סינון מקטעים מבוסס NMR במדגם מינימלי אך במצב אוטומציה מקסימלי
4 ביוני 2021
סינון מבוסס מקטעים על ידי NMR הוא שיטה חזקה לזיהוי מהיר של קושרי מולקולות קטנות לביומקרומולקולות (DNA, RNA או חלבונים). מוצגים פרוטוקולים המתארים הכנת דגימות מבוססת אוטומציה, ניסויי NMR ותנאי רכישה ותהליכי עבודה של ניתוח. הטכניקה מאפשרת ניצול אופטימלי של גרעינים פעילים של 1H ו-19F NMR לצורך גילוי.
אנו עורכים מחקרי תהודה מגנטית גרעינית. זה מאפשר לנו לקבוע את המבנים של חלבונים, רנ"א ודנ"א בתמיסה. ביומולקולות אלה הן המרכיבים, הן המרכיבים של התאים שלנו, והפרוטוקולים שאנו מציגים כאן עוסקים בסינון של מולקולות קטנות וקשירתן למטרות אלה.
ממולקולות אלה, הכימיה הרפואית והביולוגיה המבנית שלנו יכולות להפיק תרופות חדשות הנלחמות במחלות. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שיש לנו שליטה מלאה על איכות המטרות המולקולריות, כמו החלבונים, ויש לנו שליטה מלאה על איכות מקטעי המולקולות הקטנות והתרופות, ואנחנו יכולים גם לסנן חלבונים לקשירה של מגוון רחב של זיקות, וזה יתרון בהשוואה למתודולוגיות אחרות. כדי להכין דגימות מסך למדידת NMR, השתמשו ברובוט להכנת דגימות כדי לפזר 768 תרכובות לשמונה צלחות של 96 בארות כדי לקבל 64 תערובות המכילות 12 מקטעים לריכוז סופי של 4.2 מילימולר לתערובת.
העבר את המטרה הביומולקולרית המעניינת, מדוללת במאגר סינון מתאים, למספר המתאים של צינורות מחליפי דגימות NMR בתפוקה גבוהה של שלושה מילימטר ברקוד, והשתמש ברובוט כדי להעביר 10 מיקרוליטר מכל תערובת ליגנד לכל צינור של ביומולקולת המטרה. לאחר מכן, בקש מהרובוט לערבב את הפתרונות ביסודיות. עבור רכישת NMR, טען את הדגימה לתוך הספקטרומטר.
פתח את תוכנת הספקטרומטר, ולאחר מכן, בחר את ערכת הפרמטרים ואת רצפי הפולסים עבור ניסויים מבוססי ליגנד. עבור כל הניסויים המפורטים, בחר פיסול עירור כדיכוי מים. לבדיקת פלואור-19, בחר הן ניסויי 1D והן ניסויי T2.
בחר את הרוחב הספקטרלי ל -220 חלקים למיליון, את תדירות העירור ל -140 חלקים למיליון, ואת זמן הניתוח בין שעה לחמש שעות. עבור T2, זמן CPMG צריך לסירוגין בין 5 ל 100 אלפיות השנייה. הקלט את ניסויי T1r ו- T2.
רשום את הפרש העברת הרוויה כפסאודו דו-ממדי. כדי לעבד את שני ספקטרום 1D יחיד, השתמש בתוכנית AU ProcStd פונקציה, עם או בלי אפשרות הרפיה. WaterLOGSY הוא 1D יחיד כי צריך להיות פאזי עם שלילי עבור אות ממס.
כדי לנתח את נתוני סינון המימן, עקוב אחר ההוראות עבור כלי הסינון מבוסס המקטעים לאחסון נתוני NMR בתהודה מגנטית ביומולקולרית ממסעות סינון, כך שלכל תערובת סינון יש ספרייה משלה שבה תת-ספרייה מכילה את הניסויים השונים שנמדדו על הדגימה. אחסן את ספקטרום הייחוס, עם כל הנתונים שנשמרו מהדגימות ללא המטרה הביומולקולרית, אלא עם התערובות והתרכובת היחידה בספריות שונות. צור נתיב ישיר לספרייה המכילה את הנתונים שנרכשו, ובחר בספריית NMR שבה לכל התערובות צריכה להיות ספרייה נפרדת.
ודא שה- CSV, מסך הפרגמנט, מסמך XML וקבצי BAC מועתקים גם לספריית NMR של הנתונים. כדי להשתמש בכלי סינון מבוסס מקטע עבור דגימה שהוקרנה, גרור את סמל פרויקט הסינון המבוסס על מקטע למרכז חלון הניתוח. הסמל אמור להופיע אם ערכות הנתונים שנשמרו בעבר הועתקו לתוכו.
חלון אפשרויות הסינון המבוסס על מקטע אמור להיפתח אוטומטית. בחר קובץ קוקטייל CSV המכיל את שמות התערובות, את שמות כל קטע ואת החלוקה של כל קטע לתערובות. הגדר תיקיית ספקטרום ליגנד ייחוס עם כל הספקטרום הנמדד של המקטעים הבודדים, והגדר תיקיית ניסוי ריקה של ייחוס, המכילה בדרך כלל את ערכות הנתונים של התערובות ללא היעד הנחקר.
להגדרת צבעי התצוגה של הספקטרום והספקטרום שנחקרו, פתחו את הכרטיסיה 'סוגי ספקטרה' וקבעו את סוג המפרט בהתאם לנתוני התהליך. בכרטיסיה פריסת תצוגה, הגדר את הספקטרום שיושווה בהתאם לסוגי המפרט. לאחר מכן, לחץ על אישור כדי להתחיל את הפרויקט.
בזמן עיבוד הנתונים, ייפתח חלון נפרד עם טבלה המסכמת את כל תערובות הקוקטיילים והליגנדות של כל מיקס. לחץ פעמיים על תא כדי לפתוח את ערכות הנתונים המתאימות. לפני הקצאת קלסרים, ודא שפסגות הייחוס תואמות זו לזו ובעלות אותו שינוי כימי.
אם נצפים הבדלים, פתח את הכרטיסיה תהליך והשתמש באפשרות העיבוד הטורי כדי לתקן אותם. לניתוח הראשון על תערובות פלואור-19, פתח את הכרטיסייה ניתוח ובחר את פונקציית השילוב. ודא שמוגדר אזור אינטגרציה ברור עבור אות פלואור-19 המתאים לכל קטע בתערובת.
שמור אזורי שילוב ייצוא כדי לייצא את קובץ השילוב לשימוש עתידי, ושמור את כל קבצי השילוב המשומשים בספריית ההתקנה המתאימה. עבור נתוני פלואור-19, פתח ערכת נתונים עם או בלי היעד הנחקר, ותחת הכרטיסיה נתח, לחץ על שלב וקרא אזורי שילוב ייבוא כדי לטעון את קובץ השילוב המתאים לספקטרום הנוכחי. לאחר מכן, לחץ על שמור וחזור כדי לאתר רשימה של האזורים המשולבים בכרטיסיה אינטגרלים, והעתק מידע זה לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח במורד הזרם.
המבנה המולקולרי או המבנה המולקולרי של הליגנדות בספריית המקטעים מנותח באמצעות תוכנת ביטחון מולקולרית כפי שהודגם והתוצאות מוצגות כפלט גרפי. צבע כתום מציין שהשבר מפגין חוסר עקביות במבנה או בריכוז. בארות בצבע ירוק מעידות על עקביות השבר.
בניתוח מייצג זה, 103 קטעים המכילים קבוצת פלואור אחת או יותר מהספרייה הפנימית חולקו לחמש תערובות של 20 עד 21 שברים לתערובת. ניסויי הרפיה רוחביים של פלואור-19 נמדדו עבור כל תערובת שהפעילה רכבות דופק CPMG. ערכי סף שימושיים להגדרת קושר, קושר חלש או לא קושר בתערובת, כפי שנצפה בחלבון תיאמין טיפוסי זה טירוזין קינאז A וספקטרום RNA.
בניתוח מייצג זה, פגע אחד הראה ירידה T2 של כ -50% ושינוי כימי גדול או שווה לשישה הרץ. ה- WaterLOGSY לא הראה שינוי משמעותי באות כדי להיספר כחיובי. עם זאת, מכיוון ששניים מתוך שלושה ניסויים היו חיוביים, קטע זה נחשב להיט.
עבור מכה שנייה, T2 הראה ירידה של כ -80% בעוצמת האות. שינוי אות ברור נצפה גם עבור WaterLOGSY. השינוי הכימי לא הספיק בניסוי זה, אך מכיוון ששני הקריטריונים הקודמים היו חיוביים, הוא עדיין נחשב להיט.
המטרה הסופית של שיטות כאלה היא לפתח תרופות חדשות או מעכבי זיקה גבוהה של, למשל, אנזימים, ובכך, הכימיה הרפואית משתלטת ומסנתזת את המולקולות החדשות האלה, אבל ביולוגיה של מבנה, הטכניקות שאתה מיישם כאן יכולות להנחות את הכימיה הרפואית ולהפוך את הגישה הזו להרבה יותר מהירה.
סקירה
מאמר זה מציג שיטה חזקה לסינון מבוסס רסיסים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לזהות קשרים של מולקולות קטנות לביומקרומולקולות. הפרוטוקולים כוללים הכנת דגימות מבוססת אוטומציה, ניסויי NMR ותהליכי זרימה לניתוח, תוך אופטימיזציה של השימוש בגרעינים פעילים של 1H ו-19F NMR.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- תהודה מגנטית גרעינית (NMR)
- כימיה תרופתית
רקע
- מחקרי NMR עוזרים לקבוע את המבנים של חלבונים, RNA ו-DNA בתמיסה.
- הטכניקה מאפשרת סינון של מולקולות קטנות לאיתור קישור לביומולקולות אלו.
- שמירה על שליטה מלאה באיכות המטרות המולקולריות ורסיסי המולקולות הקטנות.
- שיטה זו מאפשרת סינון למגוון רחב של זיקות קישור.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לסינון מולקולות קטנות הקשורות לביומקרומולקולות.
- לספק תהליך עבודה מקיף לסינון רסיסים מבוסס NMR.
- להקל על גילוי תרופות חדשות שנלחמות במחלות.
שיטות ששימשו
- הכנת דגימות מבוססת אוטומציה באמצעות רובוט להפצת תרכובות לצלחות.
- רכישת NMR עם פרמטרים ספציפיים לניסויים מבוססי ליגנד.
- עיבוד נתונים באמצעות תוכנית AU לניתוח ספקטרום NMR.
- אינטגרציה וניתוח של אותות פלואור-19 להערכת קישור.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של קשרים של מולקולות קטנות באמצעות סינון NMR.
- הוכחת יעילות השיטה בניתוח מרובה רסיסים.
- התוצאות הצביעו על זיקות משתנות של רסיסים לביומולקולות היעד.
- פלטים גרפיים סיפקו תובנות לגבי המבנה המולקולרי של הליגנדים.
מסקנות
- שיטת הסינון המבוססת רסיסים יעילה לגילוי תרופות.
- שליטה באיכות הדגימות משפרת את האמינות של התוצאות.
- גישה זו יכולה להיושם על ביומקרומולקולות שונות לפיתוח טיפולי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
NMR-based fragment screening with automation addresses a critical bottleneck in early drug discovery by enabling high-throughput, quantitative detection of small molecule binders to diverse biomacromolecular targets. This approach enhances predictive confidence in hit identification, reduces false positives and negatives, and supports robust portfolio triage at the target validation and lead identification stages. The integration of advanced hardware and software ensures scalable, reproducible workflows essential for enterprise R&D impact.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of target-ligand interactions across proteins and RNA with high sensitivity.
- Supports functional target validation by quantifying binding affinities over a broad dynamic range.
- Reduces mechanistic ambiguity through rigorous quality control of both targets and fragments.
- Facilitates predictive confidence and efficient triage of fragment hits for downstream medicinal chemistry.
Screening & Assay Development
- Automated sample preparation and high-throughput NMR acquisition standardize assay conditions and outputs.
- Delivers reproducible, quantitative readouts for reliable compound evaluation and hit prioritization.
- Enables scalable screening of large, diverse fragment libraries with minimal manual intervention.
- Provides validated data structures and reference spectra for platform reuse and cross-project comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns fragment screening outputs with structural biology and medicinal chemistry for seamless lead optimization.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by ensuring data integrity and traceability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative evidence of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This automated NMR-based screening method integrates at the interface of target validation, lead identification, and early preclinical research, providing a reusable capability for both protein and RNA targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by directly measuring fragment binding to biomacromolecules.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput, and quantitative assay outputs for reliable hit identification.
- Analytics: Provides robust statistical outputs, including T2 relaxation changes and chemical shift thresholds, to compare binding conditions.
- Translational Research: Ensures continuity and data quality for downstream lead optimization and preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated workflow adaptable across multiple targets and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in fragment hit identification.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and advanced data analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by minimizing false positives and negatives.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated fragment hits across diverse target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, fragment library management, and data analysis.
- Demands access to automated sample preparation robots and high-throughput NMR instrumentation.
- Necessitates standardized data structures and cross-team alignment for reproducible workflows.
- Adaptation across protein and RNA targets requires protocol optimization for buffer, pH, and ligand conditions.
- Throughput and scalability are contingent on hardware capacity and software integration.
