ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Scipion מספקת את הכלים ליצירת זרימת העבודה של העיבוד כולו באופן אינטגרטיבי לניתוח חלקיקים יחיד בקריו-EM כדי להשיג שחזור ברזולוציה גבוהה של הדגימה הביולוגית. מסגרת זו מאפשרת ליצור את זרימת העבודה של העיבוד באמצעות מספר חבילות עיבוד תמונה, תוך העדפת יכולת פעולה הדדית, עקיבות, יכולת רבייה ושילוב של מידע המועבר בשיטות שונות ליצירת פלט מדויק יותר. Scipion גדל כל הזמן, כולל שיטות וחבילות חדשות.

יתר על כן, הוא הורחב לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית ומידול אטומי, ומאפשר גם ליצור זרימות עבודה לעיבוד נתונים אלה. כדי ליצור פרוייקט ב- Scipion, לחץ על צור פרוייקט כדי ליצור את הפרוייקט. לייבוא סרטי המיקרוסקופ, בחר ייבוא סרטים.

יופיע חלון חדש. בחלון זה, הזן את הנתיב לנתונים והגדר את מתח המיקרוסקופ ל- 300 קילו-וולט, את הסטייה הכדורית לשני מילימטרים, את משרעת לעומת 0.1, את קצב ההגדלה ל- 50,000, את מצב קצב הדגימה ל- From תמונה ואת גודל הפיקסל ל- 1.34 אנגסטרום. לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, לחץ על ביצוע.

כאשר פעולת השירות מסתיימת, פתח את הכרטיסיה תקציר לחץ על נתח תוצאות. יופיע חלון חדש עם רשימה של הפלטים שנוצרו על-ידי פעולת השירות. כדי להפעיל את שיטת הזרימה האופטית ליישור סרט, פתח את שיטת היישור האופטי xmipp3 ובחר את הסרטים המיובאים כסרטי הקלט והגדר את טווח המסגרות ל- ALIGN מ- 2 ל- 13.

תחת פרמטרים נוספים, הגדר את האפשרות השתמש ביישור הסרט הקודם למסגרות SUM ל- No.השאר את כל האפשרויות האחרות מוגדרות לערכי ברירת המחדל שלהן והבצע את התוכנית. לחץ על נתח תוצאות כדי לבדוק את המיקרוגרפים שהושגו ואת המסלול של המשמרות המשוערות. עבור כל מיקרוגרף, ניתן לבדוק את צפיפות הספקטרלי כוח, את המסלולים המתקבלים כדי ליישר את הסרט הן בקואורדינטות הקרטזיות והן בקואורדינטות הקוטביות, ושם הקובץ של המיקרוגרף המתקבל.

שים לב כי החלקיקים של הדגימה נראים הרבה יותר במיקרוגרף בהשוואה למסגרת אחת של הסרט. לקטיף חלקיקים, פתח את שיטת הקטיף הידנית xmipp3 ובחר את המיקרוגרפים שהושגו בעבר כמיקרוגרפי הקלט. לחץ על ביצוע.

יופיע חלון אינטראקטיבי חדש. בחלון זה, שנה את גודל הפיקסלים ל- 150. המיקרוגרף שנבחר יופיע בחלון גדול יותר.

בחר את כל החלקיקים הנראים בתוך אזור אחד. לאחר שכל החלקיקים נבחרו באופן ידני, לחץ על הפעל אימון כדי להתחיל את הלמידה. האזורים הנותרים של המיקרוגרף ייאספו באופן אוטומטי.

בדוק את החלקיקים שנקטפו. כדי לכלול חלקיק נוסף, לחץ על חלקיק מעניין. כדי להסיר חלקיקים שגויים, החזק את מקש Shift ולחץ על החלקיקים לפי הצורך.

כאשר כל החלקיקים נבחרו באופן אוטומטי, בחר את ארבעת המיקרוגרפים הבאים בזה אחר זה כדי ליצור ערכת הדרכה מייצגת. החלקיקים בכל מיקרוגרף שנבחר ייאספו באופן אוטומטי, ויבדקו כל מיקרוגרף כדי לכלול או להסיר חלקיקים לפי הצורך. כאשר נרכשה ערכת אימונים, לחץ על קואורדינטות כדי לשמור את הקואורדינטות של כל החלקיקים שנבחרו.

לאחר רכישת ערכת האימונים, פתח את הבחירה האוטומטית של xmipp3 כדי לציין את האיסוף הידני הקודם בריצה לקטיף חלקיקים Xmipp והגדיר מיקרוגרפים לבחור כמו בפיקוח. לחץ על בצע כדי ליצור ערכה של כ- 100,000 קואורדינטות. כדי ליישם את גישת הקונצנזוס, פתחו את קטיף המיקרוגרפים המעובדים מראש כמיקרוגרפים של הקלט במודל האיסוף לברירת המחדל.

הגדר את סף הביטחון ל- 0.3 ואת גודל התיבה ל- 150 ולאחר מכן לחץ על בצע. השיטה צריכה גם ליצור סביב 100, 000 קואורדינטות. לאחר מכן, פתח את קונצנזוס xmipp3 וקבע את קואורדינטות הקלט כך שיכללו את הפלט של הבחירה האוטומטית sphire cryolo ו- xmipp3, את סוג הדגם Select להכשרה מראש ואת האימון והניקוד של Skip ישירות עם דגם מאומן מראש ל-Yes ולאחר מכן לחץ על ביצוע.

בסוף הביצוע, לחץ על נתח תוצאות. בחלון החדש, לחץ על סמל העין. חלון חדש שני ייפתח עם רשימה של כל החלקיקים.

ערכי ציון Z בעמודה יתנו תובנה לגבי האיכות של כל חלקיק, שכן ערך נמוך מעיד על איכות ירודה. כדי להזמין את החלקיקים מהציון הגבוה ביותר לנמוך ביותר של Z, לחץ על למידה עמוקה של ציון Xmipp Z ובחר את החלקיקים עם ציון Z גבוה מ- 0.75. לאחר מכן לחץ על קואורדינטות כדי ליצור קבוצת משנה חדשה עם כ- 50,000 קואורדינטות.

כדי לחשב את הרזולוציה באופן מקומי, פתח את xmipp3 Local MonoRes והגדר את עוצמת הקלט לפלט של שלב השיפור האחרון, את האם ברצונך להשתמש בחצי אמצעי אחסון ל-כן ואת טווח הרזולוציה מ- 1 עד 10 אנגסטרום. לאחר הגדרת הפרמטרים, לחץ על ביצוע. לאחר חישוב הרזולוציה, לחצו על 'נתח תוצאות' ובחרו 'הצג היסטוגרמה של רזולוציה' ו'הצג פרוסות צבעוניות'.

הרזולוציה בחלקים השונים של אמצעי האחסון תוצג. רוב voxels של החלקים המרכזיים של המבנים צריך לייצג החלטות סביב שלושה אנגסטרום, בעוד ההחלטות הגרועות ביותר יצפו באזורים החיצוניים של המבנים. היסטוגרמה של ההחלטות לכל ווקסל עם שיא סביב או מתחת לשלוש אנגסטרומים תוצג גם היא.

להחלת חידוד, פתחו את חידוד ה-xmipp3 localdeblur ובחרו את הפלט של שלב השיפור האחרון כמפת קלט, והגדירו את מפת הרזולוציה למפת MonoRes השגה. לאחר ביצוע הפקודה, לחץ פעמיים על ערכת אמצעי האחסון שנוצרו כפלט בכרטיסיה סיכום. ניתן לבדוק את אמצעי האחסון שנוצרו בכל איטרציה.

מומלץ גם לפתוח את עוצמת הקול עם כלים אחרים, כגון כימרה UCSF, כדי לצפות טוב יותר את התכונות של עוצמת הקול בתלת-ממד. באיור זה, ניתן להבחין בקורלציה של מעטפת פורייה של שלושה אנגסטרומים, הקרובה מאוד לגבול הנייקוויסט. כפי שניתן להמחיש, פרוסות הנפח 3D המשוחזרות מציגות רמה גבוהה של פרטים ומבנים מוגדרים היטב.

לאחר ניתוח מקומי, רוב voxels המרכזי להשיג רזולוציה מתחת לשלוש אנגסטרום. האזורים החיצוניים של פרוסות הרזולוציה המקומית מדגימים רזולוציה נמוכה יותר, עם זאת, אשר עולה בקנה אחד עם הטשטוש שנצפו באזורים אלה. לאחר העיבוד, ניתן לראות את התדרים הגבוהים יותר של עוצמת המפה 3D, לחשוף פרטים נוספים ולשפר את הייצוג.

כאשר הרזולוציה שהושגה גבוהה מספיק, אפילו חלק מהחלקים הביוכימיים של המבנה ניתן לראות. אם למבנה המתקבל יש רזולוציה נמוכה, והוא אינו מסוגל להתפתח ליותר, ניתן להבחין בנפח מטושטש עם מתאם מעטפת פורייה נמוך, עקומת רזולוציה והיסטוגרמה של ההערכה המקומית. לאחר הקטיף, ניתן לבדוק את הסיווג הדו-חמצני כדי להעריך את איכות החלקיקים.

לדוגמה, בסיווג זה, החלקיקים רועשים, לא מרכזיים או מצמידים, מה שמצביע על כך שהקטיף היה שגוי. נקודת ביקורת נוספת יכולה להתבצע במהלך הערכת עוצמת הקול הראשונית. בדוגמה זו, נוצרה הערכה שגויה באמצעות התקנה שגויה עבור פעולת השירות.

לאחר הפקת מפה תלת-ממדית ברזולוציה מספקת, השלב הבא הוא להציע מודל אטומי למפה. זה יכול להיעשות בתוך Scipion באמצעות תוספים דוגמנות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשחזר בהצלחה מקרומולקולות ביולוגיות להערכת האינטראקציות המולקולריות שלהם ותפקוד ההרכב הביולוגי כבסיס לעיצוב תרופות.