שיטות מיקרוסקופיה מרובות זמן לאפיון של Microbubbles פלואורסצנטרית שכותרתו לשחרור תרופות מופעלות אולטרסאונד

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפיין את התגובה של microbubbles שכותרתו פלואורסצנטית המיועדים ליישומי משלוח תרופות המופעלות על ידי אולטרסאונד הכולל את מנגנוני ההפעלה ואת bioeffects. המפתח טמון בשילוב של טכניקות הדמיה המאפשר לנו לפענח את הבעיה הרב-בקנה מידה של משלוח תרופות המופעלות על ידי אולטרסאונד עם בועות, הן בקנה מידה מרחבי שונה והן בסקאלות זמן שונות. להדמיית בועה אחת על ידי מיקרוסקופיית ברייטפילד, הניחו מחט אוורור של 19 מד והשתמשו במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט 19 מד כדי להסיר כמות קטנה של השעיית המיקרו-יבלים מ בקבוקון הזכוכית לצינור קטן להקטרה קלה יותר בשלב הבא.

באמצעות פיפטה, לדלל את פתרון microbubble מלוחים פוספט מסונן. השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי להזריק את המדגם לתוך שקע אחד של מחזיק המדגם עד המחזיק מלא מבלי ליצור בועות אוויר, הזרקת יותר של המדגם במידת הצורך. סגור את שני השסתומים של מחזיק המדגם והצב את מחזיק המדגם בניצב לציר האופטי של המיקרוסקופ.

לפני ניתוח מדגם, להגדיר את תדר נהיגה אולטרסאונד הרצוי ולחץ אקוסטי על מחולל צורת הגל שרירותי והחל עם שדה הראייה בפינה אחת של מחזיק המדגם, להשתמש בשלב XYZ כדי להזיז את המחזיק כדי לאתר microbubbles יחיד בתחום הראייה של המיקרוסקופ, ולאחר מכן לצרף סיב אופטי מחובר לאמבט מים לאור מהבהב ולהתחיל את ההקלטה. חזור על ההדמיה כמה פעמים ככל הרצוי לכל הגדרת אולטרסאונד, העברת מחזיק המדגם לפחות שני מילימטרים לשדה ראייה המכיל microbubbles לא קולי עבור כל ניתוח. להדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של המיקרו-בובלים, לאחר דילול תמיסת המיקרו-חלוקים מלוחים חוצצים של פוספט כפי שהודגם, קבעו את תדר הנהיגה האולטרה-סאונד הרצוי והלחץ האקוסטי על מחולל צורת הגל השרירותי והגדירו את השהיית ההדק ללייזר במחולל עיכוב הדופק לערעור פלואורסצנטי של הננו-חלקיקים מהמיקרו-ביבובים, ואז השתמשו בשלב XYZ כדי להזיז את מחזיק המדגם כדי לאתר מיקרו-חלוקים בודדים ולהביא אותם למוקד של המטרה, ואז הפעל את ההקלטה.

חזור על ההדמיה כרצונך על ידי שינוי הגדרות האולטרסאונד והעברת מחזיק המדגם לשדה הראייה החדש כפי שהודגם. להדמיה באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויאלית, מקם תחילה בעל חיים מחומם על במת מיקום XY בין מדריך הגל למטרה והוסף ג'ל צימוד למדריך הגלים. הכנס צנתר וריד זנב לתוך הווריד האחורי של עכבר נושא גידולים מרדים והכנס את העכבר מצויד בתא חלון לתוך המחזיק המחומם.

מוסיפים טיפת מים לכיסוי. כדי לדמיין את vasculature רקמת הגידול, תוך ורידי להזריק 30 microliters של ארבעה מיליגרם למיליליטר פלואורסצנטרית שכותרתו 2 מגהדלטון dextran לתוך צנתר וריד הזנב ולהשתמש בשלב התרגום XY כדי להזיז את העכבר עד שדה ראייה עם כלי דם מתאימים ניתן לאתר. התאם את קצב הפריימים, שדה הראייה ואורך ההקלטה בהתאם לפרמטרים של הניסוי והקלט תמונות בסיסיות של כלי השיט.

כאשר התמונות הבסיסיות נרכשו, להגדיר את תדר נהיגה אולטרסאונד, אורך הדופק, משרעת לחץ אקוסטי על גנרטור צורת גל שרירותי ולהזריק תוך ורידי 50 microliters של דגימת microbubble לתוך הווריד הזנב. לאחר מכן תצלם את כלי היתווה כפי שהודגם. ניתוח המיקרו-נבלים על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית חושף התפלגות חלקיקים לא אחידה של קליפת המיקרו-יבל.

ניתן לדמיין עוד יותר את המבנה הכולל של המיקרו-יבלים על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. ניתוח הדינמיקה הרדיאלית וההתנהגות הפנומנולוגית של מיקרו-נבל יזום על ידי מיקרוסקופיית ברייטפילד מאפשר הערכת שווי של השינוי היחסי ברדיוס המיקרו-חלוק לאורך זמן. כאן, מוצג רצף תמונה של משלוח מוצלח טיפוסי של חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית.

ניתן להבחין בננו-חלקיקים המוטבעים במעטפת המיקרו-חלוקים לפלורסצ'ה כאשר אור הלייזר מגיע לבועה. כפי שנצפה במשלוח לא מוצלח זה, עם זאת, חלקיקי פלואורסצנטי אור על הקליפה של microbubble, אשר נשאר שלם במהלך החשיפה אולטרסאונד. הדמיה רב-פוטונית תוך-ויאלית יכולה לשמש כדי לקבוע את הפזרנות המרחבית והזמןית של הננו-חלקיקים במהלך חשיפה לאולטרסאונד, אשר יכול להיות מועיל להבנה ואופטימיזציה של המנגנונים הבסיסיים של משלוח ננו-חלקיקים בתיווך אולטרסאונד.

עם היישור המושלם של המסלולים האופטיים והאקוסטיקה בכל סולמות אורך וזמן, תובנה מקיפה על משלוח סמים המופעל על ידי אולטרסאונד מסופקת. התשובות שימסרו הניסויים הרב-קנה המידה שלנו יתורגמו כעת לפרקטיקה קלינית. התוצאות יספקו תובנות חשובות למגוון יישומים טיפוליים, כולל טיפול בסרטן.