הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

הפרוטוקול שלנו מאפשר ניסוח של הידרוג'ל פולימר-חלקיקי לשימוש כמו ביו-חומרים. אנו מקווים שהחוקרים יפתחו חומר זה עבור יישומים תרגומיים ולחקור שאלות ביולוגיות בסיסיות. הידרוג'לים PNP מוזרקים בקלות דרך מחטים קטנים קוטר קטטרים, אבל מהר לרפא את עצמו לאחר הזרקה.

זה מאפשר משלוח מבוקר לא פולשני של תרופות ותאים לאורך צירי זמן ארוכים. טכנולוגיה זו דוחפת את הגבולות לטיפול מקומי ושחרור תרופות מורחב, עם השלכות על מצבים משתוללים רחבים מסרטן להתחדשות רקמות לחיסון פסיבי. כדי לסנתז ננו-חלקיקים על ידי משקעים ננו, להוסיף 50 מיליגרם של פולימר PEG-PLA בקבוקון זכוכית שמונה מיליליטר נוצץ ולהוסיף מיליליטר אחד של אצטוניטריל לבקבוקון.

וורטקס להתמוסס לחלוטין. לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של מים טהורים במיוחד בקבוקון זכוכית 20 מיליליטר עם בר ערבוב קטן ומניחים את הבקבוקון על צלחת ערבוב להגדיר 600 סיבובים לדקה. השתמש פיפטה 200 microliter להוסיף מיליליטר אחד של פתרון ממס פולימר dropwise לבקבוקון של מים.

חלקיקי ליבה-פגז ייווצרו כמו פתרון ממס פולימר מפוזר במהירות בכל המים. אמת את גודל החלקיקים על-ידי פיזור אור דינאמי בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר מכן העבירו את פתרון הננו-חלקיקים ליחידת סינון צנטריפוגלית כדי לרכז את הפתרון לפחות מ-250 מיקרוליטרים ולחדש את הננו-חלקיקים במאגר מתאים.

כדי להכין את הידרוג'ל, להוסיף 333 מיליגרם של 6%HPMC-C12 פתרון מנייתי מזרק מנעול לואר מיליליטר אחד ולהוסיף 500 מיקרוליטר של פתרון 20% ננו חלקיקים ו 167 microliters של PBS בקבוקון שמונה מיליליטר. לאחר ערבוב, להשתמש במחט כדי למלא עוד מזרק מנעול לואר מיליליטר אחד עם פתרון ננו חלקיקים מדולל ולחבר את שני המזרקים מערבל מרפק. מערבבים את שני הפתרונות כ-60 מחזורים עד שנוצר חומר הידרוג'ל לבן הומוגני ואטום.

כדי למדוד את המאפיינים הריאולוגיים של הידרוג'ל מנוסח, להזריק את הנפח המתאים של הידרוג'ל על פי הפער הגיאומטרי שנבחר למרכז צלחת rheometer משונן ולהשתמש בבדיקות תנודה וזרימה כדי למדוד את המאפיינים המכאניים של המדגם. כדי לאפיין את שחרור התרופה מן הידרוג'ל, הראשון, להכין נימי זכוכית באמצעות אפוקסי לאטום קצה אחד של כל צינור. כאשר האפוקסי מוגדר, להשתמש במחט hypodermic 22 אינץ' 4 אינץ' להזריק 100 כדי 200 microliters של הידרוג'ל לתוך מינימום של שלושה צינורות לכל מדגם, בזהירות להוסיף 200 כדי 300 מיקרוליטרים של PBS על כל נפח של הידרוג'ל.

בנקודות הזמן המתאימות, על פי ציר הזמן הצפוי של שחרור סמים, להשתמש במחט כדי להסיר בזהירות את PBS מכל נימי מבלי להפריע משטח הידרוג'ל ולהוסיף נפח טרי של PBS. בסיום המחקר, לנתח את aliquots PBS שנאספו עם שיטה מתאימה לכמת את כמות התרופה שוחרר בכל נקודת זמן. כדי לאפיין את היציבות התרמית של אינסולין אנקפסולציה ג'ל, לטעון הן אינסולין thioflavin T לתוך הידרוג'ל כפי שהוכח ולהשתמש מחט 21 מד להזריק 200 microliters של המטען ולבדוק הידרוג'ל טעון לתוך לפחות שלוש בארות של צלחת שחורה 96-באר לכל מדגם.

לאחר מכן לאטום את הצלחת עם חותם צלחת דבק אופטי ברור כדי למנוע אידוי ולהכניס את הצלחת לתוך קורא צלחת מצויד בקרת טמפרטורה, רועד תכנות קריאה קינטית. כדי להעריך את הכדאיות התא אנקפסולציה הידרוג'ל, להשתמש במחט 21 מד להזריק 150 microliters של הידרוג'ל המכיל את הריכוז המתאים של תאים לתוך כל אחת משלוש בארות לכל מדגם בצלחת 96-well התחתון ברור ולהוסיף 100 microliters של מדיום התא המתאים לתוך כל נפח של הידרוג'ל. ביום הראשון של התרבות, להחליף את supernatant על כל הידרוג'ל בנקודת הזמן המתאימה עבור כל קבוצת מדגם עם 50 microliters של פתרון AM קלצין שני מילימולאר.

לאחר דגירה של 30 דקות, תמונה במרכז כל באר על ידי מיקרוסקופיה confocal. כדי להעריך את היכולת של התאים encapsulated להתיישב במזרק לפני ההזרקה, לדלל את התאים של עניין אחד פעמים 10 כדי שישה תאים למיליליטר בריכוז PBS ולהכתים את התאים עם 50 microliters של שני קלצין מילימולר AM במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מערבבים את התאים עם 500 עד 700 מיקרוליטרים של הידרוג'ל כפי שהוכח ומשתמשים במחט 21 מד להזריק 100 עד 200 מיקרוליטרים של תא המכיל הידרוג'ל לתחתית של לפחות cuvette אחד לכל מדגם.

ואז לדמיין את cuvettes שוכב שטוח על הצדדים שלהם על הבמה של מיקרוסקופ confocal מיד לאחר ההזרקה ובשעה וארבע שעות לאחר הזריעה כדי לבחון אם התאים התיישבו הידרוג'ל או אם הם נשארו מושעים. ניתן להבחין ביכולות ההידלדלות והריפוי העצמי של הג'ל באמצעות סריקת זרימה ופרוטוקולי גזירה חורגת, בהתאמה. אפיון מודולי אחסון ואובדן באמצעות ניסוי ניקוי תדר גזירה תנודה במשטר viscoelastic ליניארי בטווחי תדירות בין 0.1 ל 100 radians לשנייה חושף את המאפיינים דמויי מוצק.

בדרך כלל לא צריך להיות מוצלב של אחסון גזירה ומודולי אובדן שנצפו בתדרים נמוכים עבור ניסוחים נוקשים יותר, בעוד אירועי קרוסאובר ניתן לצפות ניסוחים הידרוג'ל חלש. שינוי תכולת הפולימר של הידרוג'ל PNP יכול להיות בעל השפעה ישירה על פיזור המטען באמצעות רשת הפולימר וקצב השחרור מהחומרים. הידרוג'לים של PNP יכולים גם לייצב מטען הרגיש לחוסר יציבות תרמית, להאריך במידה ניכרת את חיי מדף המטען ולצמצם את ההסתמכות על אחסון והפצה של שרשרת קרה.

הכללת מוטיבים של אינטגרין יכולה להיות שימושית להתאמת הידרוג'לים PNP לטיפולים תאיים. תאים שעברו אנקפסולציה יכולים להיות מסומנים בפלורסנטיות כדי להקל על ההדמיה והכימות שלהם. לדוגמה, ניסוחים חסרים אתרי הידבקות יהיה כדאיות תא נמוך כמו תאים encapsulated להיכשל להתרבות לעומת תאים encapsulated וניסוחים עם מוטיבים הידבקות, כגון RGD.

אנו עדיין בוחנים כיצד שינויים בניסוח משפיעים על המאפיינים הריאולוגיים והרשת הדינמית של מטריצת הפולימרים. אנו משתמשים גם FRAP כדי ללמוד את הדיפוזיה של מולקולות בתוך הידרוג'ל. חומרים אלה יכולים לשמש כדי לשאול שאלות ביולוגיות חדשות על איך משלוח מתמשך עשוי להשפיע על אספקת תרופות, פיתוח חיסון או אימונותרפיה של סרטן.