Name: ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למד פרוטוקול לוויטריפיקציה של תאי ביצה מבוגרים וצעירים בכבשים. השיטה כוללת הבשלה מלאכותית, הקפאה מהירה והפשרה לשימור פוריות ומחקר ביוטכנולוגי חקלאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים לא קיבלו מימון ספציפי לעבודה זו. פרופסור מריה גרציה Cappai וד"ר ולריה Pasciu הם הודה בהכרת תודה על קריינות וידאו ועל הקמת המעבדה במהלך עשיית וידאו.

<ol><li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>Mullen, S. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chronologic+review+of+mature+oocyte+vitrification+research+in+cattle%2C+pigs%2C+and+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep.</a> Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).</li>
<li>Hwang, I. S., Hochi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+cryopreservation+of+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), (2007).</li>
<li>Quan, G., Wu, G., Hong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+Cryopreservation+Based+in+Sheep%3A+The+Current+Status+and+Future+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recovery+time+after+warming+restores+mitochondrial+function+and+improves+developmental+competence+of+vitrified+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 110, (2018).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes+affects+in+vitro+pre-implantation+development+and+mRNA+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+Devices+Affect+Structural+and+Molecular+Status+of+In+Vitro+Matured+Ovine+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).</li>
<li>Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic%2C+rather+than+nuclear-DNA%2C+insufficiencies+as+the+major+cause+of+poor+competence+of+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. , (2015).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+in+vitrification+medium+affects+the+developmental+competence+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes.</a> Theriogenology. 75 (4), (2011).</li>
<li>Sanaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes%3B+beneficial+effects+of+Ethylene+Glycol+Tetraacetic+acid%2C+an+intracellular+calcium+chelator%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator.</a> Cryobiology. 84, 82-90 (2018).</li>
<li>Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+maturation+and+developmental+capability+of+ovine+oocytes+at+germinal+vesicle+stage+following+vitrification+using+different+cryodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices.</a> Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).</li>
<li>Fernández-Reyez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((maturation+and+embryo+development+in+vitro+of+immature+porcine+and+ovine+oocytes+vitrified+in+different+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices.</a> Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).</li>
<li>Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+and+glycine+can+improve+the+developmental+competence+of+vitrified%2Fwarmed+ovine+immature+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).</li>
<li>Barrera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+delipidated+estrous+sheep+serum+supplementation+on+in+vitro+maturation%2C+cryotolerance+and+endoplasmic+reticulum+stress+gene+expression+of+sheep+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes.</a> PLoS ONE. 13 (6), (2018).</li>
<li>Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Ovine+Embryos+in+Synthetic+Oviductal+Fluid+Containing+Amino+Acids+at+Oviductal+Fluid+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations.</a> Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).</li>
<li>Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+method+for+cryopreservation+of+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).</li>
<li>Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+spectral+properties+of+novel+chlorinated+pH+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Luminescence%22%5BJournal%5D)">Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes.</a> Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).</li>
<li>Dell'Aquila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prooxidant+effects+of+verbascoside%2C+a+bioactive+compound+from+olive+oil+mill+wastewater%2C+on+in+vitro+developmental+potential+of+ovine+prepubertal+oocytes+and+bioenergetic%2Foxidative+stress+parameters+of+fresh+and+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Gadau, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+quantitative+analysis+on+%CE%B1-tubulin+modifications+in+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells.</a> Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).</li>
<li>los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+distribution+and+meiotic+progression+in+canine+oocytes+during+in+vivo+and+in+vitro+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation.</a> Theriogenology. , (2011).</li>
<li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+kinetic+of+the+first+meiotic+division+and+in+active+mitochondrial+distribution+between+prepubertal+and+adult+oocytes+mirror+differences+in+their+developmental+competence+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model.</a> PLoS ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).</li>
<li>Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+and+microtubular+changes+in+vitrified+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 148, 216-224 (2020).</li>
<li>Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+dependent+effect+of+post+warming+interval+on+microtubule+organization%2C+meiotic+status%2C+and+parthenogenetic+activation+of+vitrified+in+vitro+matured+sheep+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes.</a> Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).</li>
<li>Ciotti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+recovery+is+faster+in+vitrification+of+human+oocytes+compared+to+slow+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing.</a> Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).</li>
<li>Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Coupling+and+Maturation-Promoting+Factor+Activity+in+In+Vitro-Matured+Prepubertal+and+Adult+Sheep+Oocytes1%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1.</a> Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).</li>
<li>Palmerini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+is+slowed+in+prepubertal+lamb+oocytes%3A+ultrastructural+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).</li>
<li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+relative+mRNA+abundance+and+developmental+competence+of+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+vitrification+solutions+and+cooling+upon+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.</a> Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).</li>
<li>Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-free+vitrification+reduces+cryoprotectant-induced+zona+pellucida+hardening+and+increases+fertilization+rates+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes.</a> Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).</li>
<li>Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+activation+deficiency%3A+a+role+for+an+oocyte+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).</li>
<li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte%2C+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART%3A+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li>
<li>De Santis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+vitrification%3A+influence+of+operator+and+learning+time+on+survival+and+development+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters.</a> Placenta. 32, 280-281 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+medical+applications+of+minimum+volume+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification.</a> Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הקפאה של ביציות במשפחה יכולה לאפשר לא רק שימור ארוך טווח של משאבים גנטיים נשיים, אלא גם לקדם את הפיתוח של ביוטכנולוגיה עוברית. לפיכך, פיתוח שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית ינצל הן את בעלי החיים והן את מגזר המחקר. בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה מלאה להסתערות ביציות כבשים למבוגרים ויכולה להוות נקודת התחלה איתנה לפיתוח מערכת ויטריפיקציה יעילה עבור ביצית לנוער.
אחד היתרונות העיקריים של השיטה המוצעת הוא שהיא כוללת את כל השלבים מאוסף ביציות, התבגרות במבחנה, ויטריפיקציה והתחממות. יתר על כן, הוא כולל ת...

אחסון ארוך טווח של הגמטות הנשיות יכול להציע מגוון רחב של יישומים, כגון שיפור הרבייה של בעלי חיים ביתיים על ידי תוכניות בחירה גנטית, תרומה לשימור המגוון הביולוגי באמצעות תוכנית שימור מינים לשעבר של חיות בר, וחיזוק המחקר והיישומים הביוטכנולוגיים במבחנה הודות לזמינות של ביציות מאוחסנות שישולבו בייצור עוברי במבחנה או בתוכניות השתלה גרעינית1,2,3. ויטריפיקציה של ביציות לנוער גם תגדיל את הרווח הגנטי על ידי קיצור מרווח הייצור בתוכניות הרבייה4. רטט על ידי קירור מהיר במיוחד והתחממות של ביציות נחשב כיום גישה סטנדרטית עבור הקפאה ביציות בעלי חיים5. ב הרהורים, לפני vitrification, ביציות הם בדרך כלל התבגרו במבחנה, לאחר אחזור זקיקיים המתקבלים שחלות נגזר בית מטבחיים2. מבוגרים, ובמיוחד השחלות prepubertal4,6, אכן יכול לספק מספר כמעט בלתי מוגבל של ביציות להיות cryopreserved.
בבקר, לאחר ויטריפיקציה של ביציות והתחממות, יבולי בלסטוציסט ב ->10% דווחו בדרך כלל על ידי מספר מעבדות במהלך העשור האחרון3. עם זאת, בהרהורים קטנים oocyte vitrification עדיין נחשב חדש יחסית עבור ביציות נוער ומבוגרים כאחד, שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית כבשים נשאר להקים2,5. למרות ההתקדמות האחרונה, ביצית מחוממת ואכן מציגה מספר שינויים פונקציונליים ומבניים המגבילים את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם7,8,9. לפיכך, מאמרים מעטים דיווחו על התפתחות בלסטוציסט ב 10% או יותר ביציות כבשים מחוממים / מחוממים2. מספר גישות נחקרו כדי להפחית את השינויים שהוזכרו לעיל: אופטימיזציה של הרכב פתרונות vitrification והפשרה10,11; ניסויים בשימוש במכשירי קריו שונים8,12,13; והחלת טיפולים ספציפיים במהלך התבגרות במבחנה (IVM)4,14,15 ו / או במהלך זמן ההחלמה לאחר התחממות6.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לרטט של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהתבגרות ביצית במבחנה ועד לתרבות של ויטריפיקציה, התחממות ותרבות לאחר התחממות.

<table><tbody><tr><td>2&פריים;,7&פריים;-דיכלורופלואורסצין דיאצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בקר שבר V, ללא פרוטאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>ביסבנזימיד H 33342 טריהידרוכלוריד (הוכסט 33342)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2 2H20)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>טכנולוגיות ביולוגיות רפואיות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D- (-) פרוקטוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D(+)טרהלוז מיובש</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>חלמון ביצה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול (EG)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גלוטמית</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>היפוטרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>דיאפוט, ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-אלנין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-ארגינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-אספרגין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה אספרטית</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-היסטידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-איזולאוצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' L1512</td><td></td></tr><tr><td>ל-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>ל-מתיונין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>ל-אורניתין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>ל-פנילאלנין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>ל-פרולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>ל-סרין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Makler Counting Chamber</td><td>Sefi-Medical Instruments Ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בינוני 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker אדום CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>נסיוב עגל חדש מושבת בחום (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G מלח נתרן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול פוליוויניל (87-90% הידרוליזה, משקל מול ממוצע 30,000-70,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>סירופ תמיסת נתרן dl-לקטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>מנתח מחלקת זרע</td><td>Microptic S.L.</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה סטטיסטית Minitab 18.1</td><td>2017</td> מיקרוסקופ סטריאו Minitab <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15,456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

במשק החי, מערכות ייצור עובר במבחנה ניתן לפתח ומתקיים הודות למספר רב של שחלות וביצים שניתן להשיג בקלות מבית מטבחיים. השחלות הבוגרות נושאות תמיד מספר זקיקי נמלים, ואילו בתורמים לפני גיל ההתבגרות המספרים המקסימליים של ביציות זמינים בגיל 4 שבועות, כאשר השחלות נושאות מספר שיא של זקיקים antral. לכן, כבשים בני 4 שבועות נחשבים לתורמים טובים, גם אם היכולת ההתפתחותית של ביציות טרום-דוקטורט נמוכה יותר בהשוואה למקבילם הבוגר. 
מחקר בסיסי ויישומים מסחריים יקודמו על ידי האפשרות של cryopreserving בהצלחה ביציות vitrified שהושגו מתורמים מבוגרים וקדם-פתורליים כאחד. הוויטריפיקציה של ביצית שנאספה מתורמים טרום-פתריאליים תאפשר גם לקצר את מרווח הייצור ובכך להגדיל את הרווח הגנטי בתוכניות הרבייה. עם זאת, אובדן הפוטנציאל ההתפתחותי לאחר cryopreservation עושה ביציות יונקים כנראה אחד מסוגי התאים הקשים ביותר cryopreserve. בין טכניקות ההקפאה הזמינות, רטט מוחל באופן נרחב על ביציות בעלי חיים ובני אדם. למרות ההתקדמות האחרונה בטכניקה, חשיפות לריכוזים גבוהים של סוכנים קריופרוטקטיביים, כמו גם פציעה מצמררת ומתח אוסמוטי עדיין גורמים למספר שינויים מבניים ומולקולריים ומפחיתים את הפוטנציאל ההתפתחותי של ביציות יונקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להסתבכות של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהבשלת ביצית במבחנה ועד תקופת ההזדווגות, ההתחממות והדגירה שלאחר ההתחממות. אוציטים הנבטים בשלב MII אכן יכולים להיות מופרים לאחר ההתחממות, אך הם זקוקים לזמן נוסף לפני ההפריה כדי לשחזר נזק עקב הליכי cryopreservation ולהגדיל את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. לכן, תנאי תרבות שלאחר ההתחממות ותזמון הם צעדים חיוניים לשיקום הפוטנציאל ההתפתחותי ביצית, במיוחד כאשר ביצית נאספים מתורמים צעירים.

ההקפאה של ביצית מתורמים צעירים נמוכה יותר בהשוואה למבוגרים. ההשפעה הראשונה שנצפתה היא שיעור הישרדות נמוך יותר לאחר התחממות לעומת ביציות למבוגרים (איור 1A;χ2 מבחן P&lt;0.001). ביציות נעורים הראו שלמות קרום נמוכה יותר לאחר ההתחממות (איור 1B). השימוש בטרהלוז במדיום ההבשלה נועד לאמת אם סוכר זה יכול להפחית קריו-ינחוי ביציות לנוער. הנתונים הראו23 כי ביציות התבגרו במשך 24 שעות עם תוספי trehalose הראו שיעורי הישרדות גבוהים יותר לאחר vi...

הפרוטוקול נועד לספק שיטה סטנדרטית לרטט של ביציות כבשים בוגרות וצעירות. הוא כולל את כל השלבים מהכנת אמצעי ההבשלה במבחנה לתרבות שלאחר ההתחממות. אוציטים עוברים רטט בשלב MII באמצעות Cryotop כדי להבטיח את עוצמת הקול החיונית המינימלית.

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

שמירה על הכדאיות הפוטנציאלית של ביצית לאחר אחסון לטווח ארוך מייצגת כלי של הזדמנות גדולה, שכן היא תשפר את הרבייה של בעלי חיים מקומיים על ידי תוכניות בחירה גנטית, תתרום לשימור המגוון הביולוגי באמצעות שימור מינים של חיות בר, ותגדיל את המחקר בביוטכנולוגיה. ויטריפיקציה של ביציות לנוער הייתה קצרה בהרבה במרווח הייצור בתוכניות הרבייה. גירוי על ידי קירור אולטרה-קירור והתחממות נחשב לגישה סטנדרטית בשימור ביציות בקר.עם זאת, בכבשים הליך זה עדיין נחשב חדש יחסית שיטה סטנדרטית חסרה. בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול להסתבכות של ביצית כבשים, שנאסף מתורמים צעירים ובוגרים כאחד, ובמסירות התבגר לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים מהתרבות במבחנה, vitrification, התחממות, ותרבות שלאחר ההתחממות.לאחר שחזור קומפלקס ביציות קומולוס, שם התבגר במבחנה במשך 24 שעות במצב סטטי הכולל עבור ביצית לנוער, תוספת עם מאה מיקרומולאר של trehalose במדיום התבגרות. לאחר התבגרות במבחנה, הביציות היו שקעים של תאים Cumulus מכנית על ידי צינור בעדינות נבדק תחת מיקרוסקופ סטריאו, עם הגדלה 60x. הבחירה של ביציות להגיש בהליכי vitrification מייצגים את הצעד החשוב הראשון כדי אחריות על היישום המוצלח של הליך זה.רק אלה עם ציטופלסמה אחידה, עם התפלגות הומוגנית של טיפות השומנים, שלמות של כל אמה רחב ורציף מרכזי בחלל, קומפקטי zona pellucida הקוטר החיצוני של כ 19 מיקרומטר ומראה את ההבלטה של גוף הקוטב הראשון, ולכן ב M2, שלב יש לבחור. Vitrification בוצעה בשיטת נפח חיוני מינימלי, עם מכשיר Cryotops. לאחר הבחירה, קבוצה של חמישה ביציות לנוער הותנו ב 38.5 מעלות צלזיוס במדיום בסיס במשך שתי דקות.ביציות היו אז מיובש על ידי שלוש דקות חשיפה לפתרון כיול. הטעינה של הביצית במכשיר הוויטריפיקציה המשמש היא צעד חשוב וקריטי. Cryotop משתמש ברצועת פוליפרופילן המחוברת למחזיק.בשיטה זו, הביציות בתמיסת הרטט, פחות מ -0 נקודות מיליליטר נטענות במהירות עם נימי זכוכית על גבי רצועת הסרט. אז הפתרון חייב להיות מוסר, משאיר מאחור שכבה דקה מספיק כדי לכסות את התאים להיות cryopreserved. לפני שנטען במכשיר Cryotop וצלל ישירות לתוך חנקן נוזלי בתוך 30 שניות.עבור טמפרטורה ביולוגית פנימית חמה, התוכן של כל מכשיר vitrification הועבר חנקן נוזלי לתוך 200 טיפות microliter של תמיסת trehalose פוחתת. ביציות הועברו סט היה, גרירת ביציות עם פיפטה דקה, זכוכית, כדי לקדם את הסרת cryoprotectants תאיים. לבסוף, ביציות היו טרום רבייה במדיום בסיס באינקובטור ב 5% פחמן דו חמצני.מיד לאחר ההתחממות, ועל כל נקודת זמן של תרבות שלאחר ההתחממות, ביציות הוערכו מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם הגדלה של 100x. סובלנות ההקפאה של ביציות מתורמים צעירים נמוכה יותר בהשוואה לאלה שהשתנו עם שלמות קרום נמוכה יותר לאחר ההתחממות. השימוש trehalose במדיום התבגרות המושרה ביציות לנוער שלמות קרום גבוהה יותר, להגדיל את שיעורי ההישרדות לאחר vitrification.עם זאת מחשוף, הפריה, ושיעורים התפתחותיים של ביציות לנוער לא גדלו על ידי תוספי trehalose. השימוש במדיה עם ריכוז סידן שווה 2.2 מיליגרם deciliter עבור vitrification של ביציות לנוער, צריך שיעורי הפריה גבוהים יותר לעומת ביציות רוטט עם ריכוז סידן, אבל לא נמצאו הבדלים המאפשרים ייצור. על ידי השוואת התרבות שלאחר ההתחממות על משכים שונים, הראינו כי לאחר ארבע שעות של תרבות ביצית שנאספו מן הזוגות הישנים מסוגלים לשחזר את הקשרים האנרגטיים ואת ההתקנה microtubular, ולהחזיר את היכולת ההתפתחותית עם מחשוף גבוה יותר ופסולת blastocytes.הפעילות המיטוכונדרית הייתה גבוהה יותר ביציות נעורים חמות לאחר ארבע שעות של תרבות שלאחר ההתחממות, בהשוואה לנקודות זמן אחרות. הפרידה מהחלוקה המיטוכונדרית השתנתה גם במהלך שש שעות של תרבות התחממות פוסט. יתר על כן, רמות תאיים של מיני חמצן תגובתי היו נמוכים משמעותית ביציות לנוער בשעתיים של תרבות שלאחר ההתחממות לעומת 0, 4, ו 6 שעות.עם זאת, ובניגוד למה שנמצא ביציות אחרות, שיעורי ההפעלה הפרתנוגנית הספונטנית עלו במהלך התרבות שלאחר ההתחממות ביציות לנוער. אחד היתרונות העיקריים של השיטה המוצעת הוא שהיא כוללת את כל השלבים מאוסף ביציות להתבגרות במבחנה, ויטריפיקציה והתחממות. יתר על כן, הוא כולל תקופת תרבות שלאחר ההתחממות כדי לאפשר התאוששות ביצית מהנזקים שנגרמו במהלך הליך הוויטריפיקציה.בחירת הזמן האופטימלי להפריה היא מאתגרת, והיא עשויה להשפיע על תוצאות תוכנית הוויטריפיקציה. כמו כן יש לקחת בחשבון כי, שלא כמו הקפאה איטית, vitrification היא טכניקה ידנית, ולכן הוא תלוי באופרטור. מסיבה זו, אתגר מרכזי הוא הצורך בטכנאים וחוקרים מיומנים המתחשבים באפקט המפעיל בהערכת תוצאות תוכנית הוויטריפיקציה.מחקרים נוספים מהמעבדה שלנו יאפשרו לנסות לתקנן את הליך הוויטריפיקציה והבחירה של ביצית, ובתאימה טובה יותר של הרכב המדיה לצרכים של הביצית הצעירה. התעלמות מהשימוש בתרבות ואופי ונוגדי חמצון שאנו מציעים הזדמנויות מבטיחות.

vitrification-vitro-matured-oocytes-collected-from-adult-prepubertal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כתב יד זה מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין ביציות סוסים. באופן ספציפי, העבודה הנוכחית מדגימה כיצד לאסוף ביציות של בוגר בוגרת ובוגרת על ידי אולטראסאונד מונחה איסוף ביצית (OPU) וכיצד לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, acetylation היסטון גלובלי, ביטוי mRNA.

ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור אמצעי האחסון המינימלי של ויטריפיקציה של חתולים בלתי בוגרים עם מדיה מתוצרת מעבדה על תמיכות מסחריות. הוא מכסה כל צעד מ oocyte בידוד מ vivo גונדות לשעבר כדי ויטריפיקציה והתחממות.

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

אנו מתארים את ההליכים לבידוד של גידול oocytes מזקיקי השחלות בשלבים מוקדמים של פיתוח, כמו גם את ההתקנה של מערכת תרבות מבחנה אשר יכול לתמוך בצמיחה ובידול עד לשלב הבוגר במלואו.

במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר

שימור קריופרציה של Oocyte מוכר על ידי מספר חברות מדעיות בינלאומיות כסטנדרט הזהב לשימור פוריות אצל נשים לאחר הפוסט-פוסט-פוריות. אסטרטגיות קליניות ומעבדות מתאימות מבטיחות יעילות מרבית, יעילות ובטיחות של טיפולי שימור פוריות.

שימור פוריות באמצעות ויטריפיקציה של אוציט: פרספקטיבות קליניות ומעבדתיות

מוצג פרוטוקול לוויטריפיקציה של רקמת השחלה, כשיטת שימור הקפאה חלופית להקפאה איטית הנפוצה.

ויטריפיקציה של רקמת קליפת המוח השחלתית להשגת מצב זגוגי של צבירה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מרית מונטווידאו לזיגוג עוברים לפני השרשה של עכברים וכבשים, המורכב ממרית תוצרת בית ושימוש בתמיסות תוצרת בית. העוברים מתאזנים במהירות בשתי תמיסות קריופרוטקטנטיות בריכוז הולך וגובר, נטענות על המרית, טובלות בחנקן נוזלי, ולבסוף נאטמות בקשית של 0.5 מ"ל.

מרית מכשיר מונטווידאו לזיגוג של עוברי יונקים

פרוטוקול זה מתאר שיטות סטנדרטיות לבידוד ועיבוד נוזל זקיקים, תאים סומטיים וביציות לא בשלות מהליכי הפריה חוץ גופית, המאפשרים ניתוחים מולקולריים ותאיים באיכות גבוהה. גישות אלו תומכות במחקר תרגומי על פוריות, הזדקנות רבייה ותפקוד לקוי של השחלות באמצעות חומרים המושלכים בדרך כלל בטיפול קליני.

אוסף נוזל זקיקי אנושי, תאים סומטיים של זקיקים וביציות לא בשלות מאנשים העוברים הפריה חוץ גופית

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

למד פרוטוקול לוויטריפיקציה של תאי ביצה מבוגרים וצעירים בכבשים. השיטה כוללת הבשלה מלאכותית, הקפאה מהירה והפשרה לשימור פוריות ומחקר ביוטכנולוגי חקלאי.

ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים

גלה סרטונים נוספים