם טווח הגדלה של 10x-20x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות זוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את החלק האמצעי של גוף הזחל, צובטים את ראש הזחל באמצעות זוג מלקחיים נוספים ומפעילים כוח מתיחה לאורך.</li>
	<li>אתרו את ה-SG בצורת Y של הזחלים ובודדו אותו משאר רקמת הזחל10.</li>
	<li>לנתח ולבודד את הגידול הטבעתי הדמיוני SG על ידי הסרת הרקמה הסמוכה. ראו איור 3 לתיאור של תהליך הנתיחה הזה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.1-4.4 עבור 10 עד 20 גידולי טבעת דמיוניים נוספים של SG המבוססים על צרכי מחקר.</li>
</ol>5. Allograft של גידול טבעת דמיוני SG ראשוני
<ol><li>טבלו את הנימים לתוך המדיום של שניידר המכיל את גידולי הטבעת הדמיוניים העיקריים של SG. הקישו לחיצה על כפתור המילוי כדי למלא את נימי הזכוכית ב-Schneider's Medium עד לקטע העליון של 0.5 ס"מ. קטע עליון זה צריך להישאר מלא בשמן מינרלי. הערה: האץ תהליך זה על-ידי לחיצה על לחצן 'ריק ' פעם אחת תוך לחיצה בו-זמנית על לחצן 'מילוי '.</li>
	<li>אתרו גידול ראשוני ולחצו על כפתור המילוי עד שהגידול נשאב לתוך הנימים.<ol>
<li>ודא שהגידול יושב בקצה הנימים או במרחק של כמה מילימטרים מקצה הנימים. זה עוזר למנוע את הגידול להיסחף וללכת לאיבוד בתמיסה הכלולה בתוך הנימים. ראו איור 4A להדגמה של מיקום הגידול המתאים כשהוא יושב בנימילים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אתר זבוב מבוגר משותק לקלטת על שקופית המיקרוסקופ. באמצעות מלקחיים, החזק בעדינות את הבטן התחתונה. לאחר מכן, לנקב את הציפורן הלטרלית התחתונה של הבטן עם הנימים. לחץ על כפתור ריק עד שהגידול נכנס לבטן המארחת החדשה. ראו איור 4B להדגמה של טכניקה זו.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, צובטים בעדינות את כנפיו של המארח כלפי מעלה כדי להסיר אותו מהסרט. מכניסים את המארח לבקבוקון חדש עם אוכל טרי. עדיף למקם את הבקבוקון לצדדים במשך 24 השעות הראשונות לאחר ההזרקה. כל בקבוקון צריך להכיל רק עד 20 זבובים לכל היותר. הערה: לחלק מהזבובים המארחים יהיו כנפיים חסרות ופצעים אחרים על גופם לאחר ההזרקה והם עלולים להידבק למזון הזבובים אם הבקבוקון מונח זקוף.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.2 עד 5.4 כדי להשתיל את הגידולים הראשוניים הנותריםבמארחים הבוגרים החדשים שלהם.
</li>
	<li>השליכו נימים למיכל של שארפ ונקו את שאריות השמן המינרלי מהחלק החיצוני של האוטו-איניג'קטור לפני שהחליפו את המנגנון בחזרה לתוך הקופסה שלו.</li>
	<li>אחסנו את בקבוקון המארחים בטמפרטורת החדר למשך יום אחד, ולאחר מכן העבירו את הבקבוקון לתא דגירה בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס. העברת מארחי זבובים לבקבוקונים חדשים כל 2-3 ימים.</li>
	<li>עקוב אחר מארחי הזבובים מדי יום וחשב את שיעורי ההישרדות. לאחר שבוע, גידולים צריכים להיות גלויים תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מתאם פלואורסצנטי וניתן לעקוב אחריהם באופן רציף אחר גודלם והתקדמותם.</li>
</ol>6. השתלה מחדש של גידולים מושתלים
<ol><li>בסביבות 10-14 ימים לאחר ה-allograft, יש לסנן גידולים שגדלו בבטן המארחת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>הרדימו פונדקאי עם CO2 והניחו אותו בצלחת דיסקציה מלאה במדיום של שניידר של 100 μL. נתחו את הגידול הגדל מתוך הפונדקאי באמצעות שני זוגות מלקחיים.<ol>
<li>השתמשו בזוג אחד של מלקחיים כדי להחזיק את הבטן ובזוג השני כדי לפתוח את קוטיקת הבטן, וחשפו את הגידול המושתל1.</li>
		<li>יש לבודד בזהירות את הגידול מהרקמות המארחות המחוברות ככל האפשר באמצעות סמני פלואורסצנציה כהנחיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על שלב 6.2 כדי להתכונן לשניים עד שלושה גידולים נוספים.</li>
	<li>מעבירים את לוחית הנתיחה המכילה את הגידולים שנקטפו על הבמה של מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>השתמש במחטים סטריליות ונתח את הגידולים לחתיכות קטנות יותר המתאימות לגודל הנימים.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.1-4.5 כדי להכין את הדור החדש של המארחים הבוגרים ולחזור על שלבים 5.1-5.7 כדי להשלים את ההקצאה של הגידולים. הערה: שיעורי ההצלחה בדרך כלל גבוהים יותר עבור גידולים שאינם ראשוניים בהשוואה לאלה של גידולים ראשוניים.</li>
	<li>חזור על שלבים 6.1-6.6 עבור כל דור הבא של זבובים המשמשים במחקר. הערה: בחר קווי מארח של Drosophila המתאימים לצרכים הניסוייים.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+tumor+growth+in+Drosophila+using+the+tissue+allograft+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).</li>
<li>Magadi, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Hes-centred+transcriptional+networks+in+neural+stem+cell+maintenance+and+tumorigenesis+in+Drosophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia.</a> Development. 147 (22), (2020).</li>
<li>Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaller%2C+S+%22Pseudomonas+Methods+and+Protocols%22">Pseudomonas Methods and Protocols</a>. , Springer. 723-740 (2014).</li>
<li>Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+protocol+for+the+African+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%2C+by+means+of+nano-injection%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection.</a> African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).</li>
<li>Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+nanoinjection+and+electrophysiology+assay+to+screen+for+bioactivity+of+compounds+using+the+Drosophila+melanogaster+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).</li>
<li>Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+notch+triggers+neoplastic+tumorigenesis+in+a+transition-zone-like+tissue+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment.</a> Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BDSC+Cornmeal+Food%22">BDSC Cornmeal Food</a>. , (2020).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
<li>Kennison, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+larval+salivary+glands+and+polytene+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Ji, H., Han, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LarvaSPA%2C+a+method+for+mounting+drosophila+larva+for+long-term+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).</li>
<li>Mirzoyan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+organism+to+study+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer.</a> Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).</li>
<li>Bangi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+at+the+intersection+of+infection%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).</li>
<li>Saavedra, P., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+tumor-induced+organ+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+drosophila+tumors+interrupt+insulin+signaling+to+induce+cachexia-like+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting.</a> Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Koyama, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bellymount+enables+longitudinal%2C+intravital+imaging+of+abdominal+organs+and+the+gut+microbiota+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila.</a> PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים להצהיר בין המחברים.

אלוטרנסנטציה של גידולים יכולה לסייע לחוקרים לטפל בבעיות מסוימות המתעוררות במהלך גדילת הגידול בהתקדמותו של דרוזופילה. אתגר אחד כזה הוא עקיפת מקרי מוות בטרם עת של זחלים נושאי גידול או מבוגרים במהלך תרבית גידול ראשונית12. בהקשר זה, המשך ההקצאה של הגידול מאפשר לגידולים לגדול ללא הגבלת זמן, מה שמקל על מחקרי אורך של גדילת גידולים, גרורות ואבולוציה. אלוטרנספלציה של גידולים שימושית גם להערכת היבטים שונים של אינטראקציות בין פונדקאי לגידול 7,13</...

פרוטוקול זה מספק הנחיה שלב אחר שלב להקצאה של גידולים דמיוניים של בלוטת הרוק הזחלית של דרוזופילה (SG) לתוך הבטן של מארחים בוגרים באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי (למשל, Nanoject). פרוטוקול זה מספק גם כיוונים להשתלה מחדש של גידולים לדורות חדשים של מארחים בוגרים, מה שמספק הזדמנויות להמשך מחקר אורך של מאפייני הגידול, כגון אבולוציה של גידולים ואינטראקציות בין גידולים לפונדקאים. ניתן ליישם את הפרוטוקול גם על ניסויים בסינון תרופות.
שיטה זו פותחה כדי לשפר את היעילות של ביצוע allotransplantation הגידול ב Drosophila באמצעות מזרקים ידניים1, אשר לעתים קרובות אינם עקביים בכוחות היניקה וההזרקה שלהם, מה שמוביל לתוצאות לא אופטימליות עבור allotransplantation הגידול. מנגנון אוטו-איניג'קטור מספק שליטה טובה יותר ויכול לגרום לשיעורים נמוכים יותר של תמותת זבובים לאחר אלוגרפט. מפעיל מיומן יכול להשיג שיעור הישרדות של יותר מ-90% עם המזרק האוטומטי, לעומת כ-80% כאשר נעשה שימוש במזרק הידני1. שיעור רכישת הגידול הכולל הוא 60%-80% ביום 8-12 לאחר הלידה. זמן ההזרקה הממוצע השתפר גם הוא מ-30-40 שניות לטוס באמצעות מזרק ידני ל-20-25 שניות לטוס באמצעות האוטו-איניג'קטור.
פרוטוקול זה הוא בין הפרוטוקולים הראשונים שהשתמשו במנגנון האוטו-איניג'קטור באלוטרנספלנטציה של גידול דרוזופילה . מחקר שנערך לאחרונה השתמש גם ב-autoinjector עבור ההקצאה של תאי גזע עצביים סרטניים2. בעבר, מנגנון autoinjector שימש Drosophila כדי לחקור ויראליות חיידקית3, זיהומים טפיליים והגנה המארח4, כמו גם הקרנה עבור פעילות ביולוגית של תרכובות שונות5. הפרוטוקול שלנו מתאים את מנגנון ה-autoinjector לשימוש בהזרקת גידולים ומבקש לספק לחוקרי Drosophila תוצאות איכותיות ועקביות יותר תוך חיסכון בזמן רב. פרוטוקול זה יכול לשמש לא רק עבור allotransplantation של גידולים, אלא יכול להיות מותאם גם אלוטרנספלנטציה של wildtype ורקמות מוטנטיות של קליבר דומה6.
גידול ה-Drosophila NICD המשמש בפרוטוקול זה הוצג לראשונה על ידי Yang et al.7 באזור המעבר של הטבעת הדמיונית SG, "נקודה חמה של גידול" המציג רמות גבוהות של מתמר ג'אנוס קינאז/אותות אנדוגניים ומפעילי שעתוק (JAK-STAT), ופעילות c-Jun N-terminal Kinase (JNK). בנוסף, באזור המעבר יש רמות גבוהות של מטריצה metalloproteinase-1 (MMP1)7, מה שהופך את האזור הזה לתרום במיוחד לגידולים סרטניים. הפעלת מסלול חריץ באמצעות ביטוי יתר של NICD בלבד מספיקה כדי ליזום באופן עקבי היווצרות גידולים. לאחר מכן ניתן להקצות גידולים אלה כדי לאפשר חקירה של מגוון רחב של נושאים, כולל חלוקת תאי גידול, פלישה ואינטראקציות בין גידול לפונדקאי.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 980</td><td>ידוע גם בשם "Zeiss LSM 980"</td></tr>מזון <tr><td>זבוב קמח תירס</td><td>בלומינגטון דרוזופילה Stock Center</td><td>N/A</td><td>ידוע גם בשם "מזון קמח תירס סטנדרטי BDSC"</td></tr><tr><td>מחט דיסקציה (30Gx1/2)</td> <td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>צלחת דיסקציה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565B</td><td></td></tr><tr><td>קלטת זבוב</td><td>פישרברנד</td><td>159015A</td><td></td></tr><tr><td>מתאם פלואורסנטי למיקרוסקופ סטרו</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>SFA-UV</td><td>הידוע גם בשם "מתאם פלואורסצנטי של ים לילה"</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td>הידוע גם בשם "Zeiss Stereo Discovery.V8"</td></tr><tr>כלי <td>מדע עדינים</td> <td>של מלקחיים</td><td>11251-10</td><td>ידוע גם בשם "דומונט #5 מלקחיים"&nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית (3.5 '')</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>דבק</td><td>Elmer</td><td>E305</td><td>ידוע גם בשם "Elmer Washabale Clear Glue"</td></tr><tr><td>, מיקרוסקופ אור</td><td>Zeiss</td><td>435063-9010-100</td><td>ידוע גם בשם "Zeiss Stemi 305"</td></tr><tr><td>, Micropipette Puller</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>ידוע גם בשם "חולץ מיקרופיפטה ארבעה שלבים""</td></tr><tr><td>Nanoject Apparatus</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>ידוע גם בשם "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"</td></tr><tr>מזרק <td>ThermoFisher</td><td>21720001 בינוני</td><td></td> <td>של שניידר</td></tr><tr><td>(27G x1/2)</td> <td>BD PrecisionGlide</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון</td><td>Fisherbrand</td><td>AS507</td><td></td></tr></tbody></table>

אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

פרוטוקול זה מתאר את ההקצאה של גידולים ב - Drosophila melanogaster באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי. עם השימוש במנגנון autoinjector, מפעילים מיומנים יכולים להשיג תוצאות השתלה יעילות ועקביות יותר בהשוואה לאלה המתקבלות באמצעות מזרק ידני. כאן אנו מכסים נושאים בצורה כרונולוגית: החל מחציית קווי דרוזופילה , דרך אינדוקציה ונתיחה של הגידול הראשוני, השתלת הגידול הראשוני לפונדקאי בוגר חדש והמשך השתלה דורית של הגידול למחקרים ממושכים. כהדגמה, כאן אנו משתמשים בתחום התוך-תאי של Notch (NICD) בביטוי יתר המושרה על ידי גידולי טבעת הרוק המושרים על ידי בלוטת הרוק לצורך השתלה דורית. גידולים אלה יכולים תחילה להיות מושרים באופן אמין במיקרו-סביבה של אזור מעבר בתוך טבעות דמיוניות של בלוטת הרוק הזחלית, ולאחר מכן להשתיל אותם ולתרבת אותם in vivo כדי לחקור את המשך גדילת הגידול, האבולוציה והגרורות. שיטת ההקצאה הזו יכולה להיות שימושית בתוכניות בדיקת תרופות פוטנציאליות, כמו גם לחקר אינטראקציות בין גידול למארח.

כאן, ביצענו הקצאה דורית של גידולי טבעת דמיוניים של SG באמצעות מנגנון ההזרקה האוטומטית של הזרקת ננוליט וביצענו הדמיה חיה של הגידול לאחר מכן עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, שאיפשר צלילה עמוקה יותר לנושאים של צמיחת גידול, נדידת תאי גידול ואינטראקציות בין גידול למארח. בעת הרכבת זבובים, הדביקו אותם למגלשת מיקרוסקופ וריסן אותם באמצעות בלוק11 של פולידימתילסילוקסן (PDMS).
איור 5A כולל לכידת הדמיה חיה של גידול טבעת דמיוני SG מהדורהראשון</sup...

פרוטוקול זה מספק הדרכה מפורטת להקצאה הדורית הראשונית והמתמשכת של גידולי דרוזופילה לתוך בטנם של מארחים בוגרים לחקר היבטים שונים של ניאופלזיה. באמצעות מנגנון autoinjector, חוקרים יכולים להשיג יעילות משופרת ותפוקת הגידול בהשוואה לאלה שהושגו על ידי שיטות מסורתיות, ידניות.

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

פרוטוקול זה הוא בין הראשונים לתאר את השימוש במנגנון אוטו-איניג'קטור באלוטרנספלנטציה של גידול דרוזופילה. נושא שצבר פופולריות בשנים האחרונות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מגבירה את היעילות של מחקר הסרטן ב Drosophila על ידי שיפור המהירות, העקביות והתפוקה של allotransplantation הגידול.אלוטרנספלציה של הגידול בדרוזופילה היא טכניקה עדינה שקשה לשלוט בה. היו סבלניים וסמכו על כך שהתרגול הופך למושלם. לאחר חציית הזבובים ודגירה של הביצים במשך שישה ימים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס, מעבירים את הבקבוקונים המכילים את הזחלים הבוקעים לאינקובטור שנקבע על 29 מעלות צלזיוס.מיין את סוג הבר המרדים או את הזבובים הבוגרים המוטנטים על סמך המין שלהם. הצמידו חתיכת סרט זבוב באורך חמישה סנטימטרים לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הדביק למעלה. לשתק את הזבובים על ידי הצמדת כנפיהם לקלטת עם מלקחיים.מקם את תיבת הבקר ואת ה- autoinjector בצדדים מנוגדים של מיקרוסקופ האור. לעבד קצה אחד של נימי הזכוכית באמצעות מושך מיקרו פיפטה בן ארבעה שלבים, חימום אותו לקצה סגור צר. השתמש במלקחיים כדי לחתוך את הנימים בזווית של כ-60 מעלות כדי להכין נימי זכוכית בקוטר 3.5 אינץ'.שחררו קלות את הכובע של המזרק. הקישו לחיצה על הכפתור הריק כדי לקדם את מחט המזרק עד שיראו 70% עד 80% מאורך המזרק הכולל שלה. השתמש במזרק כדי למלא את נימי הזכוכית בשמן מינרלי.בחר אחד מהזחלים והעביר לצלחת דיסקציה מלאה ב-100 מיקרוליטרים של המדיום של שניידר כדי להתכונן לנתיחה של גידול טבעתי דמיוני SG. באמצעות זוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את המותניים של גוף הזחל, צובטים את ראש הזחל באמצעות זוג מלקחיים אחר ומפעילים כוח מתיחה לאורך כל הדרך. אתרו ובודדו את ה-SG בצורת Y של הזחלים, ולאחר מכן נתחו את גידול הטבעת הדמיונית SG על ידי הסרת הרקמה הסמוכה.מלאו את נימי הזכוכית במדיום של שניידר עד לקטע העליון של 0.5 סנטימטרים על ידי לחיצה על כפתור המילוי. אתרו גידול ראשוני ולחצו על כפתור המילוי עד שהגידול נשאב לתוך הנימים. ודא שהגידול יושב בקצה הנימים או במרחק של כמה מילימטרים מקצה הנימים.אתר זבוב מבוגר משותק לקלטת. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הבטן התחתונה ולנקב את הציפורן הלטרלית התחתונה של הבטן עם הנימים. לחץ על הכפתור הריק עד שהגידול נכנס לבטן המארחת החדשה.באמצעות מלקחיים, צובטים בעדינות את כנפיו של המארח כלפי מעלה כדי להסיר אותו מהסרט. לאחר מכן מכניסים אותו לבקבוקון חדש עם אוכל טרי. יש לסנן גידולים שגדלו בבטן המארחת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כ-10 עד 14 יום לאחר ה-allograph ולנתח את הגידול שגדל ב-allografted מתוך הפונדקאי באמצעות שני זוגות מלקחיים.השתמשו בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את הבטן ובזוג השני כדי לפתוח את קוטיקולת הבטן, ולחשוף את הגידול הכלוגרי. בזהירות לבודד את הגידול מן הרקמות המארח המצורפות. השתמש במחטים סטריליות ונתח את הגידולים לחתיכות קטנות יותר המתאימות לגודל הנימים.חזור על תהליך זה עבור דור חדש של מארחים בוגרים כדי להשלים את ההקצאה של הגידול. תהליך התפתחות הגידול היה במעקב על ידי הדמיה חיה של גידול טבעת דמיוני SG מהדור הראשון שגדל בבטן מארחת בוגרת ביום 10, לאחר ההקצאה. דור שישי של גידול טבעת דמיוני SG התופס חלק גדול מהבטן המארחת ביום 10, לאחר ההקצאה מוצג כאן.הדמיה בשלב זה עשויה לסייע בחשיפת דפוסי גדילת הגידול, כמו גם התנהגויות הנדידה והפלישה שלו. השתלת גידולים היא טכניקה נהדרת למחקרי אורך להתקדמות הגידול, אבולוציה וגרורות. תוצאות בעלות חשיבות רבה, לחקר אינטראקציות של מארח הגידול.לפרוטו זה יש פוטנציאל גדול במסכי תרופות לסרטן באמצעות התרופות Temodal. באמצעות טכניקה זו, החוקרים יוכלו לחסוך זמן ומאמץ משמעותיים בחקירה.

tumor-allotransplantation-drosophila-melanogaster-with-programmable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

אנו מציגים גישה חדשנית לכמת לוקליזציה nanoparticle ב vasculature של גידולים xenografted אנושי באמצעות דינמי, בזמן אמת הדמיה intravital במודל העובר העופות.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

שיתוף פעולה בין אונקוגן הופעל כמו RAS V12 ומוטציות בגנים קוטביות תא כמו שרבטה, לגרום לצמיחת גידול בדרוזופילה שבו תאים סרטניים גם להציג התנהגויות פולשנית. הנה פרוטוקול פשוט לאינדוקציה והתבוננות בגידולים שפירים ופולשנית מוצג.

פרוטוקול גנטי אינדוקציה ויזואליזציה של גידולים שפירים ופולשני בסוג cephalic מכלולי<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

השתלת תאי סרטן היא כלי חשוב לזיהוי מנגנוני סרטן ותגובות טיפוליות. הטכניקות הנוכחיות תלויים בבעלי חיים חסרי יכולת. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת תאים דג הזברה תאים לתוך עוברי המוסמכת-המוסמכת לניתוח לטווח ארוך של התנהגות התא הגידול בתגובות סמים vivo .

השתלת דג הזברה גידולים מוחיים במוח לתוך מארחים המוסמכת החיסונית עבור מחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים והתגובה לסמים

מטרת שיטה זו היא ליצור מודל vivo של אנגיוגנזה הגידול על ידי תאי גידול של השתלת מיונקים לתוך העובר הזרע כי יש מתויג כלים של כלי דם. על ידי הדמיה של השתל מבע כלים משויכים, מדידה כמותית של תגובת האנגיוגנטית ניתן להשיג.

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

זבובים בוגרים של Drosophila melanogaster נוצלו בהרחבה כאורגניזמים מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובות החיסוניות המולדות של המארחים ואסטרטגיות זיהום מיקרוביאליות. כדי לקדם את שלב הזחלים D. melanogaster כמערכת מודל נוספת או חלופית, מתוארת טכניקת הזרקת זחלים.

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת xenograft אוטומטית של גידול בזחלי דג זברה באמצעות מערכת הזרקה רובוטית חדישה. כמו כן, אנו מציגים סרטוני הזרקה ונתוני ולידציה המדגימים את הביצועים המוצלחים של המערכת.

אוטומציה של השתלת גידול בזחלי דג הזברה לחקר סרטן ורפואה

פרוטוקול זה מתאר תכנות מחדש in vivo של תאי סרטן עכבר לתאים דמויי דנדריטי מסוג 1 בתוך מיקרו-סביבת הגידול באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי השעתוק PU.1, IRF8 ו-BATF3.

תכנות מחדש של תאי גידול לתאים דמויי תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1

עם העניין הגובר באימונותרפיה תוך-גידולית, בחירת מודלים נגישים ומעשיים היא חיונית. גידולים תת-עוריים קלים לזיהוי אך קשה לדמיין ולמניפולציה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטות ליצירת גידולים תוך-עוריים המספקות נראות ונגישות משופרת.

השתלת גידול תוך-עורי כמודל חזק למחקרי אימונותרפיה תוך-גידולית בסרטן עכברים

למד את שיטת האלוטרנספלנטציה של גידולים ב-Drosophila melanogaster באמצעות מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות. שיטה זו משפרת את היעילות, המהירות והתפוקה במחקרי סרטן.

אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

גלה סרטונים נוספים