ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

פרוטוקול זה יאפשר שימוש ב-RNA-seq חד-תאי לפנוטיפ ראשוני. וכאשר מזווגים עם ATAC-seq חד-תאי, שחזור של רשתות ויסות גנים. השימוש ב-MULTI-seq שומר על עלויות נמוכות לצורך חקירה ראשונית, ותיקון דגימות מזווגות עבור RNA-seq חד-תאי ו-ATAC-seq חד-תאי מאפשר ניתוח מהלך זמן של רשתות ויסות גנים.

חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי להבין את הרשתות הגנטיות השולטות בהתפתחות המחלה ובהתקדמות המחלה. כדי להתחיל, הוסף 20 מיקרוליטר של פתרון ברקוד עוגן לכל דגימה ופיפטה אותו לערבוב. דגרו אותו על הקרח במשך חמש דקות.

לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטרים של תמיסת עוגן משותף לכל דגימה, ודגרו על קרח במשך חמש דקות נוספות. הוסיפו מיליליטר אחד של 1%BSA ו-PBS קר כקרח לכל דגימה ועשו צנטריפוגה לתאים ב-300 x גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מבלי להפריע את כדור התא.

לאחר מכן הוסיפו 400 מיקרוליטרים של 1% BSA ו-PBS קרים כקרח. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. קבע את ריכוז התאים עבור כל דגימה באמצעות המוציטומטר, וחשב את המספר הכולל של התאים והנפח הדרושים עבור חרוז ג'ל בתחליב או GEM.

שלב את הנפחים המחושבים מכל דגימה בצינור סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר, וקבע את ריכוז התאים הסופי של הדגימות המשולבות. לאחר יצירת GEM וברקוד, בצע ניקוי cDNA של ביטוי גנים באמצעות בחירת גודל, תוך הקפדה שלא להשליך את הסופר-נטנט מסבב הבחירה הראשון, המכיל את הברקוד לדוגמה. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר ואחסנו אותו על קרח.

מערבבים את ריאגנט בחירת גודל החרוז הפאראמגנטי, ומוסיפים 260 מיקרוליטרים של המגיב ו-180 מיקרוליטרים של 100% איזופרופנול לסופרנטנט. מזלטים את התערובת 10 פעמים ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. הנח את הצינור על מתלה מגנטי והמתן עד שהפתרון יתנקה.

לאחר שהפתרון ברור, הסר והשליך את הסופרנטנט. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 80% אתנול לחרוזים למשך 30 שניות, ואז השליכו את הסופרנטנט. חזרו על הפעולה במשך שתי כביסות בסך הכל.

צנטריפוגה קצרה של החרוזים והחזרתם למדף המגנטי. הגדר את הטיימר לשתי דקות. לאחר מכן הסר את האתנול השיורי עם פיפטה P10, ואוויר לייבש את החרוזים על המדף המגנטי במשך שתי הדקות הנותרות.

הסר את החרוזים מהמדף המגנטי והשעה אותם מחדש ב -100 מיקרוליטר של חיץ אלוציה. פיפטה ביסודיות להחייאה, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות, ואז להחזיר את החרוזים למדף המגנטי ולחכות שהפתרון יתנקה. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.

חזור על הניקוי כפי שהודגם, תוך שימוש במחצית הנפח של מאגר אלוציות. עבור הדגימות המיועדות לרצף scATAC, הסר כל נוזל מצינור המיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטה P200, והקפיא את הדגימות בקרח יבש אתנול. כדי לנתק את התאים בדגימות המיועדות לריצוף scRNA, בצע את שלבי הדיסוציאציה באמצעות פפאין, כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט.

צנטריפוגה של התאים ב 300 x גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את כדור התא. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS מקורר, ומערבבים 10 פעמים או עד שהתאים מושעים לחלוטין. שוב, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולחזור על הכביסה עם PBS פעמיים.

התחל מערבולת את הצינור במהירות הנמוכה ביותר והוסף 900 מיקרוליטרים של מתנול מקורר, טיפה אחר טיפה, תוך המשך מערבולת עדינה של הצינור כדי למנוע מהתאים להתגבש. דגירה של התאים על הקרח במשך 15 דקות. לקבוע את הריכוז של תאים קבועים באמצעות hemocytometer, ולהעריך את היעילות של שלב קיבוע באמצעות כחול טריפאן.

אחסן את הרקמה הקפואה והתאים הקבועים במינוס 80 מעלות צלזיוס. ברקוד MULTI sequence מאפשר ריצוף משולב של דגימות מרובות ופירוק חישובי שלהן. ניתן לקבוע את דגימת המקור עבור כל תא בהתבסס על ביטוי הברקוד שלהם.

ניתן לנתח דגימות משולבות אלה כמערך נתונים יחיד למטרות אשכולות תאים וזיהוי סוג תא. מכיוון שכל תא הוא ברקוד לפני יצירת GEM, לכפילויות תאים תהיה סבירות גבוהה להציג ביטוי עבור ברקודים מרובים של רצף MULTI, ולכן ניתן לזהות ולהסיר את רוב הכפילים לפני קיבוץ באשכולות וזיהוי סוג התא. ניתן להשתמש בריצוף ATAC של תא יחיד כדי ליצור מערך נתונים עם סוגי תאים כדי להתאים לאלה שנמצאו על ידי ריצוף RNA חד-תאי.

הזיווג של ביטוי גנים בריצוף RNA חד-תאי ומידע נגישות ל-DNA בריצוף ATAC חד-תאי מאפשר שחזור של רשתות ויסות גנים. כשאתם מנסים את הפרוטוקול, קחו בחשבון שהתזמון בן שתי הדקות של אידוי האתנול הוא קריטי לשליפת רצף בשלבי ההתאדות הבאים. בנייה מחדש של רשתות ויסות גנים באמצעות RNA-seq חד-תאי מזווג ו-ATAC-seq חד-תאי מייצרת מטרות למחקרי ביטוי יתר של גנים ונוקאאוט.

ניתן להשתמש ב-MULTI-seq בשלב זה כדי לזהות השפעות ספציפיות לסוג התא.