Name: אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: למד פרוטוקול ממוקד ליצירת אורגנואידים ברשתית אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים. השיטה משפרת את התמייה של קדם-צלוליות לחקר מחלות רשתית וטיפולים פוטנציאליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת 502 על התמיכה הטכנית וההערות המועילות בנוגע לכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (Z200014) ותוכנית המו"פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים בייג'ינג טונגרן, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. H9 hESCs התקבלו ממכון המחקר WiCell והונדסו גנטית לקו תאים המתויגים על ידי tdTomato.
1. דור של ROs אנושיים
<ol><li>תרבו את ה-hESCs בתנאים נטולי הזנה.<ol><li>מצפים באר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של 0.1 מ"ג / מ"ל מגיב A (טבלת חומרים) ב 37 מעלות צלזיוס לפחות חצי שעה בהתאם להוראות היצרן. הפשרה של 1x106 hESCs. הערה: הכינו 3 מ"ל של מגיב B (טבלת חומרים) שחומם מראש והעבירו את התאים המוקפאים (1 מ"ל) ל-3 מ"ל של מדיום טרי. אין להעביר את ה-hESCs לתאים בודדים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.</li>
		<li>זרעו את התאים לתוך צלחת מגיב מצופה A עם 2 מ"ל של מגיב B והחליפו 2 מ"ל של מגיב B מדי יום. תאי מעבר כאשר מגיעים לכ 80% מפגש (בדרך כלל סביב 4 ימים).</li>
	</ol></li>
	<li>יום 0<ol><li>יש לנתק את ה-hESCs לתרחיף חד-תאי באמצעות מדיום I (טבלה 1). הכן את Medium I על ידי ערבוב הפריטים הבאים: 20% (v/v) תחליף סרום KnockOut (KSR), תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) של 0.1 mM MEM, פירובט 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ננוגרם/מ"ל COCO, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (PS), 0.1 mM β-מרקפטואתנול, והמדיום החיוני המינימלי (GMEM) של גלזגו. הערה: לפני תחילת הדיסוציאציה, הכינו מדיום I והעבירו 12 מ"ל של מדיום I עם 20 מיקרומטר Y-27632 לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ, 500 מיקרוגרם מגיב C (טבלת חומרים) המכילים 0.05 מ"ג/מ"ל מגיב D (טבלת חומרים) ו-20 מיקרומטר Y-27632 בצינור של 1.5 מ"ל. בצע את השלבים לעיל בחושך, מכיוון שרכיב IWR1e במדיום I רגיש לאור.</li>
		<li>שטפו את ה-hESCs עם חיץ מלח (DPBS) של 1x Dulbecco שחומם מראש.</li>
		<li>הוסף את המגיב המוכן 500 μL (בצינור 1.5 מ"ל) ודגירה של hESCs במשך 3.5 דקות ב 37 °C ו 5% CO2.</li>
		<li>נתקו את התאים על ידי הזזת הצד והתחתית של הצלחת למשך מספר שניות והוסיפו 500 μL של מדיום מוכן I מצלחת פטרי לתוך צלחת hESC. הערה: הכן שפופרת של 1.5 מ"ל עם 900 μL של DPBS 1x והשתמש בהמוציטומטר לספירת תאים.</li>
		<li>קצירת התאים בצינור חדש של 1.5 מ"ל ופיפטה של מתלה התאים למעלה ולמטה ואז מוציאים 100 μL מהצינור ואז מוסיפים לתוך הצינור עם 900 μL של DPBS לספירת תאים.</li>
		<li>פזרו את תרחיף התאים השמאלי בנפח 900 μL ולאחר מכן דיללו את התאים עם מדיום מוכן I בצלחת פטרי ל-9 x 104 תאים /מ"ל. הערה: כל נפח המדיום הוא 12 מ"ל; 1.08 x 106 תאים נדרשים בסך הכל.</li>
		<li>הוסף 100 μL של תרחיף תאים לכל באר של צלחת שאינה דבקה, V-bottom, 96-well (טבלת חומרים). הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לקצר את הזמן ולוודא שכל באר מכילה מספר תא שווה ערך. יש לנער את צלחת הפטרי בכל פעם לפני הסרת מנות של 100 μL. חשוב כי התאים מופצים באופן אחיד.</li>
		<li>סובבו קלות את צלחת 96 הבאר בשייקר במהירות נמוכה למשך 5 דקות ולאחר מכן דגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. הערה: שמור את הצלחת בחושך. הגדר את היום כיום 0.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 2<ol><li>הוסף 1% מגיב A (טבלת חומרים). הכן ריאגנט A (ריכוז חלבון של 10 מ"ג/מ"ל) על ידי הוספת 133.4 μL של מגיב A לתוך 2 מ"ל של בינוני I. הערה: יש לשמור על ריאגנט A בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לפני השימוש כדי להשיג התכה מלאה ואחידה. שים לב למידע על המוצר וחפש את מספר הקטלוג ואת מספר המגרש באתר הרשמי של החברה כדי לקבל את ריכוז החלבון של מגיב A כמו כל בקבוק של מגיב A הוא בריכוז חלבון שונה. אם ריכוז החלבון נמוך, נפח מוגבר של מגיב A יעזור.</li>
		<li>מוסיפים 20 μL של מגיב מוכן A לכל באר ופיפטה פעמיים במרכז כדי לפזר את התאים המתים. הערה: שמרו על מגיב A ועל צלחת 96 הבאר בתנאי קרירות והשלימו את כל השלבים על הקרח. מניחים את הצלחת בחושך.</li>
	</ol></li>
	<li>ימים 2-12<ol><li>מנקים את החלק התחתון של צלחת 96 הבאר ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד היום ה-6. ביום 6, שנה מחצית מהמדיום על ידי הסרת 58 μL של המדיום מכל באר והוספת 60 μL של בינוני I. הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להשלים את חצי השינוי הבינוני. בצעו את הצעד הזה בעדינות כדי להבטיח שלא יוסרו כדורי תאים מהבאר. שאפו את המדיום לצלחת פטרי נקייה בקוטר 10 ס"מ. אם יש כדוריות תאים בפנים, הוסף אותן בחזרה לצלחת 96 הבאר.</li>
	</ol></li>
	<li>ימים 12- 18<ol><li>שנה את המדיום לבינוני II (טבלה 1) ביום 12. הכן את Medium II באמצעות מגיב A של 1% (v/v) על ידי ערבוב הפריטים הבאים: 10% סרום בקר עוברי (FBS), 0.1 mM NEAA, 1 mM פירובט, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 0.1 mM β-מרקפטואתנול, 100 ננומטר SAG דיהידרוכלוריד ו- GMEM. אחסנו אותו בתנאים קרירים וחשוכים.</li>
		<li>קוצרים את כדורי התא בצינור חרוטי של 15 מ"ל מהצלחת בעלת 96 הבארות ומאפשרים לכדורים להתיישב באופן טבעי למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: יש להסיר את המדיום ואת הכדורים בעדינות מתחת לפני השטח כדי למנוע בועות.</li>
		<li>הסר את supernatant תוך טיפול באורגנואידים. מעבירים את אגרגטי התאים לצלחת תלייה בקוטר 10 ס"מ המכילה 18 מ"ל של מדיום II מוכן עם מגיב A. הערה: אין להוסיף את המדיום II המוכן למנה בגודל 10 ס"מ מראש, שכן מגיב A צריך להיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 עד היום 18.</li>
	</ol></li>
	<li>מהיום ה-18 ואילך<ol><li>שנה את המדיום למדיום III (טבלה 1). הכן את מדיום III בתנאים כהים על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0.5 μM חומצה רטינואית (RA), טאורין 100 μM, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ותערובת 1:1 של תערובת הנשר המעובד (DMEM)/תערובת החומרים המזינים F-12 של דולבקו.</li>
		<li>ביום ה -18, כאשר נוצרת שלפוחית אופטית שקופה למחצה, חותכים את האורגנואידים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. הערה: מבקעים את האורגנואיד, בדרך כלל לארבעה חלקים, בצלחת פטרי עם מדיום II. כל חתיכה אמורה לגדול לכוס אופטית שלמה בשבועות הבאים.</li>
		<li>צוברים את כל הכדורים למרכז המנה. קצירת התאים לתוך צינור בז חרוטי של 15 מ"ל ומאפשרת התיישבות טבעית. לאחר מכן יש להסיר בעדינות את הסופרנטנט. הערה: בשל גודלם, ניתן לצבור אורגנואידים במרכז על ידי סיבוב צלחת פטרי בכיוון אחד במשך 90° במישור אופקי מספר פעמים.</li>
		<li>משהים ומפזרים את הכדורים בשתי צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ, עם 18 מ"ל בינוני III למנה, ומעבירים בעדינות את הכלים לאינקובטור כדי למנוע צבירת תאים. המשך להתרבות בבינוני III ב 37 °C ו 5% CO2 ולשנות את הבינוני מדי שבוע. ה-CRX התבטא לאחר היום ה-45 ועד היום ה-120, יכולנו לזהות את הקטע החיצוני של הפוטורצפטור.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ניתוח ROs אנושיים
<ol><li>ניתוח FACS<ol><li>הרכיבו מהמנות שלושה אורגנואידים של CRX-tdTomato ושלושה אורגנואידים שמקורם ב-H9 ES באמצעות קצוות חתוכים של 1 מ"ל. לשטוף את האורגנואידים עם 1 מ"ל של DPBS מחומם מראש (טמפרטורת החדר).</li>
		<li>הכן את מאגר העיכול על ידי ערבוב תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% עם 0.05 מ"ג/מ"ל של מגיב D.</li>
		<li>נתקו את האורגנואידים לתאים בודדים על ידי שימוש במאגר העיכול המוכן למשך 8 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף את אותו נפח של DPBS עם 10% FBS ו 0.05 מ"ג / מ"ל של מגיב D כדי להשבית את התגובה.</li>
		<li>להשעות ולפזר קלות את התאים ולאחר מכן לסנן באמצעות מסננת תאים של 100 מיקרומטר ולהשתמש במערכת מיון תאים המופעלת על ידי פלואורסצנציה (FACS) בקו לייזר עירור של 561 ננומטר ובמסנן 780/60 כדי לנתח את האותות החיוביים של CRX-tdTomato. הערה: CRX מתבטא בתחילה ביום 45 ומתגבר עם הבשלת האורגנואידים. עשרת אלפים תאים משמשים עבור כל בדיקה, עבור כל נקודת זמן, לפחות שלוש חזרות הושלמו.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות עוצמת פלואורסצנציה של ROs<ol><li>הכינו את האורגנואידים הקיימים באופן אקראי להדמיה. הערה: הגדר את הפרמטרים והשתמש באותם מסננים ופרמטרים עבור כל צגי עוצמת הפלואורסצנטיות.</li>
		<li>צלם תמונות ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת באמצעות תוכנה מתאימה (לדוגמה, ImageJ).</li>
		<li>ייבא את התמונות ולאחר מכן המר ל- 8 סיביות באמצעות Image | סוג.</li>
		<li>התאם את הסף באמצעות פרמטרי ברירת המחדל לפי Image | התאמת | סף.</li>
		<li>קבע את השטח הנמדד ולאחר מכן הערך האפור באמצעות נתח | למדוד. הערה: הערכים הממוצעים בלוח התוצאות הם עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של השטח הנמדד.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

התמיינות אורגנואידית רשתית היא שיטה רצויה ליצירת תאי רשתית מתפקדים בשפע. ה-RO הוא תרכובת של תאי רשתית שונים, כגון תאי גנגליון, תאים דו קוטביים ופוטורצפטורים, הנוצרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים לכיוון הרשתית העצבית 4,5,8,9. למרות שניתן לקצור ROs נפגשים, זה גוזל זמן, מה שעשוי לדרוש תקופות גידול ארוכות (עד 180 יום). עם זאת, עבור השתלת פוטורצפטורים, או חקר ניוון חרוט-מוט או רוד-חרוט, כדאי להשיג א...

תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) מאופיינים בהתחדשות עצמית וביכולתם להתמיין לכל מיני תאים סומטיים. לפיכך, אורגנואידים שמקורם ב-PSCs הפכו למשאב חשוב במחקר ברפואה רגנרטיבית. ניוון הרשתית מאופיין באובדן פוטורצפטורים (מוטות ומדוכים) ואפיתל פיגמנט רשתית. החלפת תאי רשתית יכולה להיות טיפול מעודד למחלה זו. עם זאת, לא ניתן להשיג רשתיות אנושיות למחקר וטיפול במחלות. לכן, אורגנואידים של הרשתית (ROs) שמקורם ב-PSCs, אשר משחזרים ביעילות ובהצלחה תאי רשתית מקומיים רב-שכבתיים, מועילים למחקר בסיסי ותרגומי 1,2,3. המחקר שלנו מתמקד בהתמיינות RO כדי לספק תאים מספיקים ואיכותיים לחקר ניוון הרשתית4.
שיטות להבחנה בין ROs מתפתחות ללא הרף, עם דיפרנציאציה תלת מימדית (3D) מתלים חלוצה על ידי מעבדת Sasai בשנת 20125. הצגנו את התג CRX-tdTomato בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) כדי לעקוב באופן ספציפי אחר התאים המבשרים של הפוטורצפטור ושינינו את השיטה עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב-תכליתי של מסלולי Wnt, TGF-β ו-BMP6. הוכח כי COCO משפר ביעילות את יעילות ההתמיינות של מבשרי פוטורצפטורומדוכים 6,7.
בסך הכל, על ידי שינוי שיטת ההבחנה הקלאסית, פיתחנו פרוטוקול נגיש לקצירת מבשרי פוטורצפטור ומדוכים רבים מ- ROs אנושיים לניתוח מחלת הרשתית הקשורה לפוטורצפטורים באמצעות חקירות מעבדה ולהמשך יישום קליני / השתלה.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R& D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>DAN Domain משפחת אנטגוניסטים של BMP</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך לתאי גזע עובריים אנושיים</td><td>תעשייה ביולוגית</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut החלפת סרום-רב-מינים</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td><td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-plate</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>צבירת תאים ב-1.2.7</td></tr><tr><td>פירובט</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>מגיב A</td><td>BD</td><td>356231</td><td>מטריג'ל ב-1.1.1</td></tr><tr><td>מגיב B</td><td>StemCell</td><td>5990</td><td>mTeSR-E8 , PSCs מדיום בסיסי ב-1.1.2</td></tr><tr><td>מגיב C</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express ב-1.2</td></tr><tr><td>מגיב D</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>DNase I , ב-1.2</td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>Sigma</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Enzo Life Science</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>תוסף תזונה 1</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 תוסף (100X), נוזלי, תוסף במדום III</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>דיסוציאציה אורגנואידים ב-2.1.3</td></tr><tr><td>Wnt אנטגוניסט I, IWR-1-endo - Calbiochem</td><td>מעכב סיגמא</td><td>681669</td><td>Wnt</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

השתלת תאי רשתית היא גישה טיפולית מבטיחה, שיכולה לשחזר את ארכיטקטורת הרשתית ולייצב או אפילו לשפר את יכולות הראייה לרשתית המנוונת. עם זאת, ההתקדמות בטיפול בתחליפי תאים מתמודדת כיום עם האתגרים הדורשים מקור מדף של רשתיות אנושיות איכותיות וסטנדרטיות. לכן, יש צורך בפרוטוקול קל ויציב לניסויים. כאן, אנו מפתחים פרוטוקול אופטימלי, המבוסס על שיטת ארגון עצמי עם שימוש במולקולות אקסוגניות וריאגנט A, כמו גם כריתה ידנית ליצירת אורגנואידים תלת מימדיים של הרשתית האנושית (RO). RO שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) מבטא סמנים ספציפיים לפוטורצפטורים. עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב תכליתי, יעילות ההבחנה של מבשרי פוטורצפטור ומדוכים גדלה באופן משמעותי. השימוש היעיל במערכת זו, שיש לה את היתרונות של קווי תאים ותאים ראשוניים, וללא בעיות המקור הקשורות לאחרון, עלול לייצר תאי רשתית מפגשים, במיוחד פוטורצפטורים. לפיכך, ההתמיינות של PSCs ל-RO מספקת פלטפורמה אופטימלית ורלוונטית ביולוגית למידול מחלות, בדיקת תרופות והשתלת תאים.

האיור הסכמטי מתאר את פרוטוקול ההתמיינות לשיפור תאים מבשרים באמצעות COCO (איור 1). מ- PSC ל- ROs, פרטים רבים עלולים לגרום לשינויים בתוצאות. מומלץ להקליט כל שלב ואפילו את המספר הקטלוגי ואת מספר המגרש של כל מדיום כדי לעקוב אחר ההליך כולו.
כאן אנו מספקים תמונות שדה בהירות לימים 6, 12, 18 ו-45 (איור 2). ביום השישי, האורגנואידים הם בדרך כלל בקוטר של כ-600 מיקרומטר בלוח של 96 בארות, עם חיבורים צפופים בפנים ושפה בהירה (אי...

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

זהו מודל למחלת רשתית ומחקה את הרשתית in vivo. במידה מסוימת, הוא יכול להחליף ניסויים בבעלי חיים. הפרוטוקול מותאם לאיכות ולכמות של מבשרי הפוטורצפטור באורגנואידים ברשתית, והפוטורצפטור הוא המפתח למספר מצבי עיוורון בלתי הפיכים.התחילו בגידול תאי גזע עובריים אנושיים, או hESCs, בתנאים נטולי הזנה. כדי לעשות זאת, מצפים באר אחת של צלחת שש בארות עם מיליליטר אחד של 100 מיקרוגרם למיליליטר של מגיב A, ולדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חצי שעה לפחות. הפשירו אליקוט של מיליון תאי גזע עובריים, וצנטריפוגות ב-200 xg למשך חמש דקות.לאחר הסרת הסופרנטנט, זרעו את התאים לצלחת המצופה הקודמת, יחד עם שני מיליליטר של מגיב B.העבירו את התאים לאחר שהגיעו לכ-80% מפגש בסביבות ארבעה ימים. לאחר שהגיע למפגש, לשטוף את התאים עם DPBS מחומם מראש, ולהעביר אותם לתוך 500 microliters של מגיב מוכן טרי. לאחר מכן, דגירה של התאים במשך 3.5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.לנתק את התאים על ידי הזזת הצד והתחתית של הצלחת במשך כמה שניות, ולהוסיף 500 microliters של אחד בינוני מוכן. קצירת התאים המנותקים לתוך צינור חדש של 1.5 מיליליטר, ופיפטה את תרחיף התאים למעלה ולמטה. לספירת תאים, הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל-900 מיקרוליטרים של DPBS.דלל את 900 המיקרוליטרים של מתלה התאים הנותרים עם אחד בינוני בצלחת פטרי כדי להשיג תשע פעמים 10 לתאי הכוח הרביעי למיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטרים של תרחיף תאים מדולל לכל באר של צלחת שאינה דבקה, V-bottom, 96 באר. סובבו קלות את הצלחת על שייקר במהירות נמוכה במשך חמש דקות, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד היום השני.ביום השני, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של 1% מגיב A לכל באר של צלחת 96 הבאר, ופיפטה פעמיים במרכז כדי לפזר את התאים המתים. נקו את תחתית הצלחת לפני הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד היום השישי. ביום השישי, להחליף 58 microliters של המדיום עם 60 microliters של אחד בינוני טרי, ולהמשיך את הדגירה.ביום ה-12, קצרו את כדורי התא מצלחת 96 הבאר בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ואפשרו לכדורים להתיישב באופן טבעי במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר הכדוריות מתיישבות, מוציאים את הסופרנטנט מבלי להפריע לאורגנואידים, ומעבירים את אגרגטי התאים לצלחת תרחיף באורך 10 ס"מ המכילה 18 מיליליטר של בינוני שני עם מגיב A.דגירה של המנה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד ליום ה-18. ביום 18, לאשר את הדור של שלפוחית אופטית שקופה למחצה בצלחת, לחתוך את האורגנואידים שנוצרו באמצעות סכין microsurgical.צוברים את כל הכדורים החתוכים למרכז המנה. לאחר מכן, קצור את התאים לתוך צינור פלקון חרוטי 15 מיליליטר. כאשר התאים שוקעים, מסירים בעדינות את הסופרנטנט, ומניחים את הכדורים בשתי צלחות פטרי באורך 10 ס"מ עם 18 מיליליטר בינוני, שלושה לכל מנה.מעבירים בעדינות את הכלים לאינקובטור כדי למנוע צבירת תאים. ממשיכים להתרבות את התאים, ומשנים את המדיום מדי שבוע. לנתח את ביטוי CRX לאחר יום 45 עד יום 120.בניתוח מייצג זה מוצגים שלבים שונים של יצירת רשתית אנושית. ביום השישי הופיעו האורגנואידים כצבר של חיבורים צפופים בתוך שפה בהירה בקוטר של כ-600 מיקרומטר. ביום ה -12 התקיים הדור הראשוני של מבנים דמויי שלפוחית אופטית.האורגנואידים ללא ארכיטקטורה מתאימה דמוית שלפוחית הושלכו לפני שהתרבו בצלחת פטרי ביום ה-18. ביום ה -30 של התרבות, הארכיטקטורה דמוית השלפוחית הייתה ברורה יותר, וניתן היה להבחין ולהסיר בקלות ROs נחותים. החל מהיום ה-45, האורגנואידים ביטאו סמנים שונים של מבשרי פוטורצפטורים, כגון CRX, RCVRN ו-OTX2.על ידי ביקוע האורגנואידים המעולים של הרשתית, יעילות ההתמיינות משופרת באופן משמעותי, וניתן היה לקצור יותר מ-100 אורגנואידים מעולים מ-96 צלחות.

directed-induction-retinal-organoids-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

פרוטוקול זה משלב ניקוי אופטי ותיוג חיסוני להדמיה קונפוקלית בנפח מלא של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא משמר מבנה תלת מימדי, מאפשר הדמיה מפורטת של מסלולים עצביים מרכזיים, משפר את חקר הבשלת הרשתית, ארגון מרחבי ויישומיו הפוטנציאליים במודלים של מחלות ורפואה מותאמת אישית.

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

השיטה מתוארת בידוד ואפיון של תאי גזע אנושיים שיניים זולות (hDPSCs) באמצעות...

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

הבידוד של תאי גזע סרטני (CSCs) ישירות מרקמות אנושיות הוא הנדרש לאפיון הביולוגי שלהם. כתב יד זה מתאר מתודולוגיה לבידודה של CSCs ערמונית מרקמות אנושיות, תוך מתן טיפים על פתרון בעיות בצעדים קשים גם.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

למד פרוטוקול ממוקד ליצירת אורגנואידים ברשתית אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים. השיטה משפרת את התמייה של קדם-צלוליות לחקר מחלות רשתית וטיפולים פוטנציאליים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

גלה סרטונים נוספים