הקמה וניצול של מודלים Xenograft נגזר המטופל של גרורות במערכת העצבים המרכזית

גרורות במערכת העצבים המרכזית מודלים PDX מייצגים את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של גרורות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים מצוינים למחקרים פרה-קליניים. מתואר כאן כיצד לבסס מודלים PDX ואת מסלולי החיסון המשמשים בצורה הטובה ביותר למחקרים פרה-קליניים.

הפיתוח של טיפולים חדשניים עבור גרורות CNS כבר מעוכב על ידי היעדר מודלים פרה-קליניים טובים. מודלי xenograft שמקורם במטופל שלנו משחזרים גרורות במערכת העצבים המרכזית טוב יותר מאשר מודלים של קו תאים בשימוש היסטורי. על ידי שימוש במסלולים שונים של חיסון הגידול, אתה יכול לחקור היבטים שונים של מפל גרורתי.

לכל מסלול יש יתרונות שניתן למנף לצורך הלימודים. מי שידגים את ההליך יהיה בן יי טו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. להשתלה תת-עורית של גידולי PDX בהקפאה, יש להפשיר במהירות את רקמת הגידול הקפואה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו אותו בחמישה מיליליטר של DPBS בצלחת תרבית רקמות. לאחר מכן, לאחר אישור הרדמה בעכבר NOG נקבה בת שלושה עד שמונה שבועות, בצע חתך של 0.5 עד סנטימטר אחד בצד שמאל או ימין והכנס חתיכה אחת בגודל 2x2x2 מילימטר מרקמת הגידול עמוק לתוך הכיס. לאחר סגירת החתך, לאפשר לעכבר להתאושש מהרדמה עם ניטור עד שהוא אמבולטורי.

ברגע שהגידול מתחיל לגדול, מדדו את הגידול שלוש פעמים בשבוע עם קליפר. בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, זהה גרורות באמצעות נקרופסי ואשר את נוכחותם של גידולים בתוך איבר המטרה באמצעות ניתוח היסטולוגי. הניחו את הגידול PDX שנכרת ב-DMEM על קרח.

לשטוף את הגידול בחמישה מיליליטר של DPBS בצלחת תרבית רקמות ולהסיר את האזורים הנמק אם יש. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות באורך שניים עד ארבעה מילימטר ומעבירים את החתיכות לצינור המכיל תמיסת דיסוציאציה. באמצעות התוכנית המתאימה על דיסוציאטור, לנתק מכנית את הרקמה ולאמץ את תרחיף התא שנוצר באמצעות מסננת תאים 70 מיקרומטר.

השתמש 20 מיליליטר של DMEM כדי לשטוף את כל התאים שנותרו מן המסננת צנטריפוגה את תרחיף התא מנותק. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים ואת DPBS לספירה ולהתאים את התאים לריכוז של חמש עד 10 פעמים 10 לתאים הרביעי לכל אחד עד שני מיקרוליטר של DPBS. כדי להכין את אזור הניתוח, לגלח את הפרווה על ראש העכבר כדי לחשוף את הקרקפת.

לאחר מכן, מקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית, מאבטח היטב את ראש העכבר באמצעות מוטות אוזניים. הקפד גם לנהל משכך כאבים מתאים. יש לחטא את הקרקפת בשלושה פילינג לסירוגין של פובידון-יוד ו-70% אתנול.

בצע חתך אורכי של חמישה עד שבעה מ"מ כדי לחשוף את הגולגולת ולמשוך את הקרקפת. לגרד את periosteum עם מלקחיים כדי לאתר את bregma. מקם את המחט של המסגרת הסטריאוטקטית על גבי הברגמה ואפס את הקואורדינטות לאפס.

הזיזו את הזרוע מילימטר אחד אחורי ומילימטר אחד לרוחב מימין לקו האמצע, וסמנו מיקום זה בטוש קבוע. לאחר מכן, קדח חור בור קטן בגולגולת במיקום המסומן, תוך הקפדה לא לקדוח לתוך המוח. יש להעמיס לחמישה מיקרוליטר 26 מד מזרק המילטון עם מיקרוליטר אחד עד שניים של תאים ולחבר את המזרק לזרוע הסטריאוטקסית.

להחדיר לאט את המחט שני מילימטרים לתוך המוח ולהתחיל להזריק תאים בקצב הרצוי. לאחר שכל התאים נמסרו, משכו לאט את המחט, מלאו את חור הבור בשעוות עצם וסגרו את החתך. החזירו את העכבר לכלוב עם ניטור עד להחלמה מההרדמה.

לאחר המתת חסד החיה בנקודת הקצה הניסויית המתאימה, לאשר את נוכחותם של גידולים במוח באמצעות ניתוח היסטולוגי. כדי להשתיל גידולי PDX על ידי הזרקה תוך לבבית, הכינו את תאי הגידול כפי שהודגם והניחו את העכבר המושתל המרדם במצב שכיבה. יש לגלח את הפרווה על חזה החיה ולחטא את העור החשוף בפובידון-יוד ובאתנול 70%.

צייר 0.5 עד 10 פעמים 10 לתאי הגידול החמישי ועד 100 מיקרוליטר של DPBS לתוך מזרק מצויד מחט 28 מד. אתר את אתר ההזרקה מעט משמאל לעצם החזה באמצע הדרך בין החריץ של עצם החזה לבין תהליך הקסיפואיד. לאחר מכן, הכנס את המחט אנכית לתוך העכבר באתר ההזרקה.

לאחר שנצפתה זרימה חוזרת, המעידה על כניסה מוצלחת של המחט לחדר השמאלי, שחררו לאט לאט את מתלה הגידול לחדר השמאלי מבלי להזיז את המחט. לאחר שכל התאים נמסרו, לאט ואנכית למשוך את המחט ולהחיל חתיכת גזה סטרילית על אתר ההזרקה במשך כדקה עד הדימום מפסיק. אפשר לעכבר להתאושש על כרית מחוממת עם ניטור עד שהוא אמבולטורי.

בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, זהה גרורות באמצעות נקרופסי ואשר את נוכחותם של גידולים בתוך איבר המטרה באמצעות ניתוח היסטולוגי. למרות ההבדלים במיקרו-סביבה של הגידול, גידולי PDX מדגימים מורפולוגיות דומות המכילות תאים עם גרעינים קטנים וציטופלסמה דלה, ללא קשר לאתר ההשתלה. בניתוח זה, הזרקה תוך-לבבית של תאי מלנומה אנושיים הביאה לגרורות של תאי הגידול למוח העכבר, ואילו הזרקה תוך-לבבית של תאי סרטן ריאה אנושיים גרורות במוח הביאה לגרורות לחלל הבטן ולכבד של העכבר.

פרוטוקולים אלה מאפשרים הקמת מחקרים פרה-קליניים לבדיקת טיפולים ושילובי טיפול חדשים, ויכולים לסייע בחקר תהליכים ביולוגיים וגרורות גידוליות.