עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

בהליך זה, אנו מראים כיצד להתקדם מאבקה מולקולה קטנה למבנה תלת ממדי בתוך דקות. זוהי טכניקה טרנספורמטיבית עבור קהילת הכימיה. תרכובות רבות אינן גדלות בקלות לגבישים גדולים.

בעזרת MicroED אנו יכולים לקבוע מבני רזולוציה אטומית מגבישים בגודל ננומטרי. מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר מייק מרטינוביץ', פרופסור באוניברסיטת UCLA. כדי להתחיל, להעביר כמות קטנה של אבקה, נוזל או מוצקים לתוך בקבוקון קטן או צינור.

עבור דגימות שכבר נמצאות בצורת אבקה, אטמו את הצינורית באמצעות המכסה עד שיהיה צורך בדגימה. באופן דומה, יבשו את דגימות הנוזל לאבקות. עטפו סרט פלסטיק סביב קצה אחד של שקופית כיסוי זכוכית.

הניחו את רשתות ה-TEM על סרט הצילום מעל שקופית הכיסוי, כאשר צד הפחמן בצבע חום פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מקם את השקופית עם הרשתות לתוך תא הפריקה הזוהר וזוהר פרוק את שקופית הכיסוי למשך כ- 30 שניות באמצעות ההגדרה השלילית ב- 15 פיקואמפר. אחסנו את הרשתות בשקופית הכיסוי בתוך צלחת פטרי מזכוכית מרופדת בנייר פילטר לפני הוספת הדגימה לרשתות.

הסר את רשת TEM פריקת הזוהר מצלחת הפטרי המכוסה באמצעות פינצטה והנח אותה על נייר סינון עגול כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה. בעזרת מרית קטנה, הסירו כף מדידה קטנה מאוד של אבקה והניחו אותה על משטח זכוכית מרובע קטן ממש ליד רשת TEM על נייר הסינון. הניחו עוד מגלשת זכוכית מרובעת קטנה או החליקו על גבי האבקה.

בעזרת האצבעות, שפשפו בעדינות את שתי מגלשות הזכוכית זו בזו ליצירת אבקה דקה. סובב את החלקות הכיסוי בזווית ומקם אותן ממש מעל רשת TEM על נייר הסינון והמשך לשפשף את החלקות הכיסוי זו בזו רק כמה סנטימטרים מעל רשת ה-TEM המשוחררת הזוהרת. שימו לב אם האבקה נופלת לכיוון הרשת.

חשוף את האבקה הטחונה דק על ידי הסרת אחת משתי החלקות כיסוי הזכוכית. לאחר מכן הברישו בעדינות את האבקה העדינה מהמכסה אל רשת TEM באמצעות פיסת נייר פילטר. תפוס את קצה רשת TEM באמצעות סט של פינצטה, וודא שהקצוות אינם מנקבים אף אחד מריבועי הרשת.

הרם את הרשת סנטימטר עד שני סנטימטרים מעל נייר הסינון וסובב את הרשת בזווית של 90 מעלות לנייר שמתחת. טפחו בעדינות על הפינצטה תוך שמירה על הפינצטה הדוקה ברשת כדי להסיר אבקה רופפת. מקפיאים את הרשת על ידי הזזת קצה הפינצטה עם הרשת ישירות לתוך מיכל חנקן נוזלי ביד וממתינים עד שהרשת והפינצטה יפסיקו לרתוח.

תחת חנקן נוזלי, מקם את הרשת במחזיק הדגימה עם כיוון צד הפחמן כך שהדגימה תיפגע על ידי הקרן לפני סרט תמיכת הפחמן. טען את מחזיק הדגימה לתוך TEM כדי להבטיח שהרשת נשמרת תמיד בטמפרטורות חנקן נוזלי. עבור מערכות טעינה אוטומטיות, מקם את הרשתות החתוכות לתוך קלטת במיכל מקורר חנקן נוזלי, המאפשר לרובוטיקה של המעמיס האוטומטי לקבל את הקלטת תוך שמירה על הדגימות בטוחות למעבר בין המעמיס האוטומטי לעמודה.

פתח את שסתומי עמודת TEM והתאם את ההגדלה באמצעות לוחות היד להגדלה הנמוכה ביותר האפשרית. מצא את הקרן על ידי התאמת ידית העוצמה בלוחות היד כך שאזור בהיר עגול ייראה על מסך הפלואורסצנט. קח אטלס רשת שלם בהגדלה נמוכה באמצעות תוכנה מתאימה המבטיחה שהמיקרוסקופ מיושר היטב להדמיית הגדלה נמוכה וגבוהה לפני איסוף נתוני MicroED ברזולוציה גבוהה.

זהה ריבועי רשת ללא פחמן שבור וגרגרים שחורים או כהים גלויים על סרט הצילום. נווט ברחבי הרשת באופן פיזי באמצעות הג'ויסטיק על לוחות היד או באופן וירטואלי באטלס שנאסף כדי לחפש ריבועי רשת שאינם שבורים ומכילים מיקרו גבישים. הוסף את המרכז של כל אחד מהריבועים הללו לרשימת מיקומי רשת לחקירה, שניתן להוסיף למחברת בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנת אוטומציה של המיקרוסקופ.

הגדר את ההגדלה בין 500 ל- 1300x. התאם את הגובה המרכזי בכל מיקום רשת מאוחסן ועדכן את ערך z שנשמר למיקומים שצוינו. חפש במסך הפלואורסצנטי או במצלמה שטוחה אחר כתמים שחורים קטנים או גרגרים על הרשת.

מדגם טוב יהיה לרוב בעל קצוות חדים בהגדלה גבוהה המרמזים על גביש בסדר. הזז גביש פוטנציאלי ממוקם למרכז המסך והגדל את ההגדלה כך שה- TEM ייכנס למצב הגדלה גבוהה. הכנס מפתח צמצם של אזור שנבחר ושנה את הצמצם לגודל גדול או קטן יותר כדי להבטיח שהאזור שנבחר גדול יותר מהגביש.

עבור למצב שבירה על ידי לחיצה על לחצן השבירה בלוחות היד של TEM כדי להבטיח שמסך הפלואורסצנט יוכנס. כוונן את אורך המצלמה באמצעות ידית ההגדלה כך שהקצה יהיה ברזולוציית אנגסטרום אחת לפחות. התאימו את מוקד העקיפה כך שהנקודה המרכזית תהיה חדה וקטנה ככל האפשר.

באמצעות ידיות היסט העקיפה, הזז את הקרן המרכזית למרכז המסך הפלואורסצנטי. הכנס את מפסיק הקרן וודא שהקרן נמצאת מאחוריה. הרם את מסך הפלואורסצנט וצלם חשיפה קצרה במצלמה.

בדוק את תבנית השבירה המתאימה, וודא שלתבנית יהיו כתמים חדים המסודרים באופן קבוע בעמודות ובשורות. שמור את קואורדינטות הגביש בממשק המשתמש TEM או על ידי כתיבתן, ולאחר מכן חזור על סינון עקיפה עבור כל הגבישים הפוטנציאליים המעניינים בריבוע הרשת הנוכחי. מרכז את הגביש המוקרן בהגדלה הגדולה מ- 1000x וכוונן את הגובה המרכזי של הגביש באמצעות שגרה אוטומטית או ידנית.

הכנס את מפתח הצמצם שנבחר המתאים ביותר לגודל ולצורה של הגביש. הטו את הבמה בכיוון השלילי והחיובי עד שהתמונה תוסתר על-ידי פסי הרשת. ושים לב לזוויות אלה למטרות איסוף נתונים על ידי קריאת הנתונים כל שנייה אחת במצלמה מודרנית עם מצב קריאת תריס מתגלגל.

הגדר את קצב הסיבוב על ידי ציון אחוז ממהירות ההטיה המרבית ומתי לעצור בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה ייעודית. שמור את הנתונים במגוון תבניות, אומר מסגרות בודדות או כערימת תמונות. סרט שבירה בפורמט קריסטלוגרפי שנאסף ממיקרו-גבישים מראה מערך נתונים MicroED של סיבוב רציף ממיקרו-גביש קרבמזפין שזוהה ברשת TEM.

לאחר פתרון איסוף, אינטגרציה ומבנה נתונים, נקבע מבנה ברזולוציה גבוהה ובהירותו תלויה באיכות ובשלמות הנתונים. החלת הדגימה על הרשת היא קריטית להשגת נתונים טובים. בעקבות שיטה זו, ניתן להמשיך ולעבד את הנתונים באמצעות תוכנה קריסטלוגרפית סטנדרטית.

הוכחת העובדה ש-MicroED היא שיטה רבת עוצמה למולקולות קטנות פתחה את השימוש בה ברחבי העולם לפתרון מבנים חדשים של מולקולות בעלות חשיבות קריטית.