אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

זהו מודל למחלת רשתית ומחקה את הרשתית in vivo. במידה מסוימת, הוא יכול להחליף ניסויים בבעלי חיים. הפרוטוקול מותאם לאיכות ולכמות של מבשרי הפוטורצפטור באורגנואידים ברשתית, והפוטורצפטור הוא המפתח למספר מצבי עיוורון בלתי הפיכים.

התחילו בגידול תאי גזע עובריים אנושיים, או hESCs, בתנאים נטולי הזנה. כדי לעשות זאת, מצפים באר אחת של צלחת שש בארות עם מיליליטר אחד של 100 מיקרוגרם למיליליטר של מגיב A, ולדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חצי שעה לפחות. הפשירו אליקוט של מיליון תאי גזע עובריים, וצנטריפוגות ב-200 xg למשך חמש דקות.

לאחר הסרת הסופרנטנט, זרעו את התאים לצלחת המצופה הקודמת, יחד עם שני מיליליטר של מגיב B.העבירו את התאים לאחר שהגיעו לכ-80% מפגש בסביבות ארבעה ימים. לאחר שהגיע למפגש, לשטוף את התאים עם DPBS מחומם מראש, ולהעביר אותם לתוך 500 microliters של מגיב מוכן טרי. לאחר מכן, דגירה של התאים במשך 3.5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.

לנתק את התאים על ידי הזזת הצד והתחתית של הצלחת במשך כמה שניות, ולהוסיף 500 microliters של אחד בינוני מוכן. קצירת התאים המנותקים לתוך צינור חדש של 1.5 מיליליטר, ופיפטה את תרחיף התאים למעלה ולמטה. לספירת תאים, הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל-900 מיקרוליטרים של DPBS.

דלל את 900 המיקרוליטרים של מתלה התאים הנותרים עם אחד בינוני בצלחת פטרי כדי להשיג תשע פעמים 10 לתאי הכוח הרביעי למיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטרים של תרחיף תאים מדולל לכל באר של צלחת שאינה דבקה, V-bottom, 96 באר. סובבו קלות את הצלחת על שייקר במהירות נמוכה במשך חמש דקות, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד היום השני.

ביום השני, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של 1% מגיב A לכל באר של צלחת 96 הבאר, ופיפטה פעמיים במרכז כדי לפזר את התאים המתים. נקו את תחתית הצלחת לפני הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד היום השישי. ביום השישי, להחליף 58 microliters של המדיום עם 60 microliters של אחד בינוני טרי, ולהמשיך את הדגירה.

ביום ה-12, קצרו את כדורי התא מצלחת 96 הבאר בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ואפשרו לכדורים להתיישב באופן טבעי במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר הכדוריות מתיישבות, מוציאים את הסופרנטנט מבלי להפריע לאורגנואידים, ומעבירים את אגרגטי התאים לצלחת תרחיף באורך 10 ס"מ המכילה 18 מיליליטר של בינוני שני עם מגיב A.דגירה של המנה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד ליום ה-18. ביום 18, לאשר את הדור של שלפוחית אופטית שקופה למחצה בצלחת, לחתוך את האורגנואידים שנוצרו באמצעות סכין microsurgical.

צוברים את כל הכדורים החתוכים למרכז המנה. לאחר מכן, קצור את התאים לתוך צינור פלקון חרוטי 15 מיליליטר. כאשר התאים שוקעים, מסירים בעדינות את הסופרנטנט, ומניחים את הכדורים בשתי צלחות פטרי באורך 10 ס"מ עם 18 מיליליטר בינוני, שלושה לכל מנה.

מעבירים בעדינות את הכלים לאינקובטור כדי למנוע צבירת תאים. ממשיכים להתרבות את התאים, ומשנים את המדיום מדי שבוע. לנתח את ביטוי CRX לאחר יום 45 עד יום 120.

בניתוח מייצג זה מוצגים שלבים שונים של יצירת רשתית אנושית. ביום השישי הופיעו האורגנואידים כצבר של חיבורים צפופים בתוך שפה בהירה בקוטר של כ-600 מיקרומטר. ביום ה -12 התקיים הדור הראשוני של מבנים דמויי שלפוחית אופטית.

האורגנואידים ללא ארכיטקטורה מתאימה דמוית שלפוחית הושלכו לפני שהתרבו בצלחת פטרי ביום ה-18. ביום ה -30 של התרבות, הארכיטקטורה דמוית השלפוחית הייתה ברורה יותר, וניתן היה להבחין ולהסיר בקלות ROs נחותים. החל מהיום ה-45, האורגנואידים ביטאו סמנים שונים של מבשרי פוטורצפטורים, כגון CRX, RCVRN ו-OTX2.

על ידי ביקוע האורגנואידים המעולים של הרשתית, יעילות ההתמיינות משופרת באופן משמעותי, וניתן היה לקצור יותר מ-100 אורגנואידים מעולים מ-96 צלחות.