ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

פרוטוקול זה משתמש בשתי בדיקות חצי-אטומיות שונות כדי לכמת במהירות את פעילות הלוקומוטור C.elegans במדיום נוזלי, ויש לו פוטנציאל להיות מיושם לבדיקת תרופות במודלים של מחלת C.elegans. היתרונות העיקריים של שתי טכניקות אלה הם קלות השימוש שלהם וקלות הרבייה. לשתי הטכניקות יש פוטנציאל להעריך השפעות סמים על התנהגות תולעת עם תפוקה משתנה.

אלה motility assays שימושיים להערכת הפעילות locomotor של מודלים מחלת מיטוכונדריאלי C.elegans שבו המערכת neuromuscular של בעלי החיים נפגעת. כדי לנתח את פעילות הלוקומוטור C.elegans במדיום נוזלי על שקופיות זכוכית לאחר סנכרון שליטה בתולעים מוטנטיות זנים על לוחות NGM עם ובלי טיפולים תרופתיים עניין לשלב L4, להשתמש בחר תולעת סטריאומיקוסקופ כדי לבחור חמש תולעים לכל זן להתנות לתוך 20 טיפות מיקרוליטר בודדים של פתרון S.basal על שקופית זכוכית. הוסף תולעים מאותו מצב ניסיוני מלוחות NGM שונים טיפות מרובות באותה שקופית כדי להשיג שכפולים טכניים מרובים.

כאשר כל התולעים נאספו, אפשר לבעלי החיים להתאקלם במגלשה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני שהם מתעדים את פעילות השחייה של התולעים בכל טיפה במשך דקה אחת ב-15 פריימים לשנייה לטיפה. כדי לנתח את פעילות הלוקומוטור המוקלטת C.elegans באמצעות תוכנת ZebraLab, השתמש באפשרות ZEBRALAB AVI כדי להעלות קטעי וידאו לתוכנה. לחצו על האפשרות 'כימות עם קבצי AVI'.

כדי ליצור פרוטוקול חדש, בחר פרמטרים, פרמטרי פרוטוקול ושעה והגדר את משך הניסוי לדקה אחת. בחר ללא סל זמן ו בטל את הבחירה בתקופת השילוב בהתאם לפלט הנתונים הרצוי ובחר קובץ ופתח סרט כדי להעלות כל קובץ וידאו שהוקלט בעבר. כדי לבנות אזור יחיד של זיהוי, השתמש בכלי המעגל כדי ליצור אזור סביב טיפת הנוזל כולה שבה ממוקמות התולעים.

פעילותן של כל התולעים באזור שנבחר תתגלה. כדי לציין את המרחק לכיול, צייר קו אופקי משמאל לימין אזור הווידאו ובחר כיול, צייר והחל על קבוצה. כדי לאפשר ניתוח של כל זני תולעת C.elegans השונים, בטל את הבחירה בסמל האזור והתאם את רגישות הזיהוי בסף הפעילות.

כדי להציג באופן חזותי את הרצועות שנעשו על-ידי בעלי החיים בעת ניתוח הפעילות, הגדר את סולם התצוגה ל- 70 ובחר החל על קבוצה. כדי לנתח את סרטוני הווידאו, לחץ על הפעל ובחר התנסה ובצע כדי להזין שם קובץ עבור הווידאו. לאחר השמירה, יופיע חלון השואל אם לנתח את הווידאו במהירות המחשב המרבית.

לחץ על כן. חלון הניסויים הפועלים ייפתח. לחץ על התחל.

לאחר השלמת ניתוח ההקלטה, לחץ על התנסות והפסק כדי לשמור את הפעילות המנותחת בטיפות בגיליון אלקטרוני. כדי לנתח את פעילות הלוקומוטור C.elegans במדיום נוזלי בתבנית צלחת של 96 באר, כאשר התולעים הגיעו לשלב L4, הוסף 50 מיקרוליטרים במשקל של 2% לכל נפח של E.coli OP50 ו- S.basal medium לכל באר של מיקרו-לוח תחתון שטוח 96-well ברור. השתמש בסטריאומיקוסקופ כדי לבחור באופן ידני 15 תולעים מסונכרנות לכל באר של הצלחת 96-well ולאפשר לתולעים להתאקלם במשך 20 דקות.

בסוף תקופת ההסתגלות, השתמש בסורק שטוח סטנדרטי כדי לסרוק כל מיקרו-לוח פעמיים עם פחות מ-10 שניות בין הסריקות כדי לנתח את הסריקות, השתמש בתוכנת קוד פתוח כדי ליישר את שתי הסריקות הרצופות ולרכוש את נתוני שינוי הפיקסל בין שתי התמונות ואת ציון סריקת התולעת היחסית כדי לקבוע את השינויים בתגובת הלוקומוטור בהתבסס על עוצמת האור המיוצרת על-ידי הסורק כאשר הוא מוגדר לפיקסל סף של חמישה. בניתוח זה של פעילות לוקומוטור C.elegans בטיפה אחת של מדיום נוזלי, קומפלקס המיטוכונדריאלי I תולעי המחלה הפגין ירידה משמעותית של 38% בפעילות הלוקומוטורים שלהם בשלב L4 בהשוואה לתולעים מסוג בר. באופן דומה, ניתוח סריקת תולעים של אותן אוכלוסיות הראה ירידה משמעותית בפעילות לוקומוטור עבור תולעי מודל מחלת שלב L4 בהשוואה לתולעים מסוג בר N2 בריסטול.

אובדן פעילות קטר זה נצפה גם ביום מבוגר שלב אחד קומפלקס מיטוכונדריאלי אני תולעים המחלה כפי שהוערך על ידי ניתוח סריקת תולעת. זה חיוני לזכור להשתמש במספר הנכון של תולעים בעת הגדרת כל מעש. בעקבות הליך זה, המעבדה שלנו מבצעת לעתים קרובות הקרנת סמים.

שתי טכניקות אלה משמשות במעבדה שלנו להערכת ההשפעות של תרופות מעניינות על פעילות תולעת במודלים פרה-אקליניים של בעלי חיים של מחלות מיטוכונדריאליות.