ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הנוירולוגית של ניו זילנד (1835-PG), המועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד (#16-597) והמחלקה לאנטומיה, אוניברסיטת אוטגו, ניו זילנד. אנו חייבים לבנק הרקמות הנוירולוגיות של HCB-IDIBAPS BioBank (ספרד) עבור רקמות המוח האנושי. אנו מודים לג'יאקסיאן ג'אנג על עזרתה בהקלטה ועריכה של הסרטון.

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם לתקנות ועדת האתיקה של אוניברסיטת אוטגו בטיפול ובשימוש בחיות מעבדה (פרוטוקול אתיקה מס'. AUP95/18 ו- AUP80/17) ובית המחוקקים של ניו זילנד. רקמות המוח האנושי התקבלו מהבנק לרקמות נוירולוגיות של בית החולים Clínic-IDIBAPS BioBank בברצלונה, ספרד. כל פרוטוקולי איסוף הרקמות אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים קלניק, ברצלונה, והסכמה מדעת התקבלה מהמשפחות.
1. הכנת מאגרים ריאגנטים
<ol><li>הכן את המאגרים הבאים להומוגניזציה של רקמת המוח והכנת שבר מועשר של מסופים סינפטיים: מאגר הומוגניזציה: 5 מ"מ HEPES, pH 7.4 בתוספת 0.32 M סוכרוז מאגר ההשעיה: 5 מטר טריס, pH 7.4 בתוספת סוכרוז 0.32 M חיץ כביסה: 5 מ"מ טריס, pH 8.1 1.2 מ' סוכרוז 1.0 מ' סוכרוז 0.85 מ' סוכרוז</li>
	<li>הוסיפו תערובת ביתית או מסחרית של מעכבי פרוטאז ופוספטאז. הערה: השתמשנו בגרסה נטולת EDTA של תערובת מעכבי פרוטאז מלאה (טבליה אחת לכל חיץ 10 מ"ל) וקוקטייל מעכבי פוספטאז הרביעי (1:100; נפח: נפח).</li>
	<li>הכן את המאגרים והריאגנטים הבאים עבור הקיבעון, ההחלחלה והאיגוד של הפאלוקדין: מאגר קרבס: 118.5 מ"מ NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.1 מ"מ KH2PO4, 5 מ"מ NaHCO3, 10 מ"מ גלוקוז, 20 מ"מ HEPES, pH 7.4 1 M KCl 25% גלוטרדהיד (פתרון מניות) מאגר קרבס המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 1 מ"ג / מ"ל NaBH4 400x אלקסה פלואור 647 פאלודין ב DMSO מאגר קרבס המכיל סוכרוז 0.32 M 50 מיקרומטר לטרונגולין A ב- DMSO (פתרון מלאי) 1 M KCl (פתרון מניות) התראה: Phalloidin הוא רעיל (LD50 = 2 מ"ג / קילוגרם) ויש לטפל בו בזהירות. שאיפה של גלוטרלדהיד היא רעילה ויש לטפל בה במכסה המנוע של אדים.</li>
	<li>אחסן את המאגרים ב 4 °C (60 °F) ו phalloidin ו latrunculin A ב -20 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך. הערה: אחסון מאגרים לטווח ארוך אינו מומלץ. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>2. הומוגניזציה של רקמת המוח
<ol><li>הומוגניזציה של רקמת מוח החולדה ההקפאה או שזה עתה נותחה בעשרה כרכים של חיץ הומוגניזציה בצינור זכוכית פוטר-Elvehjem ועלי על הקרח. הערה: הומוגניזציה אופטימלית מושגת על ידי 15-20 משיכות של העלי ביד עבור רקמות המוח. הומוגניזציה מוצלחת יכולה להיות מאושרת על ידי זרימה חלקה של ההשעיה דרך צינור הזכוכית. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז החלבון הומוגנט באמצעות מבחני ברדפורד31. הערה: ניתן להשתמש גם במטענים חלופיים תוצרת בית או מסחרית להערכת חלבונים.</li>
	<li>לדלל דגימות הומוגניות מאגר קרבס בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL. הערה: בחלק מהניסויים שלנו, אנו דגירה הומוגנטים עם 2 μM latrunculin A או DMSO (פקדים) ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעות. בשביל זה, homogenates הם resuspended ב 48 μL של מאגר קרבס, ו 2 μL של 50 μM latrunculin A או 2 μL של DMSO מתווסף. עוד יותר עבור immunoblotting, כמות קטנה של מדגם (10 מיקרוגרם) נאסף לאחר הדגירה.</li>
	<li>תקן את הדגימות ההומוגניות (סעיף 5).</li>
</ol>3. הכנת מסופי עצבים מבודדים
<ol><li>הכנת סינפטוזומים הערה: ניתן להשתמש גם בפרוטוקולים חלופיים32,33 עבור סינפטוזומים.<ol>
<li>המוח צנטריפוגה הומוגנית ב 1,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>השלך את גלולה, שהוא השבר הגרעיני הגולמי.</li>
		<li>צנטריפוגה נוספת supernatant (S1) הושג בשלב 3.1.1 ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (69 °F).</li>
		<li>הסר את supernatant (S2), שהוא שבר ציטוזולי מסיס.</li>
		<li>Resuspend גלולה (P2) שהושג בשלב 3.1.3, המהווה את השבר הסינפטוזולמי הגולמי במאגר resuspension. הערה: נפח מאגר ההשעיה תלוי בכמות הרקמה ההתחלתית ובכמות גלולה המתקבלת. לדוגמה, כאשר מתחילים עם 150-300 מ ג של רקמות המוח, גלולה המתקבל ניתן להשהות ב 200 μL של מאגר ההשעיה.</li>
		<li>טען את הסינפטוזומים הגולמיים שהושקעו מחדש על שיפוע סוכרוז לא רציף העשוי מנפחים שווים של 0.85-1.0-1.2 M סוכרוז. הערה: בדרך כלל אנו משתמשים 1 מ"ל כל פתרון סוכרוז (עבור 150-300 רקמת מ"ג). זה יכול להיות שונה על פי כמויות רקמה גדולות יותר. מעברי צבע רציפים יכולים להתבצע באמצעות מזרק 25G לחוץ על הקיר הפנימי של צינור ultracentrifuge ושכבות עדינות של שכבות סוכרוז.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 85,000 x גרם עבור 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: בגלל המהירות הגבוהה של צנטריפוגה, ultracentrifuge מסוגל ליצור ואקום כדי להפחית את החימום נדרש.</li>
		<li>לאסוף את השבר הסינפטוזומלי בממשק בין 1.0 ו 1.2 M סוכרוז באמצעות קצה צינור μL 200.</li>
		<li>לשטוף את השבר הסינפטומלי עם חיץ כביסה קר כקרח על ידי צנטריפוגה ב 18,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: לשטיפה, שבר סינפטוזומלי המתקבל בממשק של 1.0 ו 1.2 M סוכרוז נאסף בצינור טרי 1.5 מ"ל, ונפח שווה של חיץ כביסה מתווסף, הבטחת הסרת סוכרוז גבוה מהבינוני.</li>
		<li>לשטוף את גלולה סינפטוזומלית שוב עם חיץ הומוגניזציה קר כקרח ב 12,000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>התחדשו בסינפטוזומים במאגר הומוגניזציה על קרח. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן.</li>
		<li>לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות מבחני ברדפורד.</li>
		<li>Resuspend הסינפטוזומים במאגר קרבס בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL (47.5 μL אם סינפטוזומים הם להיות depolarized על ידי KCl; ראה סעיף 4). הערה: עבור ההשעיה מחדש, השבר הסינפטוזולי מסתובב לראשונה ב- 12,000 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C (60 °F) וה- supernatant (חיץ) מוסר. גלולה סינפטוזומלית הוא לאחר מכן resuspended במאגר קרבס על ידי צינור עדין באמצעות קצה צינור 200 μL.</li>
		<li>המשך עם דה-פולריזציה (סעיף 4).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת סינפטונורוסומים הערה: פרוטוקולים חלופיים34,35 עבור synaptoneurosomes ניתן להשתמש גם.<ol>
<li>מעבירים את המוח הומוגנית דרך מסנן רשת רטוב מראש של גודל נקבובית 100 מיקרומטר במחזיק מסנן באמצעות מזרק 1 מ"ל. הערה: הרטבה מראש של כל המסננים חשובה כדי למנוע אובדן מדגם ויש לעשות זאת באמצעות מאגר הומוגניזציה. לצורך כך, מאגר הומוגניזציה מועבר דרך המסננים במחזיק המסנן באמצעות מזרק של 1 מ"ל עד שהמאגר זורם החוצה.</li>
		<li>לאסוף את הסינון (F1) בצינור מראש מצונן 1.5 מ"ל על קרח.</li>
		<li>חזור על התהליך (שלבים 3.2.1 ו- 3.2.2) עבור שבר F1 כדי להשיג את הסינון השני (F2).</li>
		<li>להעביר F2 filtrate דרך מסנן נטו של גודל נקבובית 5 מיקרומטר.</li>
		<li>לאסוף את הסינון (F3) בצינור מראש מצונן 1.5 מ"ל על קרח.</li>
		<li>צנטריפוגה סינון F3 ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>Resuspend גלולה (synaptoneurosomes) במאגר קרבס על קרח בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL (47.5 μL אם סינפטוזומים הם להיות depolarized על ידי KCl; ראה סעיף 4). הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן.</li>
		<li>להעריך את ריכוז החלבון באמצעות מבחני ברדפורד.</li>
		<li>המשך עם דה-פולריזציה (סעיף 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. דה-פולריזציה בתיווך KCl של מסופים סינפטיים מבודדים
<ol><li>סינפטוזומים/סינפטונוסומים שווים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.</li>
	<li>לעורר סינפטוזומים / synaptoneurosomes על ידי הוספת KCl כדי להגדיל K חוץ תאי+ ל 50 מ"מ עבור 30 s ב 37 °C (69 °F) ולהוסיף נפח שווה של מאגר קרבס ערכת הבקרה unstimulated בהתאמה. הערה: לדוגמה, להוסיף 2.5 μL של 1 M KCl כדי סינפטוזומים resuspended ב 47.5 μL של מאגר קרבס; ולהוסיף 2.5 μL של מאגר קרבס לסינפטוזום בקרת unstimulated בהתאמה. לניסויים שבהם מספר רב של דגימות מעורבות, להמשיך עם לא יותר מ 2 דגימות בכל פעם, כך זמן depolarization לא יעלה על 30 s.</li>
	<li>לסיים את הגירוי על ידי הוספת גלוטרלדהיד (סעיף 5).</li>
</ol>5. קיבוע וכתמי פאלודין של דגימות
<ol><li>הוסף גלוטרלדהיד לדגימות הומוגניות/סינפטוסומליות/סינפטונוסומליות לריכוז סופי של 2.5% למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: הוספנו 6 μL של 25% פתרון glutaraldehyde כך הריכוז הסופי של glutaraldehyde ב 50 דגימות μL (הומוגנטים / סינפטוזומים / synaptoneurosomes) היה ca. 2.5%. קיבוע הוא קריטי צריך להיות מהיר ולכן מיד לאחר הוספת glutaraldehyde, המדגם צריך להיות מערבולת נמרצת.</li>
	<li>משקעים את הדגימות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את העל-טבעי. הערה: להשליך את supernatant במכסה המנוע אדים כמו glutaraldehyde רעיל.</li>
	<li>לחלחל גלולה על ידי ההשעיה ב 100 μL של מאגר קרבס המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 1 מ"ג / מ"ל NaHB4 עבור 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>משקעים את הדגימות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את מאגר החימול.</li>
	<li>לשטוף את גלולה עם 200 μL של מאגר קרבס על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>Resuspend ולהכתים את גלולה עם 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (המתאים 500 μU) ב 100 μL של מאגר קרבס במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. הערה: זנים אחרים של אנלוגים פאלודין פלואורסצנטי זמינים מסחרית וניתן להחליף אותם במהלך ההסתעפות. ריכוז של פאלודין ואת נפח המדגם הכולל של הדגירה ייתכן שיהיה שונה בהתאם לכמות וסוג של רקמה / מדגם נבדק תנאים אופטימליים צריך להיות סטנדרטי בהתאם.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות מוכתמות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את הפאלוקדין הבלתי מאוגד (על-טבעי).</li>
	<li>לשטוף את המדגם עם 200 μL של מאגר קרבס על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>Resuspend ב 200 μL של מאגר קרבס המכיל 0.32 M סוכרוז. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן.</li>
</ol>6. ניתוח פלואורומטרי ופיזור אור
<ol><li>לוותר על אלקסה פלואור 647 דגימות מוכתמות פאלודין בצלחת שחורה 96-באר.</li>
	<li>למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באורך גל עירור של 645 ננומטר ואורך גל פליטה של 670 ננומטר בקורא צלחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מעבירים את הדגימות מהצלחת השחורה של 96 באר לצלחת ה-96 באר השקופה באמצעות 200 טיפים לצינור μL.</li>
	<li>למדוד את פיזור האור ב 540 ננומטר כדי לתקן עבור כל ההפסדים שעלולים להתרחש במהלך השלבים הקודמים של קיבעון, חדירה וכתמים. הערה: וריאציות בחומר ביולוגי שנשמר בדגימות המוכתמות עשויות להיות בולטות יותר עבור כמויות קטנות יותר של חומר התחלתי (ראה דיון).</li>
	<li>כלול קבוצה של אלקסה פלואור 647 פאלודין במאגר קרבס בריכוזים שונים (0.05x, 0.1x, 0.25x, 0.35x, 0.75x, 0.5x ו 1x המתאימים 25, 50, 125, 175, 250, 375 ו 500 μU) עבור כל אצווה של ההסתערות כעקומה סטנדרטית. הערה: זהו שלב אופציונלי ואינו משפיע על תוצאות הבדיקה במיוחד כאשר רמות F-actin באות לידי ביטוי באופן יחסי (סעיף 7). ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>כמות F-actin בדגימות היא פרופורציונלית ישירות לעוצמת הפלואורסצנטיות של פאלודין מאוגד. אקספרס במונחים מוחלטים של יחידות של פאלודין מאוגד מחושב מן העקומה הליניארית של תקן פאלודין מתויג. הערה: כדוגמה, ראו איורים 2A-B, 3A, 4A-B ואיור משלים 2.</li>
	<li>רמות F-actin אקספרס כשבר של דגימות הבקרה. הערה: כדוגמה, ראה איורים 5A-B.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההסתייגות המתוארת כאן, המותאמת למעשה ממחקר קודם30 עם שינויים, מעסיקה פלוטוקסין, פאלודין מתויג עם תווית פלואורסצנטית. אנלוגים פאלודין פלואורסצנטי נחשבים תקן הזהב עבור כתמי סיבי actin ברקמות קבועות47,48,49. למעשה, הם הכלים העתיקים ביותר לזהות באופן ספציפי סיבי actin50 ועדיין להישאר המכשירים הנפוצים ביותר כדי לזהות סיבי actin במיוחד עבור ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי הבאים. ח...

אקטין חלבון Cytoskeletal מעורב בפונקציות תאיות מרובות, כולל תמיכה מבנית, תחבורה סלולרית, תנועתיות תאים וחלוקה. אקטין מתרחשת בשיווי משקל בשתי צורות: אקטין כדורי מונומרי (G-actin) ואקטין סיבי פולימרי (F-actin). שינויים מהירים במצב הפילמור של actin (בין צורות G ו- F) לגרום הרכבה חוט מהיר ופירוק ביסוד תפקידיה הרגולטוריים בפיזיולוגיה התאית. Actin מהווה את המרכיב העיקרי של המבנה cytoskeletal העצבי ומשפיע על מגוון רחב של פונקציות עצביות1,2. יש לציין כי האקטין ציטוסקלטון מהווה חלק בלתי נפרד מהפלטפורמה המבנית של המסופים הסינפטיים. ככזה, הוא דטרמיננטה מרכזית של מורפוגנזה סינפטית ופיזיולוגיה וממלא תפקיד בסיסי בשליטה על הגודל, המספר והמורפולוגיה של הסינפסות3,4,5. בפרט, דינאמי actin polymerization-depolymerization הוא דטרמיננטה מפתח של שיפוץ סינפטי הקשורים פלסטיות סינפטית שבבסיס תהליכי הזיכרון והלמידה. ואכן, הן presynaptic (כגון שחרור נוירוטרנסמיטר6,7,8,9,10) ו פונקציות postsynaptic (פלסטיות הקשורות שיפוץ דינמי11,12,13,14) להסתמך באופן ביקורתי על שינויים דינמיים במצב פולמור של cytoskeleton actin.
בתנאים פיזיולוגיים, רמות F-actin מוסדר באופן דינמי והדוק באמצעות מסלול רב-מודאלי מעורבים שינוי posttranslational4,15,16, כמו גם חלבונים מחייבים actin (ABPs)4,17. ABPs יכול להשפיע על דינמיקה actin ברמות מרובות (כגון ייזום או עיכוב פילמור, גרימת הסתעפות חוטים, ניתוק חוטים לחתיכות קטנות יותר, קידום depolymerization, והגנה מפני דפולימריזציה), והם בתורו תחת שליטה מודולטורית מחמירה רגיש לאותות חוץ תאיים שונים18,19,20. בדיקות רגולטוריות כאלה ברמות מרובות מכתיבות רגולציה קפדנית של דינמיקה actin ב cytoskeleton סינפטית, כוונון עדין מראש ופוסט-סינפטי היבטים של פיזיולוגיה עצבית הן במצב הבסיסי והן במצבים הנגרמים על ידי פעילות.
בהתחשב בתפקידים החשובים של actin בפיזיולוגיה העצבית, אין זה מפתיע כי מספר מחקרים סיפקו ראיות לשינויים בדינמיקה actin כמו אירועים פתוגניים קריטיים הקשורים למגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות כולל ניוון עצבי, מחלות פסיכולוגיות, כמו גם מחלות נוירו-התפתחותיות3,21,22,23,24,25,26,27. למרות שפע של נתוני מחקר המצביעים על תפקידי מפתח של actin בפיזיולוגיה עצבית ופתופיזיולוגיה, עם זאת, פערים משמעותיים עדיין נשארים בהבנת הדינמיקה actin, במיוחד על cytoskeleton סינפטית. דרושים מחקרים נוספים כדי להבין טוב יותר את האקטין העצבי ואת השינויים שלו בתנאים פתולוגיים. תחום מרכזי אחד של מיקוד בהקשר זה הוא הערכת מצב פולמור actin. יש ערכות מסחריות מערביות מבוססות סופג (G-Actin / F-Actin בערכה ביוכימית vivo assay; Cytoskeleton SKU BK03728,29) ו מבחנים תוצרת בית להערכת רמות F-actin6. עם זאת, מכיוון שאלה דורשים בידוד ביוכימי של F-actin ו- G-actin ומכיוון שהכימות הבא שלהם מבוסס על פרוטוקולים immunoblotting, הם יכולים להיות זמן רב. אנו מדווחים בזאת על בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית שהותאמה ממחקר קודם30 עם שינויים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך הן את רמות הבסיס של F-actin, כמו גם שינויים דינמיים בפירוק ההרכבה שלה. יש לציין כי שינינו ביעילות את הפרוטוקול המקורי הדורש דגימות המתאימות ל- 1 מ"ל cuvette לפורמט הלוח הנוכחי של 96 באר. הפרוטוקול שהשתנה ולכן הפחית באופן משמעותי את כמות הרקמה / מדגם הנדרש עבור ההסתעפות. כמו כן, אנו מספקים ראיות כי הפרוטוקול מתאים לא רק רקמת המוח הומוגנטים, אלא גם שברים תת תאיים כגון מסופים סינפטיים מבודדים (סינפטוזומים סינפטונוזומים). לבסוף, ניתן להשתמש במד"א עבור רקמות מוח של מכרסמים שזה עתה נותחו ודגימות מוח אנושיות מאוחסנות לטווח ארוך לאחר המוות. יש לציין, בעוד ההסתעפות מוצגת בהקשר עצבי, זה יכול להיות מורחב כראוי לסוגי תאים אחרים ותהליכים פיזיולוגיים הקשורים אליהם.

<table><tbody><tr><td>3.5 מ"ל, צינור פוליקרבונט בעל דופן עבה פתוחה</td><td>בקמן קולטר</td><td>349622</td><td>לצנטריפוגה שיפוע (הכנת סינפטוזום)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>F-actin ספציפי ליגנד</td></tr><tr><td>נוגדן נגד &nbsp; b-actin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>להערכת רמות האקטין הכוללות על ידי נוגדן אימונובלוטינג</td></tr><tr><td>נגד GAPDH Abcam</td><td></td><td>Ab181602</td><td>להערכת רמות GAPDH על ידי אימונובלוטינג</td></tr><tr><td>תרכיז מגיב צבע לבדיקת חלבון Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>הערכת חלבון מבוססת ברדפורד</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>רכיב חיץ קרבס</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, מעכב פרוטאז ללא EDTA קוקטייל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>4693159001</td><td>לעיכוב פעילות פרוטאז אנדוגנית במהלך הכנת הדגימה</td></tr><tr><td>קורנינג 96-בארות שקוף שטוח פוליסטירן תחתון</td><td>3596</td><td>למדידות פיזור אור</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Krebs רכיב חיץ</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>ממס לפאלודין ולטרונקולין</td></tr><tr><td>סורק שטוח פלואורסצנטי (סורק אינפרא אדום אודיסיאה)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>לזיהוי אותות אימונוריאקטיביים</td><td></td> על אימונו-בלוטים</tr><tr><td>תמיסת גלוטרלדהיד (25% במים)</td><td>קיבוע</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6257</td> דרגה II</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>מרכיב חיץ להכנת דגימה ורכיב חיץ קרבס</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>Depolymerizer של חוטי אקטין</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Krebs רכיב חיץ</td></tr><tr><td>Microplates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן ממברנה Mitex 5 מ"מ</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>הכנת סינפטונוירוזומים</td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell צלחת שחורה</td><td>תרמו פישר 237105 מדעי</td><td></td><td>למדידות פלואורומטריות</td></tr><tr><td>מסנן רשת ניילון 100 מ"מ</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>הכנת סינפטונוירוזומים</td></tr><tr><td>מעכב פוספטאז קוקטייל IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>לעיכוב פעילות פוספטאז אנדוגנית במהלך הכנת הדגימה</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9541</td><td>רכיב חיץ קרבס ולדפולריזציה של מסופים סינפטיים</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי ((KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>רכיב חיץ קרבס</td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>רכיב של מאגר פרמיביליזציה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>רכיב חיץ קרבס</td></tr><tr><td>נתרן מימן פחמתי (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL900</td><td>רכיב חיץ קרבס</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>התקנים</td><td></td> מולקולריים <td>למדידות פלואורומטריות</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר כימי</td><td>S/8600/60</td><td>מרכיב חיץ להכנת דגימה</td></tr><tr><td>מחזיק מסנן Swimnex</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>הכנת סינפטונוירוזומים</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות 5 מ"ל פוטר-אלבהיים</td><td>דוראן ויטון קימבל</td><td>358034</td><td>להומוגניזציה של רקמות</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>רכיב של מאגר פרמיביליזציה</td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>מרכיב חיץ להכנת דגימה</td></tr></tbody></table>

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, המרכיב העיקרי של cytoskeleton, ממלא תפקיד קריטי בשמירה על המבנה והתפקוד העצבי. תחת מצבים פיזיולוגיים, actin מתרחשת בשיווי משקל בשתי צורותיה: כדורית מונומרית (G-actin) וסיבים פולימריים (F- actin). במסופים הסינפטיים, actin cytoskeleton מהווה את הבסיס לפונקציות קריטיות לפני ואחרי סינפטית. יתר על כן, שינויים דינמיים במצב פילמור actin (אינטרקוונהפיכה בין צורות כדוריות חוטית של actin) קשורים קשר הדוק לשינויים הקשורים פלסטיות במבנה ובתפקוד סינפטי. אנו מדווחים כאן על מתודולוגיה מבוססת פלואורסצנטיות שונה כדי להעריך את מצב הפולמליזציה של actin בתנאי ex vivo. ה-assay משתמש בפאלואידין בעל תווית פלואורסצנטית, פלוטוקסין שנקשר במיוחד לסיבי אקטין (F-actin), ומספק מידה ישירה של אקטין סיבי פולימרי. כהוכחה לעיקרון, אנו מספקים ראיות להתאמת ההסתעפות של ההסתעפות הן ברקמת המוח האנושית מכרסמים והן בהומוגנטים שלאחר המוות. באמצעות latrunculin A (תרופה depolymerizes סיבי actin), אנו מאשרים את התועלת של ההסתערות בניטור שינויים ברמות F-actin. כמו כן, אנו מרחיבים את ההסמכה לשברים ביוכימיים של מסופי סינפטית מבודדים שבהם אנו מאשרים פולמריזציה actin מוגברת על ידי גירוי על ידי דפולריזציה עם K חוץ תאי גבוה+.

ליניאריות של ההסתעפות להערכת רמות F-actin ראשית, נקבעה עקומה סטנדרטית לעלייה הליניארית בפלואורסצנטיות של אלקסה פלואור 647 פאלודין וחזרה על עצמה בכל קבוצת ניסויים(איור 1). כדי לחקור את הטווח הליניארי של ההסתעפות, עובדו כמויות שונות של הומוגנטים במוח ממכרסמים (איורים 2A ו-2B)ונבדקים אנושיים שלאחר המוות (איור 3A ו-3B). ההסתייגות נמצאה ליניארית בטווח של 50-200 מיקרוגרם חלבון כפי שהוערך על ידי כמ...

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Actin הוא המרכיב העיקרי של cytoskeleton ומסדיר באופן ביקורתי מספר היבטים של מורפולוגיה ופיזיולוגיה הסלולר, כולל נוירונים. אקטין מתרחשת בשיווי משקל בין שתי צורותיה, ג'י-אקטין כדורי מונומרי או F-actin סיבי פולימרי. מצב הפולמליזציה של actin מוסדר בקפדנות ברמות מרובות הן על ידי חלבונים מחייבים actin, כמו גם רגולציה שלאחר תרגום משלה.באנשי הקשר הסינפטיים האינטראורוניים, שינויים דינמיים ברמות ה-F-actin הם אירוע רגולטורי מרכזי, השולט באיתות ובפלסטיות הן במסופים לפני ואחרי הסינפטיים. באופן לא מפתיע, תפקוד לקוי של actin קשור למספר מצבים נוירופתולוגיים. ההתקדמות האחרונה הובילה לשפע של ידע של actin בפיזיולוגיה עצבית ופתופיזיולוגיה.עם זאת הרבה עדיין לא ידוע וצריך להתמקד בו. בהקשר זה, אנלוגים פלואורסצנטיים של פאלודין הוכיחו להיות כלי מרכזי במחקר actin. פלוטוקסין זה נקשר באופן ספציפי לאקטין סיבי, ולכן יכול לשמש כמדד ישיר לכמויות של F-actin, ושינויו במצבים פתופיזיולוגיים.מחקר זה מציג מבחנים פלואורומטריים מהירים ויעילים להערכת מצב פולמורציה של אקטין בדגימות ביולוגיות לשעבר של vivo, כגון הומוגנטים סיטונאיים ומסופים סינפטיים מבודדים ביוכימית מרקמות המוח. שימו לב, ניתן להחיל את ההסתעפות על סוגי תאים ורקמות אחרים ועל התופעה הפיזיולוגית הקשורה אליהם. למתכונים של המאגרים המשמשים במחקר זה, עיין בטקסט המפורט.דגימות רקמת המוח של חולדות או נבדקים אנושיים היו הומוגניזציה בצינור זכוכית פוטר-Elvehjem ועלי על הקרח ב 10 כרכים של חיץ הומוגניזציה. להכנת סינפטוזום, homogenate היה סובב תחילה במהירות איטית ולאחר מכן במהירות גבוהה יותר כדי להשיג שבר מיטוכונדריאלי סינפטוסול גולמי. סינפטוזומים מועשרים מחלק גולמי זה הושגו בעקבות שיפוע סוכרוז לא רציף.להכנה הסינפטונואורומלית, הומוגנטים הועברו ברצף דרך שני 100 מיקרון ומסנן אחד של 5 מיקרון. הערכת חלבונים בוצעה באמצעות ריאגנט ברדפורד ודגימות היו מדוללות מאגר קרבס בריכוז של שניים עד שלושה מיליגרם לחלבון מ"ל בנפח סופי של 50 microliters. גירוי של סופים סינפטיים מבודדים, סינפטוזומים או סינפטונורוסומים, בוצעו על ידי עלייה קצרה של 30 שניות באשלגן חוץ תאי ב -37 מעלות.בשביל זה, אשלגן אחד טוחן כלורי התווסף לדגימות לריכוז הסופי של 15 מילימולאר. הומוגנטים הם שברים סינפטיים לא מנומרים ומנוכרים תוקנו עם 2.5% גלוטרלדהיד, על ידי תוספת של הנפח הנדרש של 25% פתרון מניית גלוטרלדהיד. הדגימות דגירו במשך שתיים, שלוש דקות בטמפרטורת החדר.קיבוע הוסר על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 G במשך חמש דקות. הדגימות המשיכו לאחר מכן עבור permeabilization על ידי התשה חוזרת במאגר קרבס המכיל 0.1%טריטון X-100 ו 1 מ"ג לכל mL נתרן borohydride במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר. מאגר permeabilization הוסר שוב על ידי צנטריפוגה ואת גלולה נשטף באופן שטחי עם מאגר קרבס resuspended במאגר קרבס המכיל 1X אלקסה פלואור 647 פאלודין, המקביל 500 מיקרו יחידות של פאלודין.כריכה הורשה להמשיך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. עודף phalloidin מאוגד הוסר מן הדגימות על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 G במשך חמש דקות, ואת כדורי נשטפו באופן שטחי עם מאגר קרבס, ו resuspended שוב מאגר קרבס המכיל 0.32 סוכרוז טוחנת כדי לשמור על הציפה של סינפטוזומים או synaptoneurosomes. דגימות פלואידין פלואידין פלואורסצנטי חולקו בצלחת שחורה 96 גם לקריאה פלואורומטרית בקורא צלחת.אורכי הגל של העירור והפליטה נקבעו על 645 ננומטר ו-670 ננומטר בהתאמה. עבור כל קבוצה של ניסויים כללנו כמויות שונות של אלקסה פלואור 647 פאלודין במאגר קרבס המכיל 0.32 סוכרוז טוחנת. כדי להסביר את כל ההפסדים של דגימות במהלך שלבי הכביסה, הדגימות הועברו מהשחור לצלחת באר שקוף 96.לכידת הדגימות נבדקה אז ב-440 ננומטר. שמירה על פאלודין פלואורסצנטי היא פרופורציונלית ישירות לכמות חוטי אקטין או רמות F-actin בדגימות. ליניאריות של כריכת פאלודין נצפתה בטווח של 50 עד 200 חלבוני מיקרוגרם.כהוכחה לעיקרון, בדקנו גם את היעילות של הבדיקה שלנו במודלים להדחת F-actin באמצעות שיבוש תרופתי של סיבי actin על ידי Latrunculin A, כמו גם גירוי של היווצרות F-actin על ידי גירוי מתווך KCl של מסופים סינפטיים מבודדים. פליטת פלואורסצנטיות מפאלואידין מאוגד יכולה לבוא לידי ביטוי כאחת היחידות של פאלודין מאוגד שנוצר מהעיקול הליניארי הסטנדרטי והן יחסיות לדגימות הבקרה. באיור 4, רמות F-actin מבוטאות כיחידות מיקרו של פאלודין מאוגד.מצד שני, עבור איור 5 רמות F-actin בקטעים סינפטיים depolarized באים לידי ביטוי ביחס לדגימות בלתי פתורות הפקד. אנו מתארים בדיקה חזקה, חסכונית בזמן וגבוהה לניתוח חוטי אקטין, או F-actin, ושינויים במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים המתאימים לפורמט צלחת של 96 באר. הבדיקה מהירה בהרבה מהפרוטוקולים החלופיים הקיימים ויכולה לשמש ככלי חיוני במחקרים הקשורים לפעולות, לבד או בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה קיימת ומטענים מערביים מבוססי כתמים.

a-time-efficient-fluorescence-spectroscopy-based-assay-for-evaluating

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את ההליך להכתמה פלואורסצנטית של נוירונים בקליפת המוח של חולדה עבור מיקרוסקופיה. הוא מכוון לחלבונים מסוג F-actin וחלבונים דנדריטיים כדי לנתח שלמות מבנית ולחשב צפיפות F-actin, שהיא חיונית לחקר תפקוד עצבי ובריאות.

כימות של אקטין פונקטה נימה בתאי עצב קליפת המוח של חולדה

אקטין חוטי (F-actin) ממלא תפקיד חשוב בספינוגנזה, פלסטיות סינפטית ויציבות סינפטית. כימות של F-actin puncta הוא אפוא כלי שימושי לחקר שלמותם של מבנים סינפטיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים של כימות פונקטה F-actin המסומנת עם Phalloidin בתרביות עצביות קליפת המוח הראשוניות בצפיפות נמוכה.

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

הציגו כאן היא שיטת צינור רולר ששונה culturing, לסירוגין דימות ברזולוציה של המוח מכרסמים פרוסות בשבועות רבים עם שינוי מיקום מדויק על photoetched coverslips. הכדאיות עצביים, מורפולוגיה פרוסה מתוחזקים היטב. יישומים של השיטה במלואו סגור באמצעות וירוסים עבור ביטוי מסוים סוג התא הינם מסופקים.

רולר ששונתה שיטת צינור לדימות לסירוגין במדויק לשפות אחרות וחוזר על עצמו במהלך תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח בכל מערכת סגורה

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

חקור שיטת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית מהירה להערכת פולימוריזציית אקטין ברקמות מוח של מכרסמים ובני אדם. השיטה מאפשרת קוונטיפיקציה ישירה של F-actin בדגימות אקס-ויו ובידוד סינפטוזומים לחקר פלסטיות סינפטית ומחלות נוירולוגיות.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

גלה סרטונים נוספים