Name: דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: למדו פרוטוקול סטנדרטי ליצירת אורגנוידים לשוניים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר. השיטה מאפשרת מחקר מהיר ורבי-פלט של פיתוח תאי טעם ורегенרציה במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות לד"ר פיטר דמפסי ומוניקה בראון (אוניברסיטת קולורדו Anschutz קמפוס רפואי Organoid ורקמות מודל משאב משותף) על מתן מדיה מותנית WNR ודיונים יקרי ערך. אנו מודים גם לטכנולוגיות התאים של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קולורדו ולמשאבים משותפים של Cytometry זרימה, במיוחד דמיטרי בטורין, על מומחיות במיון תאים. עבודה זו מומנה על-ידי: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, ו- NIH/NCI R21 CA236480 ל- LAB, ו- R21DC016131 ו- R21DC016131-02S1 ל- DG, ו- F32 DC015958 ל- EJG.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו במתקן מוסמך AAALAC בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, חוק רווחת בעלי חיים ומדיניות שירות בריאות הציבור, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו Anschutz. עכברי Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 המשמשים בפרוטוקול זה הם ממעבדת ג'קסון, מלאי מס ' 008875.
הערה: השלבים הבאים יש להשלים לפני תחילתו כדי להבטיח התקדמות חלקה בזמן של הפרוטוקול: להגדיר אמבט מים ל 37 °C ,, להגדיר צנטריפוגה ל 4 °C (5 °C), להפוך פתרונות אנזימי הזרקה ודיסוציאציה מן 10 מ"ג / מ"ל Dispase, Collagenase, ופתרונות מלאי אלסטאז (ראה טבלה של חומרים), להסיר ג'ל מטריצה מ -20 °C מקפיא (~ 750 μL הדרוש צלחת 48-באר) ולהפשיר על ידי טביעת הלווייני בקרח עבור ב לפחות 3-4 שעות, צינורות microcentrifuge טרום מעיל ב FBS לא מדולל על ידי נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפחות (שני צינורות 2 מ"ל לאיסוף רקמות, שני צינורות 1.5 מ"ל לתאים מנותקים, וצינור אחד 1.5 מ"ל לאיסוף תאים בודדים מממיין התאים; הסר FBS עודף לפני השימוש).
1. בידוד אפיתל CVP
הערה: כדי להשיג מספיק LGR5+ תאים עבור צלחת מלאה 48-well, לאסוף שלושה CVPs Lgr5-EGFP באותו צינור ולעבד בו זמנית. חשוב לציין, לקצור ולעבד את CVP של לפחות סוג בר אחד המלטה במקביל בצינור נפרד ולהשתמש בו כפקד gating כדי להגדיר פרמטרי FACS (ראה תוצאות מייצגות).
<ol><li>המתת חסד העכברים עם חנק CO2 על פי תקנות IACUC, ואחריו שיטה משנית מאושרת כגון בית החזה הדו צדדי, נקע צוואר הרחם, עריפת ראש, או דממה.</li>
	<li>השתמש במספריים גדולים סטריליים כדי לחתוך את הלחיים ולשבור את הלסת. הרם את הלשון וחתוך את frenulum לשוני כדי להפריד את הלשון מרצפת חלל הפה. חותכים את הלשון ואוספים אותה בתחבולה סטרילית של דולבק עם חוצץ פוספט (dPBS) עם Ca2+ ו-Mg2+.</li>
	<li>הסר והשלך את הלשון השמאלית על ידי חיתוך רק את קהוריו של ההצטיידות הבין-עמיתית עם סכין גילוח (איור 1A, קו מקווקו). השתמש בנגב משימה עדין כדי להסיר כל שיער ונוזל עודף מהלשון האחורית.</li>
	<li>מלא מזרק 1 מ"ל עם 200-300 μL של פתרון אנזימי הזרקה (ריכוז סופי: 2 מ"ג / מ"ל סוג-I Collagenase ו 5 מ"ג / מ"ל Dispase II ב Ca2 +/ Mg2 +- המכיל dPBS, מדולל מ 10 פתרונות מלאי מ"ג / מ"ל) ולהכניס מחט 30 G x 1/2 רק מעל המעמד הבין-עמי (איור 1B,חץ שחור) עד רק לפני ה- CVP (איור 1B, קופסה שחורה). הזריקו את תמיסת האנזים מתחת ובקצוות לרוחב של ה- CVP בין האפיתל לרקמות הבסיסיות (למינה פרופריה, שריר). למשוך את המזרק לאט ברציפות מן הלשון כמו הזריקה מבוצעת.</li>
	<li>לדגור על הלשון ב- Ca סטרילי2 +/ מ"ג2 +- dPBS חינם בטמפרטורת החדר במשך 33 דקות בדיוק.</li>
	<li>לעשות חתכים קטנים באפיתל דו-צדדי ופשוט קהורי ל- CVP באמצעות מספריים חתך דקים במיוחד, ולקלף בעדינות את האפיתל על ידי הרמתו עם מלקחיים עדינים. לאחר אפיתל התעלה הוא ללא רקמת החיבור הבסיסית, למקם אותו בצינור microcentrifuge 2 מ"ל ריק מצופה מראש עם FBS. האם חיתוך אפיתל לפני או אחרי ניתוק האפיתל CVP(איור 1C,D).</li>
</ol>2. דיסוציאציה של אפיתל CVP
הערה: דיסוציאציה של האפיתל והצילה של CVP מיוצגים באופן גרפי באיור 2.
<ol><li>הוסיפו את קוקטייל אנזימי הדיסוציאציה (ריכוז סופי: 2 מ"ג/מ"ל סוג-I Collagenase, 2 מ"ג /mL אלסטאז, ו-5 מ"ג/מ"ל Dispase II ב-Ca2+/Mg2+- המכיל dPBS, מדולל מ-10 פתרונות מלאי מ"ג/מ"ל) לצינורות המכילים אפיתליה קלופה CVP (200 μL לכל CVP). דגירה באמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 45 דקות. מערבולת בקצרה כל 15 דקות. הערה: טרום מלחמה 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים 37 °C במהלך 15 הדקות האחרונות של דגירה קוקטייל אנזימים.</li>
	<li>לאחר הדגירה, מערבולת (שלושה פולסים) ואז triturate עם פיפטה פסטר זכוכית במשך 1 דקות. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה הסופר-נט המכילה את האוסף הראשון של תאים מנותקים, לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים מצופים FBS בגודל 1.5 מ"ל המתאימים לגנוטיפ. לעבד את חתיכות הרקמה הנותרות עוד יותר כמתואר בשלב 2.3. מתחת.<ol>
<li>ספין את supernatant במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה.</li>
		<li>הסר את supernatant וכתוצאה מכך resuspend גלולה התא ב- Ca2 +/ Mg2 +- חינם PBS (50 μL לכל CVP)). תחסן על קרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעת ביצוע שלבים 2.2.1 ו 2.2.2, לנתק את חתיכות הרקמה הנותרות לשלב 2.2 על ידי הוספת טריפסין-EDTA התחממות מראש (200 μL לכל CVP) לצינורות microcentrifuge המקוריים 2 מ"ל ודגרה באמבט מים 37 °C במשך 30 דקות. מערבולת בקצרה כל 10 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, מערבולת הצינור המכיל חתיכות רקמה (שלושה פולסים) ולאחר מכן triturate עם פיפטת פסטר זכוכית במשך 1 דקות. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה את הסופר-נט לתוך צינורות המיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכילים תאים החל מהשלב 2.2.2. השלך את הצינורות המכילים את חתיכות הרקמה הנותרות.<ol>
<li>לסובב את הצינורות עם תאים מנותקים במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה.</li>
		<li>הסר את כדורי תא supernatant ו resuspend במאגר FACS (100 μL לכל CVP). תחסן על קרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את התאים דרך מסנן רשת ניילון 30 מיקרומטר ולהוסיף DAPI(פליטת λ = 450 ננומטר) לתערובות תאים לפני FACS. לבודד Lgr5-GFP+ תאים באמצעות FACS באמצעות ערוץ חלבון פלואורסצנטי ירוק(עירור λ = 488 ננומטר;פליטת λ = 530 ננומטר). מיין את התאים באמצעות זרבובית 100 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל טרי מצופה FBS המכיל 300 μL של Ca2 +/ Mg2 + חינם dPBS. מניחים את התאים על קרח עד ציפוי.</li>
</ol>3. ציפוי של תאי Lgr5-EGFP
<ol><li>קבע את עוצמת הקול של השעיית LGR5+ תא שהתקבלה מציטומטר הזרימה.</li>
	<li>בהתבסס על מספר התאים שהתקבלו מהממיין, חשב את מספר התאים ל- μL. לאחר מכן, לקבוע את הנפח הדרוש כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים לציפוי (אנו משתמשים 200 תאים לכל באר של צלחת 48 טוב) ולהעביר את הנפח הכולל של תאים מושעים לתוך צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>ספין את הצינור במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה (גלולה לא יכול להיות גלוי). הסר את supernatant ומניחים את הצינור על קרח.</li>
	<li>בעדינות resuspend את גלולה התא בכמות המתאימה של ג'ל מטריצה (15 μL לבאר עבור 48-טוב צלחות); pipette למעלה ולמטה בעדינות כדי להפיץ ביסודיות תאים בג'ל מטריצה. מניחים 15 μL של תערובת ג'ל מטריצה / תא במרכז כל באר. שמור את צינור microcentrifuge על קרח בצינור חרוטי 50 מ"ל במהלך ציפוי כדי למנוע ג'ל מטריצה מג'ל. ממשיכים לערבב תערובת ג'ל/תאים מטריקס לאורך כל ה ציפוי על ידי צנרת למעלה ולמטה כל שלוש בארות כדי להבטיח התפלגות שווה של תאים על פני בארות.</li>
	<li>מניחים את הצלחת באינקובטור (37 °C (37 °C), 5% CO2, ~ 95% לחות) במשך 10 דקות כדי לאפשר ג'ל מטריצה. לאחר מכן, להוסיף 300 μL של טמפרטורת החדר WENRAS + Y27632 מדיה לכל באר ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור.</li>
</ol>4. תחזוקת אורגנויד
הערה: Organoids גדלים במדיה organoid קונבנציונאלי (WENR) הכוללת EGF רקומביננטי ו 50% מדיה מותנית המכיל Wnt3a, Noggin, ו R-ספונדין23. תרופות A8301 ו- SB202190 מתווספות במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות כדי לייעל את הצמיחה (מדיה WENRAS) (איור 5),ולאחר מכן הוסרו כדי לקדם בידול (מדיה WENR)20. Y27632 מתווסף ליומיים הראשונים של התרבות כדי לקדם הישרדות. תנאי המדיה ביחס לציר הזמן של התרבות מוצגים באיור 4.
<ol><li>יומיים לאחר ה ציפוי, להסיר WENRAS + Y27632 מדיה מכל באר באמצעות pipette 1 מ"ל, להבטיח ללא זיהום צולב. הוסף 300 μL של מדיה WENRAS בצד של הבאר כדי לא לשבש את ג'ל מטריצה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.</li>
	<li>שנה את המדיה כל יומיים, תוך שימוש באמצעי התקשורת המתאימים לשלב התרבות(איור 4). לשמור על organoids עד היום 12, כאשר organoids מוכנים לקצור.</li>
</ol>5. עיבוד RNA
<ol><li>קצירת אורגנוידים לרנ"א<ol>
<li>מניחים צלחת 48-well על קרח במשך 30 דקות כדי depolymerize ג'ל מטריצה.</li>
		<li>באמצעות פיפטה 1 מ"ל, למשוך את המדיה organoid; לאחר מכן, כמו התקשורת מוחזרת לבאר, להשתמש בקצה של pipette כדי לגרד עוד יותר לשבור את ג'ל מטריצה. העבר את התוכן לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, איגום תוכן של שלוש בארות בצינור אחד. צנטריפוגות הצינורות במשך 5 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר מדיה רבה ככל האפשר ללא הסרת organoids; לאחר מכן, לסובב את הצינורות שוב במשך 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את המדיה הנותרת ו resuspend organoids ב 350 μL מאגר תמוגה + β-mercaptoethanol (βME) (10 μL βME לכל 1 מ"ל מאגר תמוגה). מניחים את הדגימות על קרח להפקת RNA מיידית או לאחסן ב -80 °C (70 °F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח RT-PCR כמותי<ol>
<li>מדוד כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. רנ"א לתמלל לאחור באמצעות ערכת סינתזה של cDNA.</li>
		<li>ערבבו cDNA שווה ערך ל- 5 ננוגרם RNA עם פריימרים קדמיים והופוכים של 200 ננומטר אומתו מראש (טבלה 1) ותערובת מאסטר PCR פלואורסצנטית. הפעל את תגובת qRT-PCR עבור 40 מחזורים ב: 95 °C (70 °F) עבור 15 s, ולאחר מכן 60 °C (60 °F) עבור 60 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>קציר ותיקון האורגנוידים<ol>
<li>מניחים צלחת 48-well על קרח במשך 30 דקות כדי לשחרר את ג'ל מטריצה.</li>
		<li>הסר את מדיית האורגנויד ולהוסיף 400 μL של PBS קר כקרח לכל באר. לאחר מכן, להסיר PBS ולהוסיף 400 μL של פתרון שחזור תאים קר כקרח לכל באר. רוק בעדינות ב 4 °C (5 °F) במשך 30 דקות.</li>
		<li>יש לצפות קצה צינור של 1 מ"ל עם 1% BSA ב-PBS, ולהזרים בעדינות את תכולת הבאר למעלה ולמטה כדי לפרק את ג'ל המטריצה. מעבירים את האורגנוידים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המונח על קרח.</li>
		<li>לשטוף כל באר עם 300 μL PBS + 1% BSA ולהעביר את כל organoids הנותרים לצינורות המתאימים. הסר פתרון שחזור תאים/PBS + BSA מכל צינור. הוסיפו 400 מיקרו-אל של PBS קר כקרח, ולאחר מכן חזרו על הפעולה עם שטיפה נוספת של PBS קרה כקרח.</li>
		<li>הסר PBS ולתקן organoids עם 300 μL קר כקרח 4% PFA (ב 0.1 M PB) במשך 20 דקות, דגירה בטמפרטורת החדר. הסר PFA ולשטוף organoids עם 400 μL קר כקרח PBS.</li>
		<li>הסר PBS; לאחר מכן, להוסיף 400 μL PBS + 1% BSA. יש לאחסן ב-4 °C (75°F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כתמי אימונופלואורסצנטיות<ol>
<li>לשטוף organoids ב 500 μL PBS + 1% BSA. לאחר מכן, אורגנוידים מדגירה בתמיסת חסימה (5% סרום עז או חמור רגיל, 1% אלבומין בסרום בקר, 0.3% Triton X 100 ב- 1x PBS pH 7.3) למשך 2 שעות, נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מוסיפים את תמיסת הנוגדנים העיקרית (נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה) ומנענעים בעדינות במשך 3 לילות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף organoids 4x עבור 1 שעה עם 500 μL PBS + 0.2% טריטון, מתנדנד בעדינות בטמפרטורת החדר. הוסף פתרון נוגדנים משני (נוגדנים משניים מדוללים בתמיסת חסימה) ואורגנוידים סלע לילה, מוגן מפני אור, ב 4 °C (4 °F).</li>
		<li>לשטוף organoids 3x עבור 1 שעה עם 500 μL PBS + 0.2% טריטון, מוגן מפני אור נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר. דגירה עם DAPI מדולל 1:10,000 ב 0.1 M PB במשך 20 דקות, מתנדנד ומכוסה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את organoids 3x במשך 20 דקות עם 0.1 M PB, מתנדנד בעדינות ומכוסה בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבה של אורגנוידים למיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה. הערה: תמונות שלב אחר שלב של תהליך הרכבת השקופיות מוצגות באיור 7.<ol>
<li>צור היקף מרובע בעובי ~1 מ"מ של חימר מידול לא רעיל במגלשת מיקרוסקופ.</li>
		<li>הסר 0.1 M PB מצינור microcentrifuge, בעדינות resuspend organoids ב 100 μL הרכבה אמצעי בחירה; לאחר מכן, להעביר למרכז כיכר החימר.</li>
		<li>ממלאים את ריבוע החימר עד שהמדיום הרכבה כמעט למעלה. לאחר מכן, מניחים כיסויים מרובעים בגודל 22 x 22 מ"מ מעל חימר ולחצו בחוזקה על צידי הכיסוי כדי לאטום. תן לו לרפא על פי הוראות היצרן (כאן, טמפרטורת החדר במשך 1-2 ימים) ולאחסן ב 4 °C (50 °F).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+renewal+in+gustation%3A+new+insights+into+taste+bud+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li>
<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinger%2C+TE+%22The+neurobiology+of+taste+and+smell%22">The neurobiology of taste and smell</a>. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).</li>
<li>Barlow, L. A., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+and+regenerating+a+sense+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Developing and regenerating a sense of taste.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).</li>
<li>Yee, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5-EGFP+marks+taste+bud+stem%2Fprogenitor+cells+in+posterior+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue.</a> Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).</li>
<li>Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog-expressing+basal+cells+are+general+post-mitotic+precursors+of+functional+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).</li>
<li>Deshpande, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-related+alterations+of+taste+function+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review.</a> Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12(2018).</li>
<li>Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+changes+from+cancer+treatment+and+their+effects+on+patients%27+food+behavior%3A+A+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review.</a> Nutrients. 11 (10), 2285(2019).</li>
<li>Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+taste+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Drug-induced taste disorders.</a> Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).</li>
<li>Kumari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+taste+organs+and+sensory+function+after+severe+loss+from+Hedgehog%2FSmoothened+inhibition+with+cancer+drug+sonidegib%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).</li>
<li>Ermilov, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog%2Fgli+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442(2016).</li>
<li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors%2C+differentiated+taste+cells%2C+and+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934(2019).</li>
<li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li>
<li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+taste%3A+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li>
<li>Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of taste.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).</li>
<li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+taste+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mammalian taste perception.</a> Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).</li>
<li>Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stem%2Fprogenitor+cell+cycle+using+murine+circumvallate+papilla+taste+bud+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid.</a> Scientific Reports. 5, 17185(2015).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7, 4004(2017).</li>
<li>Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+inflammatory+cytokine+expression+in+taste+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids.</a> Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+substitutes+for+neuronal+input+for+taste+cell+regeneration+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118(2021).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStaats%2C+J+%22Immunophenotyping%3A+Methods+and+Protocols%22">Immunophenotyping: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
<li>Ekert, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommended+guidelines+for+developing%2C+qualifying%2C+and+implementing+complex+in+vitro+models+%28CIVMs%29+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).</li>
<li>Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVintschgau%2C+Mv+%22Archiv+f%C3%BCr+die+gesamte+Physiologie+des+Menschen+und+der+Tiere%22">Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere</a>. 14, 443-448 (1877).</li>
<li>Liu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Shh+signaling+centers+participate+in+fungiform+papilla+and+taste+bud+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance.</a> Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+kidney+organoids%3A+engineering+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

דיווח כאן היא שיטה יעילה וניתן לחזור בקלות עבור culturing, תחזוקה, ועיבוד organoids לשוני נגזר מתאי גזע טעם עכבר למבוגרים. נמצא כי שימוש בשלושה CVPs מ Lgr5 בן 8 עד 20 שבועות-עכברי EGFP מספיק כדי להשיג ~ 10,000 GFP+ תאים לשימוש ניסיוני, וכתוצאה מכך 50 בארות מצופות בצפיפות של 200 תאים לבאר בלוחות 48-well. הסרת אפיתליה תעלת CVP ממוטבת על ידי הזרקת האפיתל הלינגואלי עם דיספאז II טרי ופתרון קולגנאז מסוג I, ואחריו דגירה של 33 דקות. עם זאת, זמן דגירה קצר יותר, עליקוטים ישנים של אנזימים, מגרשים שונים, או באמצע...

במכרסמים, בלוטות טעם לשוניות שוכנות בפפילות פטריות המופצות בחלק הקדמי, פפילאות עלווה דו-צדדיות אחוריות, כמו גם פפילה אחת (CVP) בקו האמצע posterodorsal של הלשון1. כל בלוטות טעם מורכבת מ-50-100 תאי קולטן טעם קצרי מועד המתחדשים במהירות (TRCs), הכוללים תאי תמיכה דמויי גליה מסוג I, תאי סוג II המזהים מתוקים, מרירים ואומאמי, ותאי סוג III המזהים חמוצים2,3,4. ב- CVP העכבר, LGR5+ תאי גזע לאורך הלמינה הבזלת מייצרים את כל סוגי ה- TRC, כמו גם תאים אפיתל שאינםטעם 5. בעת חידוש שושלת הטעם, תאי הבת של LGR5 מצוינים לראשונה כתאי מבשר טעם פוסט-מיוטי (תאי IV מסוג) המוזנים לבלוטות טעם ומסוגלים להבדיל לכל אחד משלושת סוגי TRC6. המחזור המהיר של TRCs הופך את מערכת הטעם רגישה לשיבושים על ידי טיפולים רפואיים, כולל קרינה וטיפולים תרופתיים מסוימים7,8,9,10,11,12,13. לכן, לימוד מערכת הטעם בהקשר של ויסות תאי גזע טעם ובידול TRC חיוני להבנת כיצד להקל או למנוע תפקוד לקוי של הטעם.
עכברים הם מודל מסורתי למחקרי in vivo במדעי הטעם שכן יש להם מערכת טעם מאורגנת בדומה לבני אדם14,15,16. עם זאת, עכברים אינם אידיאליים עבור מחקרים תפוקה גבוהה, כפי שהם יקרים לתחזוקה זמן רב לעבוד עם. כדי להתגבר על זה, שיטות תרבות האורגנויד במבחנה פותחו בשנים האחרונות. אורגנוידים טעם יכול להיווצר מרקמת CVP מקורית, תהליך שבו organoids ניצן מן האפיתל CVP עכבר מבודד תרבית ex vivo17. אורגנוידים אלה מציגים אפיתל רב שכבתי העולה בקנה אחד עם מערכת הטעם של in vivo. דרך יעילה יותר ליצור organoids שאינו דורש תרבות CVP ex vivo פותחה על ידי רן ואח'בשנת 201418. התאמת שיטות ומדיה תרבית שפותחה לראשונה כדי לגדל organoids מעיים, הם בודדו Lgr5-GFP+ תאי אבות יחידים מ CVP העכבר וציפו אותם בג'ל מטריצה19. תאים בודדים אלה יצרו אורגנוידים לשוניים המתרבים במהלך 6 הימים הראשונים של התרבות, מתחילים להבדיל סביב יום 8, ועד סוף תקופת התרבות מכילים תאים אפיתל שאינם טעם וכל שלושת סוגי TRC18,20. עד כה פורסמו מחקרים רבים המשתמשים במערכת מודל האורגנויד הלינגואלי17,18,20,21,22; עם זאת, שיטות ותנאי תרבות המשמשים ליצירת organoids אלה משתנים בין פרסומים (טבלה משלימה 1). לכן, שיטות אלה הותאמו ומותאמו כאן כדי להציג פרוטוקול סטנדרטי מפורט לתרבות האורגנוידים הלשויים הנגזרים מ- LGR5+ אבות של CVP עכבר מבוגר.
אורגנוידים לשוניים מספקים מודל ייחודי לחקר התהליכים הביולוגיים של התא המניעים את התפתחות והתחדשות תאי הטעם. ככל שהיישומים של אורגנוידים לשוניים מתרחבים ומעבדות נוספות נעות לכיוון ניצול מודלים אורגנוידים במבחנה, חשוב שהתחום ישאף לפתח ולאמץ פרוטוקולים סטנדרטיים לשיפור יכולת הרבייה. הקמת organoids לשוני ככלי סטנדרטי במדעי הטעם תאפשר מחקרי תפוקה גבוהה להקניט לגזרים כיצד תאי גזע בודדים ליצור את התאים המובחנים של מערכת הטעם הבוגרת. בנוסף, אורגנוידים לשוניים יכולים להיות מועסקים כדי לסנן במהירות תרופות עבור השפעות פוטנציאליות על הומאוסטזיס טעם, אשר לאחר מכן ניתן לחקור ביסודיות רבה יותר במודלים בעלי חיים. גישה זו בסופו של דבר תגביר את המאמצים לתכנן טיפולים שישפרו את איכות החיים של מקבלי תרופות עתידיים.

<table><tbody><tr><td><חזק>נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 חמור נגד עזים IgG</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A11056, RRID: AB_142628</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 עז אנטי ארנב IgG</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A11010, RRID:AB_2534077</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 עז אנטי חזיר ניסיונות IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11075, RRID:AB_2534119</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 חמור אנטי ארנב IgG</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A31573, RRID:AB_2536183</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti Rat IgG</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A21247, RRID:AB_141778</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>DAPI (עבור FACS)</td><td>Thermo Fischer</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (לאימונוהיסטוכימיה)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571, RRID:AB_2307445</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>עז אנטי-CAR4</td><td>מו"פ D Systems</td><td>AF2414, RRID:AB_2070332</td><td>1:50</td></tr><tr><td>חזיר ניסיונות נגד KRT13</td><td>Acris נוגדנים</td><td>BP5076, RRID:AB_979608</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ארנב נגד GUSTDUCIN</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-395, RRID:AB_673678</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ארנב נגד NTPDASE2</td><td>CHUQ</td><td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Rat anti-KRT8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-IS, RRID:</td><td>AB_531826 1:100</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D rocker</td><td>Benchmark Scientific Inc.</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>3D מסובב</td><td>מעבדה קו מכשירים</td><td>4630</td><td></td></tr><tr><td>טיימר / שעון עצר גדול</td><td>ספרתי פישר</td><td>S407992</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>CO2 טנק</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>FormaTM סדרה 3 מים Jackeed CO2 אינקובטור</td><td>Thermo Scientific</td><td>4110</td><td>184 L, מלוטש אל חלד דגם</td></tr><tr><td>פלדה Incucyte</td><td>Sartorius</td><td>:</td><td>S3 Cancer Center Cell Technologies משאב משותף, אוניברסיטת קולורדו Anschutz Medical Campus</td></tr><tr><td>MoFlo XDP100</td><td>Cytomation Inc</td><td>דגם: S13211997</td><td>&nbsp; מרכז גייטס זרימה ציטומטריה ליבה, אוניברסיטת קולורדו אנשוץ קמפוס רפואי</td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק סיינטיפיק</td><td>אקסלה E1</td><td></td></tr><tr><td>מערכת PCR בזמן אמת</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>אפנדורף</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>580BR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>דיוק</td><td>51220073</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83 01</td><td>סיגמא</td><td>SML0788-5MG</td><td>ריכוז מלאי 10 מ"מ, סופי ריכוז 500 ננומטר</td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F12</td><td>גיבקו</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>גיבקו</td><td>17504044</td><td>ריכוז מלאי 50X, ריכוז סופי 1X</td></tr><tr><td>ג'נטמיצין</td><td>גיבקו</td><td>15750-060</td><td>ריכוז מלאי 1000X, ריכוז סופי 1X</td></tr><tr><td>גלוטמקס</td><td>גיבקו</td><td>35050061</td><td>ריכוז מלאי 100X, ריכוז סופי 1X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>ריכוז מלאי 100X, ריכוז סופי 1X</td></tr><tr><td>עכברים EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1MG</td><td>ריכוז מלאי 500 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>עכבר, נוגין</td><td>פפרוטק</td><td>250-38</td><td>ריכוז מלאי 50 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 25 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>A9165</td><td>ריכוז מלאי 0.5 מ', ריכוז סופי 1 מ"מ</td></tr><tr><td>ניקוטינמיד</td><td>סיגמא</td><td>N0636-100 גרם</td><td>ריכוז ציר 1 מ', ריכוז סופי 1 מ"מ</td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוס</td><td>גיבקו</td><td>15140-122</td><td>ריכוז מלאי 100X, ריכוז סופי 1X</td></tr><tr><td>פרימוצין</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>ריכוז מלאי 500X, ריכוז סופי 1X</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>מו"פ D Systems</td><td>1264</td><td>ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 0.4 ומיקרו; מדיה</td></tr><tr><td></td><td></td><td>מותנית M WRN</td><td>התקבלה ממעבדת דמפסי (משאב שיתוף אורגנואידים ומידול רקמות של AMC). נגזר מ-L-WRN (ATCC&reg; CRL-3276&סחר;) תאים</td></tr><tr><td>Y27632 דיהידוכלוריד 10ug</td><td>APExBIO</td><td>A3008-10</td><td>ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 10 ומיקרו; M</td></tr><tr><td><חזק>אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק TB</td><td>BD</td><td>מזרק 309659</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול, מינימום 98%</td> <td>סיגמא</td><td>M3148-25ML</td><td>&beta;-מרקפטואתנול</td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2700</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 48 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 אינץ 'פסטר פיפטס</td><td>פישרברנד</td><td>12-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר (BSA)</td> <td>Sigma Life Science</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>מאגר RLT מאגר ליזה</td><td>QIAGEN</td><td>1015750</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת שחזור תאים</td><td>קורנינג</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas מספריים אביב</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מ-Clostridium histolyticum, סוג I</td><td>Sigma Life Science</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME, סוג 2, Pathclear</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Dispase II (פרוטאז ניטרלי, דרגה II)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (רוש)</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>מסננים חד פעמיים</td><td>Sysmex</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חומצי מי מלח pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט עם Ca2+ & Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td> <td>Promega</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>Elastase Lyophilized</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002292</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine</td> Science <td>Tools 14084-08</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solution</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA ערכת סינתזה</td><td>Bio-Rad</td><td>1706691</td><td></td></tr><tr><td>חימר דוגמנות, גריי</td><td>סרג'נט ארט</td><td>22-4084</td><td></td></tr><tr><td>מזרק BD</td> <td>מחט</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר כימיקל</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>נטול מים פישר כימי</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט חד בסיסי</td><td>נטול מים פישר ביוריאגנטים</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VWR מיקרו כיסוי זכוכית</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td>22x22 מ"מ</td></tr></tbody></table>

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

חוש הטעם מתווך על ידי בלוטות טעם על הלשון, אשר מורכבים תאים קולטן טעם מתחדש במהירות (TRCs). מחזור מתמשך זה מופעל על ידי תאי אבות מקומיים והופך את תפקוד הטעם נוטה לשיבוש על ידי שפע של טיפולים רפואיים, אשר בתורו משפיע קשות על איכות החיים. לכן, לימוד תהליך זה בהקשר של טיפול תרופתי חיוני כדי להבין אם וכיצד תפקוד אבות הטעם וייצור TRC מושפעים. בהתחשב בדאגות האתיות ובזמינות המוגבלת של רקמת הטעם האנושית, מודלים של עכברים, שיש להם מערכת טעם דומה לבני אדם, נמצאים בשימוש נפוץ. בהשוואה לשיטות ויוו, שגוזלות זמן רב, יקרות, ולא נוחות למחקרי תפוקה גבוהים, אורגנוידים לשוניים של מורין יכולים לאפשר ניסויים להתנהל במהירות עם שכפולים רבים ופחות עכברים. כאן, פרוטוקולים שפורסמו בעבר הותאמו וגישה שיטה סטנדרטית ליצירת אורגנוידים של טעם מתאי אבות טעם המבודדים מהפאפילה המקיפה (CVP) של עכברים בוגרים. טעם תאי אבות ב- CVP אקספרס LGR5 וניתן לבודדם באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מעכברים הנושאים אלל Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. תאים ממוינים מצופים במערכת תרבית תלת-ממדית מבוססת ג'ל מטריצה ומתרבתים במשך 12 יום. Organoids להרחיב במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות באמצעות התפשטות ולאחר מכן להיכנס לשלב בידול, שבמהלכו הם מייצרים את כל שלושת סוגי תאי הטעם יחד עם תאים אפיתל שאינם טעם. אורגנוידים ניתן לקצור עם ההתבגרות ביום 12 או בכל עת במהלך תהליך הצמיחה עבור ביטוי RNA וניתוח אימונוהיסטוכימי. סטנדרטיזציה של שיטות תרבות לייצור אורגנוידים לשוניים מתאי גזע בוגרים תשפר את הרבייה ותקדם אורגנוידים לשוניים ככלי סינון תרופות רב עוצמה במאבק כדי לעזור לחולים חווים תפקוד לקוי של הטעם.

לעכברים יש CVP אחד, הממוקם בחלק האחורי של הלשון, שממנו ניתן לבודד תאי LGR5+ גזע(איור 1A, קופסהשחורה). הזרקת תמיסת אנזימים מתחת ל- CVP ובסביבתהגורמתלנפיחות קלה של האפיתל והעיכול של רקמת החיבור. עיכול מספיק מושגת לאחר דגירה של 33 דקות, המאפשרת הפרדה קלה של אפיתל CVP מהרקמה הבסיסית. כאשר מנסים לקלף את האפיתל CVP, יש לבצע חתכים במרחק מספיק מה- CVP כדי להבטיח שחפירות לא ישבשו או ייפגעו(איור 1C). זה גם מאפשר אח...

הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoids הם טכנולוגיית במבחנה רבת עוצמה המשמשת לבדיקת תרופות והבנת תהליכים ביולוגיים. לכן, יצירת אורגנוידים שמדגמים את הלשון חיונית לחקר התפתחות תאי הטעם והתחדשות. מחקרי טעם מסורתיים ב-vivo יכולים להיות יקרים וגוזלי זמן רב.פרוטוקול organoid זה מציע חלופה סטנדרטית, לשחזור הממזערת אתגרים אלה תוך מתן אפשרות לניסויי תפוקה גבוהים יותר. לאחר המתת חסד עכבר מבוגר, להשתמש מספריים גדולים סטריליים לחתוך את הלחיים ולשבור את הלסת. לאחר מכן, להרים את הלשון לחתוך את frenulum לשוני להפריד את הלשון מרצפת חלל הפה.חותכים את הלשון ולאסוף אותו ב- dPBS קר כקרח סטרילי עם סידן ומגנזיום. תחת מיקרוסקופ מנתח, להסיר ולהשליך את הלשון השמאלית על ידי חיתוך רק קה-ביניים של הוד מוהר הבין-מאלי עם סכין גילוח. לאחר מכן באמצעות מנגב משימה עדין כדי להסיר כל שיער ונוזל עודף מן הלשון האחורית.לאחר מכן, מלא מזרק מיליליטר אחד עם 200 עד 300 microliters של פתרון אנזימי הזרקה ולהכניס מחט 30 מד חצי אינץ 'רק מעל המעמד הבין מלרי עד רק קהור של papillae circumlate, או CVP. הזריקו את תמיסת האנזים מתחת ובקצוות לרוחב של ה- CVP בין האפיתל לרקמות הבסיסיות. למשוך את המזרק לאט וברצף מן הלשון כמו הפתרון מוזרק.לדגור על הלשון ואת ה- dPBS נטול מגנזיום סטרילי בטמפרטורת החדר למשך 33 דקות בדיוק. באמצעות מספריים חתך דק במיוחד, לעשות חתכים קטנים

generation-culture-lingual-organoids-derived-from-adult-mouse-taste

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

המטרה היא לפתח פרוטוקול לשחזור לבידוד ושמירה לטווח ארוך של תרבויות אנושיות הטעם תאים fungiform גבשושיות. תאים מאדם fungiform גבשושיות מתקבל על ידי ביופסיה נשמרו בהצלחה במשך יותר משמונה קטעים (12 חודשים) בתרבות ללא אובדן הכדאיות.

בידוד והתרבות של האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות

בסרטון זה אנו מתארים את הבידוד של תאי אפיתל מלשון מורין. תאים אלה יכולים להיות תרבית נוספת כדי ליצור מושבות תאים.

בידוד ותרבית תאי אפיתל לשון מורין: הליך לבידוד ותרבית תאי אפיתל לשון ממודל עכבר

בסרטון זה, אנו מתארים את הבידוד של אפיתל פפילות היקפיות (CVP) מלשון מורין.

בידוד אפיתל פפילה היקפית (CVP) ממודל עכבר: הליך אנזימטי להפרדת אפיתל CVP מלשון עכבר

תרביות שמקורן בתאי גזע טומנות בחובן פוטנציאל אדיר למידול מחלות זיהומיות. כאן מתוארת תרבית של אורגנואידים בקיבה של עכברים ובני אדם שמקורם בתאי גזע בוגרים. האורגנואידים מוזרקים במיקרו עם פתוגן הקיבה הליקובקטר פילורי.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

מאמר זה מתאר שיטות להכנת רקמות, כתמים וניתוח של פטריות שלמות, בלוטות טעם וחך המניבות בעקביות בלוטות טעם שלמות ושלמות (כולל סיבי העצבים המעוררים אותן) ושומרות על היחסים בין מבנים בתוך בלוטות הטעם לבין הפפילה שמסביב.

כתמים, הדמיה וניתוח של פטריות, בלוטות טעם של הרכבה מלאה, מקיפים וחיך

פיתחנו פרוטוקול כללי כדי לנתק כמות גדולה של תאים בודדים באיכות גבוהה מן האפיתל ו mesenchyme / רקמת חיבור של לשונות עכבר עובריות ובוגרות.

ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

שיטת תרבית האיברים מסוג טרוול שימשה לפענוח רשתות איתות מורכבות השולטות בהתפתחות השיניים, ולאחרונה לחקר הוויסות המעורב בתאי גזע של חותך העכבר הגדל ללא הרף. מודלים של בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים ושיטות הדמיה חיה מאפשרים ניתוח מעמיק של תאי גזע דנטליים ושל המיקרו-סביבה הנישה הספציפית שלהם.

שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבות של קרטינוציטים אוראליים הנגזרים מחך העכבר הבוגר. כמו כן, דווח על שיטת הערכה באמצעות חיסונים.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.

מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים

כאן אנו מספקים שיטה לשחזור לבחון neurogenesis למבוגרים באמצעות assay neurosphere נגזר מתוך הכלל המוח או מאחד את telencephalic, tectal או אזורים של המוח הקטן של המוח דג הזברה מבוגר. בנוסף, אנו מתארים את ההליך כדי לתפעל ביטוי גני neurospheres דג הזברה.

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

למדו פרוטוקול סטנדרטי ליצירת אורגנוידים לשוניים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר. השיטה מאפשרת מחקר מהיר ורבי-פלט של פיתוח תאי טעם ורегенרציה במעבדה.

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

גלה סרטונים נוספים