Name: עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: למדו כיצד לקבוע מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה אטומית מננו-גבישים של מולקולות קטנות באמצעות MicroED. הפרוטוקול מדגים הכנת דגימות קרבמזפין והקפאה קריוגנית בפחות מ-30 דקות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מעבדת גונן נתמכת על ידי כספי המכון הרפואי הווארד יוז. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות P41GM136508.

1. הכנת דגימות מולקולות קטנות
<ol><li>העבירו כמות קטנה (0.01 - 1 מ"ג) של אבקה, נוזל או מוצקים לבקבוקון קטן או לצינור.</li>
	<li>עבור דגימות שכבר נמצאות בצורת אבקה, אטמו את הצינורית באמצעות המכסה עד שיהיה צורך בדגימה. יבשו את דגימות הנוזלים לאבקות לפני ניסיונות בשיטה 1 (שלב 3) או 2 (שלב 4). הערה: דגימות מומסות בנוזל עשויות להשתמש בשיטה 3 (5.X) להלן</li>
</ol>2. הכנת רשתות TEM
הערה: רכיבי TEM מסוימים עם מערכות טוען אוטומטי דורשים לגזור את הרשתות ולהכניס אותן לקלטת לפני הטעינה לעמודה TEM. חיתוך כרוך באבטחה פיזית של רשת TEM 3 מ"מ לתוך טבעת מתכת כי autoloader יכול לתפעל. שלב זה והשלבים הבאים יכולים להתבצע באמצעות רשתות TEM רגילות, או רשתות TEM שנחתכו. עבור ניסויים אלה, לעתים קרובות קל יותר לתפעל את הרשתות אם הן נחתכו מראש.
<ol><li>עטפו סרט פלסטיק סביב קצה אחד של שקופית כיסוי זכוכית.</li>
	<li>הניחו את רשתות ה-TEM על סרט הצילום בחלק העליון של שקופית הכיסוי כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה. זהה את שני צידי הרשת תחת אור. צד הנחושת זוהר ונראה מתכתי, ואילו צד הפחמן נראה בצבע חום אפרורי (איור 1C,D). עבור רשתות חתוכות, צד הפחמן צריך לפנות למשטח השטוח של טבעת הקליפ.</li>
	<li>מקם את השקופית עם הרשתות בתא הפריקה הזוהר. זוהר פורק את הכיסוי למשך כ- 30 שניות באמצעות ההגדרה השלילית ב- 15 pA. אחסנו את הרשתות על שקופית הכיסוי בתוך צלחת פטרי מזכוכית מרופדת בנייר סינון לפני הוספת דוגמה לרשתות.</li>
</ol>3. מריחת דגימה על רשתות על ידי יצירת אבקה עדינה הומוגנית (שיטה 1)
<ol><li>הסר רשת TEM משוחררת זוהרת מצלחת הפטרי המכוסה באמצעות פינצטה. הניחו את הרשת על נייר מסנן עגול כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>בעזרת מרית קטנה, מוציאים כף מדידה קטנה מאוד של אבקה (כ-0.1 מ"ג) ומניחים אותה על מכסה זכוכית קטן ומרובע ממש ליד רשת TEM על נייר הסינון. מניחים עוד מגלשת זכוכית מרובעת קטנה או מכסה על גבי האבקה.</li>
	<li>בעזרת האצבעות, שפשפו בעדינות את שתי מגלשות הזכוכית זו בזו ליצירת אבקה דקה.</li>
	<li>סובבו את החלקות הכיסויים בזווית ומקמו אותן ממש מעל רשת ה-TEM על נייר הסינון והמשיכו לשפשף את הכיסויים זה בזה, רק כמה סנטימטרים מעל רשת ה-TEM המשוחררת הזוהרת (איור 1).</li>
	<li>התבונן כדי לראות אם האבקה נופלת לכיוון הרשת. חשוף את האבקה הטחונה דק על ידי הסרת אחד משני כיסויי הזכוכית. הברישו בעדינות את האבקה העדינה מהמכסה באמצעות פיסת נייר סינון לרשת TEM (איור 1).</li>
</ol>4. החלת דגימה על רשתות על ידי יישום שיטת "טלטול" (שיטה 2)
<ol><li>תפוס רשת באמצעות זוג פינצטה ושחרר אותה לתוך בקבוקון או שפופרת של דגימת אבקה. סגרו את הבקבוקון באמצעות מכסה הפלסטיק כדי להבטיח שאף חומר לא יברח בעת טלטול.</li>
	<li>תופסים את הבקבוקון ביד, מנערים את הבקבוקון כך שהאבקה והרשת נעות שתיהן במשך כ 10 - 30 שניות.</li>
	<li>רוקנו את תכולת הבקבוקון על נייר סינון עגול. תופס את הרשת בקצה, מקיש בעדינות על קצה הרשת על נייר הסינון כדי להסיר חומר עודף מהרשת. הערה: בהתאם לסוג הבקבוקון ולגודלו, ניתן גם להשתמש בפינצטה כדי להסיר את רשת TEM מבלי לרוקן את התוכן.</li>
</ol>5. החלת דגימה על רשתות בשיטת האידוי (שיטה 3)
<ol><li>הניחו רשת (חתוכה או לא) על מרכזה של פיסת נייר פילטר עגולה, כאשר צד הפחמן פונה כלפי מעלה וצד הנחושת פונה כלפי מטה.</li>
	<li>בעזרת מזרק אטום לגז בגודל 10 μL, יש למרוח טיפה קטנה (בערך 1-3 מיקרוליטר) של תרכובת מומסת על צד הפחמן של הרשת.</li>
	<li>העבירו בעדינות את נייר הסינון עם הרשתות לתוך תא ייבוש ואקום. מכסים את החדר ומדליקים את הוואקום. השאירו את הרשתות תחת ואקום לייבוש עד יום אחד.</li>
	<li>כבו את השואב ואפשרו לתא להתאוורר למשך 5 דקות. אוורור התא מונע מהרשתות לזוז או לעוף כאשר הוא חשוף.</li>
</ol>6. הקפאה וטעינה של רשתות לתוך TEM
<ol><li>תפוס את קצה רשת TEM באמצעות קבוצה של פינצטה, וודא שהקצוות אינם מנקבים אף אחד מריבועי הרשת. הרם את הרשת 1-2 ס"מ מעל נייר הסינון וסובב את הרשת בזווית של 90° לנייר שמתחת. טפחו בעדינות על הפינצטה תוך שמירה על הפינצטה הדוקה ברשת כדי להסיר אבקה רופפת.</li>
	<li>מקפיאים את הרשת על ידי הזזת קצה הפינצטה עם הרשת ישירות לתוך מיכל חנקן נוזלי ביד. מיכל זה הוא בדרך כלל תחנת טעינת הרשת עבור TEM, אך יכול להיות כל מיכל בטוח, כגון תרמוס בטוח לחנקן נוזלי, מקובל להעברה או אחסון. חנקן נוזלי הוא -196 °C.</li>
	<li>חכו עד שהרשת והפינצטה יפסיקו לרתוח לפני מניפולציות נוספות.</li>
	<li>תחת חנקן נוזלי או באדי חנקן, הניחו את הרשת במחזיק הדגימה עם כיוון צד הפחמן, כך שהדגימה תיפגע על ידי הקרן לפני סרט התמיכה בפחמן.</li>
	<li>טען את מחזיק הדגימה לתוך TEM כדי להבטיח שהרשת נשמרת בטמפרטורות חנקן נוזלי בכל עת.<ol><li>עבור מערכות טוען אוטומטי, מקם את הרשתות החתוכות לתוך קלטת במיכל מקורר חנקן נוזלי. קלטת זו מועברת למיכל תריס המאפשר לרובוטיקה של המעמיס האוטומטי לקבל את הקלטת תוך שמירה על הדגימות בטוחות למעבר בין הטוען האוטומטי לעמודה.</li>
		<li>עבור הגדרות TEM לכניסה צדדית, אבטח את הרשת למחזיק TEM מסחרי בכניסה צדדית. למחזיקים אלה יש מיכל להכנת דגימה המלא בחנקן נוזלי כדי לאפשר העברת הרשת למחזיק מבלי לחמם את הדגימה. מחזיק הכניסה הצדדית מוכנס ל- TEM ישירות עם הדגימה המאובטחת בסוף.</li>
	</ol></li>
</ol>7. איסוף נתוני MicroED
<ol><li>איתור וסינון ננו-גבישים<ol><li>פתח את שסתומי העמודה TEM. התאימו את ההגדלה באמצעות לוחות היד להגדלה הנמוכה ביותר האפשרית. מצא את הקרן על ידי התאמת ידית העוצמה בלוחות היד כך שאזור עגול ובהיר ייראה על מסך הפלואורסצנט.</li>
		<li>קח אטלס של כל הרשת בהגדלה נמוכה (50 - 300x) באמצעות תוכנה מתאימה14,15,16 (איור 2). ודא שהמיקרוסקופ מיושר היטב להדמיית הגדלה נמוכה וגבוהה לפני איסוף נתוני MicroED ברזולוציה גבוהה.</li>
		<li>זהו ריבועי רשת ללא פחמן שבור, ויש להם חומר/גרגרים שחורים או כהים גלויים על היריעה (איור 2). נווטו ברחבי הרשת, בין אם באמצעות הג'ויסטיק שעל לוחות היד, או באופן וירטואלי באטלס שנאסף, על מנת לחפש ריבועי רשת שאינם שבורים ומכילים מיקרו-גבישים.</li>
		<li>הוסף את המרכז של כל אחד מהריבועים הללו לרשימת מיקומי הרשת לצורך בדיקה. ניתן להוסיף מיקומים אלה למחשב נייד, בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה לאוטומציה של מיקרוסקופ.</li>
		<li>הגדל את ההגדלה ל- 500-1,300x והתאם את הגובה האוצנטרי בכל מיקום רשת מאוחסן ועדכן את ערך Z שנשמר למיקומים שצוינו ב- 7.1.4.</li>
		<li>חפש במסך הפלואורסצנטי או במצלמה מהירה בהגדלה גבוהה זו אחר כתמים שחורים/גרגרים קטנים על הרשת. מדגם טוב עם לעתים קרובות יש קצוות חדים בהגדלה גבוהה, מה שמרמז על סדר גבישי.</li>
		<li>הזז גביש פוטנציאלי ממוקם למרכז המסך והגדל את ההגדלה כך שה- TEM ייכנס למצב הגדלה גבוהה. הערה: מצב זה מכונה מצב הגדלה גבוהה, Zoom2 או SA במכשירים שונים ובדרך כלל מתאים להגדלות של פי 3,000 ומעלה.</li>
		<li>הוספת מפתח צמצם של אזור שנבחר. שנו את הצמצם לגודל גדול או קטן יותר כדי להבטיח שהאזור שנבחר פשוט גדול יותר מהגביש (איור 3).</li>
		<li>עבור למצב עקיפה על ידי לחיצה על לחצן העקיפה בלוחות היד של TEM, וודא שמסך הפלואורסצנט מוכנס. כוונן את אורך המצלמה באמצעות ידית ההגדלה כך שהקצה יהיה ברזולוציה של 1 Å לפחות. הערה: כיול אורכי העקיפה צריך להתבצע על ידי מהנדס שירות באמצעות סורג וופל זהב או דגימה ידועה לפני ניסיון ניסויי MicroED.</li>
		<li>התאימו את מוקד העקיפה כך שהנקודה המרכזית תהיה חדה וקטנה ככל האפשר. באמצעות ידיות היסט העקיפה, הזז את הקרן המרכזית למרכז המסך הפלואורסצנטי</li>
		<li>הכנס את מעצור הקרן וודא שהקרן נמצאת מאחוריה. הרם את מסך הפלואורסצנט. בצעו חשיפה קצרה (כשנייה אחת) במצלמה (איור 4).</li>
		<li>בדוק את דפוס העקיפה המתאים. מועמד טוב לאיסוף מערך נתונים מלא יהיה בעל נקודות חדות המסודרות באופן קבוע בעמודות ובשורות, והעקיפה תתרחב מעבר ל-2 Å, רצוי לפחות עד 1 Å (איור 4). שמור את קואורדינטות הגביש בממשק המשתמש של TEM או על-ידי כתיבתן.</li>
		<li>בדיקת עקיפה חוזרת עבור כל הגבישים הפוטנציאליים המעניינים בריבוע הרשת הנוכחי.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף נתונים<ol><li>מרכז גביש מוקרן על המסך בהגדלה גבוהה (> פי 1,000). כוונן את הגובה האוצנטרי של הגביש באמצעות שגרה אוטומטית או ידנית.</li>
		<li>הכנס את מפתח הצמצם שנבחר המתאים ביותר לגודל ולצורה של הגביש כפי שנקבע ב- 7.1.8 (איור 3). הטו את הבמה בכיוון השלילי והחיובי עד שהתמונה תוסתר על-ידי פסי הרשת (איור 3). שים לב לזוויות אלה למטרות איסוף נתונים.</li>
		<li>קבע את מספר המסגרות שיידרשו כדי לפרוס את הטריז הזוויתי הכולל של ערכת הנתונים. אופייני להשתמש בטריזים של 0.5 - 1.0 ° עבור כל פריים, כאשר הפריימים נקראים כל 1 עד 5 שניות בהתאם לרגישות המצלמה. לדוגמה, טריז המשתרע בין -30° ל- +30°, המסתובב בקצב קבוע של 1° s-1 עם מסגרת המוקראת, כל 1 שניות, ידרוש 60 מסגרות בסך הכל.</li>
		<li>בהתחשב בטווח ההטיה הכולל המרבי של -72° עד +72°, התחל לסובב את הבמה בקצב קבוע של 1° s-1 ולאחר מכן התחל לקרוא את הנתונים כל 1s במצלמה מודרנית עם מצב קריאת תריס מתגלגל (סרט 1). תהליך זה יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות תוכנה ספציפית TEM.<ol><li>הגדר את קצב הסיבוב על ידי ציון % ממהירות ההטיה המרבית ומתי לעצור בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה ייעודית. בחקירה זו, זה נמדד להיות 0.3° s-1 עבור כל % של מהירות מקסימלית, אבל יהיה צורך לאמת באופן עצמאי עבור כל מיקרוסקופ. הערה: איסוף נתוני ההטיה והמצלמה מוגדרים כאן באופן עצמאי, אך תוכנות14 יכולות לתאם זאת כדי לפשט את התהליך.</li>
			<li>יש להשליך כ-1° מכל צד של הטריז שצוין ברוב המקרים כזמן מת, שבו השלב עולה או מאט למהירות הסיבוב הרצויה.</li>
		</ol></li>
		<li>שמור נתונים במגוון תבניות כמסגרות נפרדות או כערימת תמונות (סרט 1).</li>
		<li>המר מסגרות עקיפה אלה לפורמט קריסטלוגרפי טיפוסי באמצעות כלי MicroED -זמין כאן (https://cryoem.ucla.edu). תמונות עקיפה הנשמרות בפורמט SMV מעובדות בקלות באמצעות תוכנה קריסטלוגרפית מתועדת17,18.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li>
<li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li>
<li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A+Foundations+and+Advances%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109(2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li>
<li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li>
<li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li>
<li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-%C3%A5ngstr%C3%B6m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li>
<li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li>
<li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+with+SerialEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+catalase+determined+by+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600(2014).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכנת דגימה היא בדרך כלל תהליך איטרטיבי, שבו אופטימיזציות נעשות לאחר מפגשים של סינון ואיסוף נתונים. עבור דגימות של מולקולות קטנות, לעתים קרובות זה נבון לנסות תחילה להכין את הרשת מבלי לפרוק זוהר ברשתות, שכן תרופות רבות נוטות להיות הידרופוביות10,11. אם ברשתות יש מעט מדי משקעים ננו-גבישיים, כדאי לנסות שוב לאחר פריקת הזוהר הראשונה של הרשתות. ייתכן שהגבישים מאבקות ליופיליות גדולים ועבים מכדי לאסוף נתונים טובים. במקרים אלה, ייתכן שניתן יהיה לאסוף נתונים מקצה או מחלק דק ...

עקיפה אלקטרונית מיקרוקריסטלית (MicroED) היא שיטת קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים (cryo-EM) לקביעת מבני רזולוציה אטומית מגבישים בגודל תת-מיקרומטרי 1,2. גבישים מיושמים על רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטיות (TEM) ומוקפאים על ידי צלילה לתוך אתאן נוזלי או חנקן נוזלי. לאחר מכן נטענות רשתות לתוך TEM הפועל בטמפרטורות קריוגניות. הגבישים ממוקמים על הרשת ומוקרנים לאיכות עקיפה ראשונית. סיבוב רציף נתוני MicroED נאספים מתת-קבוצה של הגבישים המוקרנים, כאשר הנתונים נשמרים באמצעות מצלמה מהירה כסרט3. סרטים אלה מומרים לפורמט קריסטלוגרפי סטנדרטי ומעובדים באופן כמעט זהה לניסוי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן4.
MicroED פותחה במקור כדי לחקור מיקרו-גבישים חלבוניים 1,2. צוואר בקבוק בקריסטלוגרפיה של חלבונים הוא גידול גבישים גדולים ומסודרים היטב עבור ניסויי עקיפה מסורתיים של קרני רנטגן סינכרוטרון. מכיוון שאלקטרונים מתקשרים עם חומר בסדרי גודל חזקים יותר מקרני רנטגן, מגבלות גודל הגביש הדרושות ליצירת עקיפה ניתנת לגילוי קטנות בהרבה5. בנוסף, היחס בין אירועי פיזור אלסטיים לבלתי אלסטיים הוא חיובי יותר עבור אלקטרונים, מה שמרמז על כך שניתן לאסוף נתונים שימושיים יותר עם חשיפה כוללת קטנה יותר5. התפתחויות בלתי פוסקות אפשרו איסוף נתוני MicroED מהמיקרו-גבישים המאתגרים ביותר 6,7,8,9.
לאחרונה, MicroED הוכח ככלי רב עוצמה לקביעת המבנים של תרופות מולקולות קטנות מחומרים אמורפיים לכאורה 10,11,12,13. אבקות אלה יכולות להגיע היישר מבקבוק של מגיב קנוי, עמוד טיהור, או אפילו מריסוק גלולה לאבקה דקה10. אבקות אלה נראות אמורפיות בעין, אך עשויות להיות מורכבות לחלוטין מננו-גבישים או פשוט מכילות כמויות זעירות של משקעים ננו-גבישיים בחלק גדול יותר שאינו גבישי, אמורפי. היישום של החומר ברשת הוא קל, והשלבים הבאים של זיהוי, סינון ואיסוף נתונים עשויים אפילו להיות אוטומטיים בעתיד הקרוב14. בעוד שאחרים עשויים להשתמש בשיטות שונות להכנת דגימות ואיסוף נתונים, כאן מפורטים הפרוטוקולים שפותחו ושימשו במעבדת גונן להכנת דגימות של מולקולות קטנות עבור MicroED ואיסוף נתונים.

<table><tbody><tr><td>0.1-1.5 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-282-300</td><td>כל בקבוקון או צינור יתאים.</td></tr><tr><td>מהדקי Autogrid</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036173</td><td>רשתות חתוכות אינן נדרשות עבור MicroED. הם נדרשים עבור Thermo-Fisher TEMs המצוידים במערכת טעינה אוטומטית.</td></tr><tr><td>טבעות C Autogrid</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazapine</td><td>Sigma</td><td>C4024-1G</td><td>כל כמות תספיק לניסויים אלה</td></tr><tr><td>גלאי מבוסס CMOS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>CetaD 16M</td><td>השתמשנו ב-CetaD 16M, אך כל גלאי עם מצב תריס מתגלגל או קריאה מהירה מספיק מקובל.&nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת Delphi</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>תוכנה במערכות Thermo-Fisher TEM המאפשרת סיבוב ידני של שלב הדגימה</td></tr><tr><td>תוכנת EPU-D</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>תוכנה מסחרית לרכישת נתוני MicroED</td></tr><tr><td>שקופיות כיסוי זכוכית</td><td>Hampton</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Glow מפרק Pelco</td><td></td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>High Precision פינצטה</td><td>EMS</td><td>78325-AC</td><td>כל פינצטה ברמת דיוק גבוהה תעשה</td></tr><tr><td>כלי חנקן נוזלי</td><td>Spear Lab</td><td>FD-800</td><td>כלי קצף סטנדרטי לטיפול בדגימות תחת חנקן נוזלי - 800 מ"ל</td></tr><tr><td>תוכנת SerialEM</td><td>UC Boulder</td><td>N/A</td><td>תוכנה חינמית המופצת על ידי D. Mastronarde. המחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית</td></tr><tr><td>רשתות TEM</td> רשתות <td>רשת Quantifoil/EMS</td><td></td> Q310CMA-Multi-A <td>300 שימשו כאן, אך כל רשתות פחמן דקות יעבדו. עבור מולקולות קטנות אלה, אנו מציעים להתחיל עם פחמן רציף.&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>Talos Arctica</td><td></td></tr><tr><td>Whatman נייר סינון עגול</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>90 מ"מ ומעלה</td></tr></tbody></table>

עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

מתואר פרוטוקול מפורט להכנת דגימות מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים (MicroED). MicroED פותחה כדי לפתור מבנים של חלבונים ומולקולות קטנות באמצעות ציוד קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים סטנדרטית (cryo-EM). בדרך זו, מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה נקבעו לאחרונה לרזולוציות גבוהות. פרוטוקולים מוצגים כאן להכנת רשתות של תרופות מולקולות קטנות באמצעות התרופה carbamazepine כדוגמה. מוצגים פרוטוקולים לסינון ואיסוף נתונים. שלבים נוספים בתהליך הכולל, כגון שילוב נתונים, קביעת מבנה וחידוד מוצגים במקום אחר. הזמן הדרוש להכנת רשתות המולקולות הקטנות מוערך בפחות מ-30 דקות.

MicroED היא שיטת cryoEM הממנפת את האינטראקציות החזקות בין אלקטרונים לחומר, המאפשרת חקירה של גבישים קטנים נעלמים12,13. לאחר שלבים אלה, צפוי להיות סרט עקיפה בפורמט קריסטלוגרפי שנאסף ממיקרו-גבישים (סרט 1). כאן, הטכניקה מודגמת באמצעות carbamazepine12. התוצאות מראות מערך נתונים MicroED של סיבוב רציף ממיקרו-גביש קרבמזפינים שזוהה ברשת TEM (סרט 1). למערך נתונים טוב יש נקודות חזקות וברורות שאינן נמרחות או מפוצלות, ...

במאמר זה אנו מתארים את ההליכים שפותחו במעבדה שלנו להכנת אבקות של גבישי מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים במיקרו-גבישים (MicroED).

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

בהליך זה, אנו מראים כיצד להתקדם מאבקה מולקולה קטנה למבנה תלת ממדי בתוך דקות. זוהי טכניקה טרנספורמטיבית עבור קהילת הכימיה. תרכובות רבות אינן גדלות בקלות לגבישים גדולים.בעזרת MicroED אנו יכולים לקבוע מבני רזולוציה אטומית מגבישים בגודל ננומטרי. מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר מייק מרטינוביץ', פרופסור באוניברסיטת UCLA. כדי להתחיל, להעביר כמות קטנה של אבקה, נוזל או מוצקים לתוך בקבוקון קטן או צינור.עבור דגימות שכבר נמצאות בצורת אבקה, אטמו את הצינורית באמצעות המכסה עד שיהיה צורך בדגימה. באופן דומה, יבשו את דגימות הנוזל לאבקות. עטפו סרט פלסטיק סביב קצה אחד של שקופית כיסוי זכוכית.הניחו את רשתות ה-TEM על סרט הצילום מעל שקופית הכיסוי, כאשר צד הפחמן בצבע חום פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מקם את השקופית עם הרשתות לתוך תא הפריקה הזוהר וזוהר פרוק את שקופית הכיסוי למשך כ- 30 שניות באמצעות ההגדרה השלילית ב- 15 פיקואמפר. אחסנו את הרשתות בשקופית הכיסוי בתוך צלחת פטרי מזכוכית מרופדת בנייר פילטר לפני הוספת הדגימה לרשתות.הסר את רשת TEM פריקת הזוהר מצלחת הפטרי המכוסה באמצעות פינצטה והנח אותה על נייר סינון עגול כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה. בעזרת מרית קטנה, הסירו כף מדידה קטנה מאוד של אבקה והניחו אותה על משטח זכוכית מרובע קטן ממש ליד רשת TEM על נייר הסינון. הניחו עוד מגלשת זכוכית מרובעת קטנה או החליקו על גבי האבקה.בעזרת האצבעות, שפשפו בעדינות את שתי מגלשות הזכוכית זו בזו ליצירת אבקה דקה. סובב את החלקות הכיסוי בזווית ומקם אותן ממש מעל רשת TEM על נייר הסינון והמשך לשפשף את החלקות הכיסוי זו בזו רק כמה סנטימטרים מעל רשת ה-TEM המשוחררת הזוהרת. שימו לב אם האבקה נופלת לכיוון הרשת.חשוף את האבקה הטחונה דק על ידי הסרת אחת משתי החלקות כיסוי הזכוכית. לאחר מכן הברישו בעדינות את האבקה העדינה מהמכסה אל רשת TEM באמצעות פיסת נייר פילטר. תפוס את קצה רשת TEM באמצעות סט של פינצטה, וודא שהקצוות אינם מנקבים אף אחד מריבועי הרשת.הרם את הרשת סנטימטר עד שני סנטימטרים מעל נייר הסינון וסובב את הרשת בזווית של 90 מעלות לנייר שמתחת. טפחו בעדינות על הפינצטה תוך שמירה על הפינצטה הדוקה ברשת כדי להסיר אבקה רופפת. מקפיאים את הרשת על ידי הזזת קצה הפינצטה עם הרשת ישירות לתוך מיכל חנקן נוזלי ביד וממתינים עד שהרשת והפינצטה יפסיקו לרתוח.תחת חנקן נוזלי, מקם את הרשת במחזיק הדגימה עם כיוון צד הפחמן כך שהדגימה תיפגע על ידי הקרן לפני סרט תמיכת הפחמן. טען את מחזיק הדגימה לתוך TEM כדי להבטיח שהרשת נשמרת תמיד בטמפרטורות חנקן נוזלי. עבור מערכות טעינה אוטומטיות, מקם את הרשתות החתוכות לתוך קלטת במיכל מקורר חנקן נוזלי, המאפשר לרובוטיקה של המעמיס האוטומטי לקבל את הקלטת תוך שמירה על הדגימות בטוחות למעבר בין המעמיס האוטומטי לעמודה.פתח את שסתומי עמודת TEM והתאם את ההגדלה באמצעות לוחות היד להגדלה הנמוכה ביותר האפשרית. מצא את הקרן על ידי התאמת ידית העוצמה בלוחות היד כך שאזור בהיר עגול ייראה על מסך הפלואורסצנט. קח אטלס רשת שלם בהגדלה נמוכה באמצעות תוכנה מתאימה המבטיחה שהמיקרוסקופ מיושר היטב להדמיית הגדלה נמוכה וגבוהה לפני איסוף נתוני MicroED ברזולוציה גבוהה.זהה ריבועי רשת ללא פחמן שבור וגרגרים שחורים או כהים גלויים על סרט הצילום. נווט ברחבי הרשת באופן פיזי באמצעות הג'ויסטיק על לוחות היד או באופן וירטואלי באטלס שנאסף כדי לחפש ריבועי רשת שאינם שבורים ומכילים מיקרו גבישים. הוסף את המרכז של כל אחד מהריבועים הללו לרשימת מיקומי רשת לחקירה, שניתן להוסיף למחברת בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנת אוטומציה של המיקרוסקופ.הגדר את ההגדלה בין 500 ל- 1300x. התאם את הגובה המרכזי בכל מיקום רשת מאוחסן ועדכן את ערך z שנשמר למיקומים שצוינו. חפש במסך הפלואורסצנטי או במצלמה שטוחה אחר כתמים שחורים קטנים או גרגרים על הרשת.מדגם טוב יהיה לרוב בעל קצוות חדים בהגדלה גבוהה המרמזים על גביש בסדר. הזז גביש פוטנציאלי ממוקם למרכז המסך והגדל את ההגדלה כך שה- TEM ייכנס למצב הגדלה גבוהה. הכנס מפתח צמצם של אזור שנבחר ושנה את הצמצם לגודל גדול או קטן יותר כדי להבטיח שהאזור שנבחר גדול יותר מהגביש.עבור למצב שבירה על ידי לחיצה על לחצן השבירה בלוחות היד של TEM כדי להבטיח שמסך הפלואורסצנט יוכנס. כוונן את אורך המצלמה באמצעות ידית ההגדלה כך שהקצה יהיה ברזולוציית אנגסטרום אחת לפחות. התאימו את מוקד העקיפה כך שהנקודה המרכזית תהיה חדה וקטנה ככל האפשר.באמצעות ידיות היסט העקיפה, הזז את הקרן המרכזית למרכז המסך הפלואורסצנטי. הכנס את מפסיק הקרן וודא שהקרן נמצאת מאחוריה. הרם את מסך הפלואורסצנט וצלם חשיפה קצרה במצלמה.בדוק את תבנית השבירה המתאימה, וודא שלתבנית יהיו כתמים חדים המסודרים באופן קבוע בעמודות ובשורות. שמור את קואורדינטות הגביש בממשק המשתמש TEM או על ידי כתיבתן, ולאחר מכן חזור על סינון עקיפה עבור כל הגבישים הפוטנציאליים המעניינים בריבוע הרשת הנוכחי. מרכז את הגביש המוקרן בהגדלה הגדולה מ- 1000x וכוונן את הגובה המרכזי של הגביש באמצעות שגרה אוטומטית או ידנית.הכנס את מפתח הצמצם שנבחר המתאים ביותר לגודל ולצורה של הגביש. הטו את הבמה בכיוון השלילי והחיובי עד שהתמונה תוסתר על-ידי פסי הרשת. ושים לב לזוויות אלה למטרות איסוף נתונים על ידי קריאת הנתונים כל שנייה אחת במצלמה מודרנית עם מצב קריאת תריס מתגלגל.הגדר את קצב הסיבוב על ידי ציון אחוז ממהירות ההטיה המרבית ומתי לעצור בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה ייעודית. שמור את הנתונים במגוון תבניות, אומר מסגרות בודדות או כערימת תמונות. סרט שבירה בפורמט קריסטלוגרפי שנאסף ממיקרו-גבישים מראה מערך נתונים MicroED של סיבוב רציף ממיקרו-גביש קרבמזפין שזוהה ברשת TEM.לאחר פתרון איסוף, אינטגרציה ומבנה נתונים, נקבע מבנה ברזולוציה גבוהה ובהירותו תלויה באיכות ובשלמות הנתונים. החלת הדגימה על הרשת היא קריטית להשגת נתונים טובים. בעקבות שיטה זו, ניתן להמשיך ולעבד את הנתונים באמצעות תוכנה קריסטלוגרפית סטנדרטית.הוכחת העובדה ש-MicroED היא שיטה רבת עוצמה למולקולות קטנות פתחה את השימוש בה ברחבי העולם לפתרון מבנים חדשים של מולקולות בעלות חשיבות קריטית.

microcrystal-electron-diffraction-of-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מאמר זה מספק שיטה מפורטת לאפיין מיקרו של חומרים אולטרה-קפדניים nanocrystalline באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מצויד במערכת backscatter אלקטרון השתברות סטנדרטי. סגסוגות מתכת ומינרלים הצגת microstructures מעודן מנותחים באמצעות טכניקה זו, המציגה את מגוון היישומים האפשריים.

אפיון של אולטרה-קפדניים Nanocrystalline חומרים באמצעות דיפרקציה הילוכים קיקוצ&#39;י

פרוטוקול מוצג עבור קריסטלוגרפיה רנטגן באמצעות microcrystals חלבון. שתי דוגמאות ניתוח vivo- microcrystals מגודלים לאחר טיהור או תאמול מושווים.

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

נתאר ניסוי שתוכנן כדי לחקור את הנזק אלקטרונית המושרה ב nanocrystals של Buckminsterfullerene (C60) על-ידי פולסים הפמטו-שנייה אינטנסיבי, קרני רנטגן. בניסוי נמצא כי, באופן מפתיע, במקום להיות סטוכסטי, הרנטגן המושרה אלקטרון דינמיקה ב C60 נמצאים בקורלציה גבוהה, הנמשך לאורך מאות תאים יחידה בתוך גבישים1.

מדידות של מתאמים אלקטרונית לטווח ארוך במהלך הניסויים עקיפה הפמטו-שנייה מתבצע על Nanocrystals של Buckminsterfullerene

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לפברק ופועלים microfluidic התקנים עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. בנוסף, הוא מתאר כיצד לפקח התגבשות חלבונים על ידי פיזור אור דינאמי וקיבלתי כיצד לעבד ולנתח נתונים עקיפה.

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

אנו מתארים מלכודת הפרעות לקרן החלקיקים אמורה לבצע רנטגן מימדי מהיר פלורסצנטיות, רנטגן microdiffraction מיפוי של דגימות קריסטל או אבקת יחיד באמצעות לאווה (קרינה צבעוני) או אבקת (קרינה מונוכרומטי) עקיפה. המפות וכתוצאה מכך נותנים מידע על זן, התמצאות, שלב ההפצה דפורמציה פלסטית.

סינכרוטרון Microdiffraction רנטגן והדמיה זריחה של דגימות הסלע המינרלים

מוצג כאן פרוטוקול לתיוג חלבוני קרום בתאים יונקים וציפוי המדגם עם גרפן למיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקה שלב נוזלי. היציבות של הדגימות נגד הנזק שנגרם על ידי קרינה יכול גם נחקר עם פרוטוקול זה.

מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי

אנו מספקים מתווה כללי של שיטות מיקרואנליזה כמותית להערכת תפוסות האתר של זיהומים ומצביהם הכימיים על ידי ניצול תופעות תקשור אלקטרונים בתנאי נדנדה קרן אלקטרונים תקרית, אשר באופן אמין לחלץ מידע ממיני מיעוט, יסודות אור, משרות פנויות חמצן, ופגמים אחרים נקודה / קו / מישור.

ניתוח כמותי של אתר אטומי של דופנטים פונקציונליים/פגמים נקודתיים בחומרים גבישיים על ידי מיקרואנליזה משופרת של תקשור אלקטרונים

יחס אות לרעש של נתונים הוא אחד השיקולים החשובים ביותר בביצוע מדידות עקיפה של קרני רנטגן ממיקרו-קריסטלים. קו הקרן VMXm מספק סביבה עם רעש נמוך ומיקרואורגניזם לניסויים כאלה. כאן, אנו מתארים שיטות הכנה לדוגמה עבור microcrystals הרכבה וקירור עבור VMXm וקווי קרן קריסטלוגרפיה מיקרומוקולריים אחרים.

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת מדגם קריוגני והעברת גבישים לתוך תחנת הקצה ואקום על קו קרן I23 במקור אור יהלום, לניסויים קריסטלוגרפיה באורך גל ארוך רנטגן מקרומולקולרי.

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

תרומה זו מתארת כיצד להגדיר התגבשות חלבונים בהתקני גביש על גביש וכיצד לבצע איסוף נתונים סדרתי אוטומטי בטמפרטורת החדר באמצעות פלטפורמת ההתגבשות על השבב.

התגבשות על השבב ודיפרקציה טורית בקנה מידה גדול בטמפרטורת החדר

למדו כיצד לקבוע מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה אטומית מננו-גבישים של מולקולות קטנות באמצעות MicroED. הפרוטוקול מדגים הכנת דגימות קרבמזפין והקפאה קריוגנית בפחות מ-30 דקות.

עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

גלה סרטונים נוספים