בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

Actin הוא המרכיב העיקרי של cytoskeleton ומסדיר באופן ביקורתי מספר היבטים של מורפולוגיה ופיזיולוגיה הסלולר, כולל נוירונים. אקטין מתרחשת בשיווי משקל בין שתי צורותיה, ג'י-אקטין כדורי מונומרי או F-actin סיבי פולימרי. מצב הפולמליזציה של actin מוסדר בקפדנות ברמות מרובות הן על ידי חלבונים מחייבים actin, כמו גם רגולציה שלאחר תרגום משלה.

באנשי הקשר הסינפטיים האינטראורוניים, שינויים דינמיים ברמות ה-F-actin הם אירוע רגולטורי מרכזי, השולט באיתות ובפלסטיות הן במסופים לפני ואחרי הסינפטיים. באופן לא מפתיע, תפקוד לקוי של actin קשור למספר מצבים נוירופתולוגיים. ההתקדמות האחרונה הובילה לשפע של ידע של actin בפיזיולוגיה עצבית ופתופיזיולוגיה.

עם זאת הרבה עדיין לא ידוע וצריך להתמקד בו. בהקשר זה, אנלוגים פלואורסצנטיים של פאלודין הוכיחו להיות כלי מרכזי במחקר actin. פלוטוקסין זה נקשר באופן ספציפי לאקטין סיבי, ולכן יכול לשמש כמדד ישיר לכמויות של F-actin, ושינויו במצבים פתופיזיולוגיים.

מחקר זה מציג מבחנים פלואורומטריים מהירים ויעילים להערכת מצב פולמורציה של אקטין בדגימות ביולוגיות לשעבר של vivo, כגון הומוגנטים סיטונאיים ומסופים סינפטיים מבודדים ביוכימית מרקמות המוח. שימו לב, ניתן להחיל את ההסתעפות על סוגי תאים ורקמות אחרים ועל התופעה הפיזיולוגית הקשורה אליהם. למתכונים של המאגרים המשמשים במחקר זה, עיין בטקסט המפורט.

דגימות רקמת המוח של חולדות או נבדקים אנושיים היו הומוגניזציה בצינור זכוכית פוטר-Elvehjem ועלי על הקרח ב 10 כרכים של חיץ הומוגניזציה. להכנת סינפטוזום, homogenate היה סובב תחילה במהירות איטית ולאחר מכן במהירות גבוהה יותר כדי להשיג שבר מיטוכונדריאלי סינפטוסול גולמי. סינפטוזומים מועשרים מחלק גולמי זה הושגו בעקבות שיפוע סוכרוז לא רציף.

להכנה הסינפטונואורומלית, הומוגנטים הועברו ברצף דרך שני 100 מיקרון ומסנן אחד של 5 מיקרון. הערכת חלבונים בוצעה באמצעות ריאגנט ברדפורד ודגימות היו מדוללות מאגר קרבס בריכוז של שניים עד שלושה מיליגרם לחלבון מ"ל בנפח סופי של 50 microliters. גירוי של סופים סינפטיים מבודדים, סינפטוזומים או סינפטונורוסומים, בוצעו על ידי עלייה קצרה של 30 שניות באשלגן חוץ תאי ב -37 מעלות.

בשביל זה, אשלגן אחד טוחן כלורי התווסף לדגימות לריכוז הסופי של 15 מילימולאר. הומוגנטים הם שברים סינפטיים לא מנומרים ומנוכרים תוקנו עם 2.5% גלוטרלדהיד, על ידי תוספת של הנפח הנדרש של 25% פתרון מניית גלוטרלדהיד. הדגימות דגירו במשך שתיים, שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

קיבוע הוסר על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 G במשך חמש דקות. הדגימות המשיכו לאחר מכן עבור permeabilization על ידי התשה חוזרת במאגר קרבס המכיל 0.1%טריטון X-100 ו 1 מ"ג לכל mL נתרן borohydride במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר. מאגר permeabilization הוסר שוב על ידי צנטריפוגה ואת גלולה נשטף באופן שטחי עם מאגר קרבס resuspended במאגר קרבס המכיל 1X אלקסה פלואור 647 פאלודין, המקביל 500 מיקרו יחידות של פאלודין.

כריכה הורשה להמשיך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. עודף phalloidin מאוגד הוסר מן הדגימות על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 G במשך חמש דקות, ואת כדורי נשטפו באופן שטחי עם מאגר קרבס, ו resuspended שוב מאגר קרבס המכיל 0.32 סוכרוז טוחנת כדי לשמור על הציפה של סינפטוזומים או synaptoneurosomes. דגימות פלואידין פלואידין פלואורסצנטי חולקו בצלחת שחורה 96 גם לקריאה פלואורומטרית בקורא צלחת.

אורכי הגל של העירור והפליטה נקבעו על 645 ננומטר ו-670 ננומטר בהתאמה. עבור כל קבוצה של ניסויים כללנו כמויות שונות של אלקסה פלואור 647 פאלודין במאגר קרבס המכיל 0.32 סוכרוז טוחנת. כדי להסביר את כל ההפסדים של דגימות במהלך שלבי הכביסה, הדגימות הועברו מהשחור לצלחת באר שקוף 96.

לכידת הדגימות נבדקה אז ב-440 ננומטר. שמירה על פאלודין פלואורסצנטי היא פרופורציונלית ישירות לכמות חוטי אקטין או רמות F-actin בדגימות. ליניאריות של כריכת פאלודין נצפתה בטווח של 50 עד 200 חלבוני מיקרוגרם.

כהוכחה לעיקרון, בדקנו גם את היעילות של הבדיקה שלנו במודלים להדחת F-actin באמצעות שיבוש תרופתי של סיבי actin על ידי Latrunculin A, כמו גם גירוי של היווצרות F-actin על ידי גירוי מתווך KCl של מסופים סינפטיים מבודדים. פליטת פלואורסצנטיות מפאלואידין מאוגד יכולה לבוא לידי ביטוי כאחת היחידות של פאלודין מאוגד שנוצר מהעיקול הליניארי הסטנדרטי והן יחסיות לדגימות הבקרה. באיור 4, רמות F-actin מבוטאות כיחידות מיקרו של פאלודין מאוגד.

מצד שני, עבור איור 5 רמות F-actin בקטעים סינפטיים depolarized באים לידי ביטוי ביחס לדגימות בלתי פתורות הפקד. אנו מתארים בדיקה חזקה, חסכונית בזמן וגבוהה לניתוח חוטי אקטין, או F-actin, ושינויים במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים המתאימים לפורמט צלחת של 96 באר. הבדיקה מהירה בהרבה מהפרוטוקולים החלופיים הקיימים ויכולה לשמש ככלי חיוני במחקרים הקשורים לפעולות, לבד או בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה קיימת ומטענים מערביים מבוססי כתמים.