Name: כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למד כיצד לכמת ייצור מיני חמצן תגובתי בזמן אמת בנויטרופילים הנגועים ב-Escherichia coli מנינגיטי. הפרוטוקול משתמש בחיישן פלואורסצנטי ובקורא מיקרופלייט לניטור דינמי של תגובת המערכת החיסונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31670845, 31870832, 32000811) ותכניתו של פרופסור מצטיין במחוז ליאונינג (LJH2018-35).

דם היקפי ממתנדבים המיושמים במחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים הראשון של האוניברסיטה הרפואית של סין (#2020-2020-237-2).
1. הכנת ריאגנטים ובינוני תרבות
<ol><li>הכן את מאגר התמוגה של תאי הדם האדומים על ידי הוספת 8.29 גרם של NH4Cl, 1 גרם של KHCO3, 37.2 מ"ג של Na2EDTA לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים ולהתאים את ה- pH ל 7.2-7.4. הסר את החיידקים על ידי סינון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>הכן מדיום תרבות ניסיוני לנויטרופילים על ידי הוספת 5% סרום שור עוברי למדיום RPMI 1640 ולאחסן ב 4 °C (69 °F). יש להשוות לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הערה: השתמש באמצעי RPMI 1640 ללא פנול אדום.</li>
	<li>הכן מלוחים חיץ פוספט (PBS) על ידי הוספת 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na2HPO4·2H2O ו 0.2 גרם של KH2PO4 לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים בקבוק זכוכית 1 L. כוונן את ה- pH ל- 7.2-7.4. אוטוקלאב זה במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן פתרון ריפאמפיצין על ידי המסת 0.5 גרם של אבקת ריפאמפיצין ב 10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) להניב פתרון ריפאמפיצין 50 מ"ג / מ"ל.</li>
	<li>הכן פתרון אגר LB על ידי הוספת 10 גרם של NaCl, 10 גרם של טריפטון, 5 גרם של תמצית שמרים ו 15 גרם של אבקת אגר לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים autoclave את התערובת. מלאו את מנות הפטרי לחצי מהנפח על ידי שפיכת תמיסת אגר LB חמה המכילה ריפאמפיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל. אחסן את הצלחת המוצקה המקוררת ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן את מרק עירוי לב המוח (BHI) המתאים לזנים חיידקיים על ידי המסת 37 גרם אבקת BHI ל-1 ליטר מים מזוקקים כפולים. כוונן את ה- pH ל- 7.2 ונבלע אותו באופן אוטומטי.</li>
	<li>להמיס את דיהידרותידיום בדיקה פלואורסצנטי (DHE) בממס DMSO להניב פתרון 10 מ"מ למניה. מערבבים בעדינות לפני השימוש. הערה: אליגוט פתרון המניה מיד לתוך בקבוקונים אור הוכחה. חיי המדף של פתרון המניה הם 6 חודשים ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. הכנת זן חיידקים E44
הערה: E44 הוא זן מוטציה של מנינגיטיקה E. coli עם התנגדות ריפאמפיצין.
<ol><li>טובלים את מושבת E44 cryopreserved עם קצה פיפטה סטרילי, לחסן את זן E44 על צלחת אגר LB המכיל 100 ריפאמפיצין מיקרוגרם / מ"ל על ידי ציור קווים. שים את הצלחת במהופך באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה.</li>
	<li>יום אחד לפני הניסוי, לבחור מושבה אחת E44 מהצלחת עם קצה פיפטה סטרילי ולשים אותו 5 מ"ל של מרק BHI המכיל 100 μg / mL ריפאמפיצין בבקבוק 50 מ"ל. דגירה את תרבות החיידקים ב 37 °C (69 °F) עם 90 סל"ד עבור 17 שעות בשייקר דגירה.</li>
</ol>3. בידוד נויטרופילים מדם היקפי אנושי
<ol><li>צייר 5 מ"ל של דגימת דם ממתנדבים תוך ורידי לצינור איסוף הדם ואקום המכיל EDTA עבור קרישה.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות הדם ההיקפי ב 500 x g במשך 5 דקות. דגימות הדם מחולקות לשלוש שכבות על ידי צנטריפוגה, אשר מלמטה למעלה הם שכבת תא הדם האדום (RBC), שכבת תא הדם הלבן (WBC) ואת שכבת הפלזמה, ברצף.</li>
	<li>לשאוף את שכבת תאי הדם הלבנים עם צינור לצינור חדש עם חיץ תמוגה 3x RBC. מערבבים את התערובת ביסודיות ומניחים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינור ב 500 x g במשך 5 דקות. לשאוף את העל-טבעי לחלוטין ולהשליך.<ol>
<li>חזור על הליך התמוגה עם מאגר תמוגה RBC 1-2 פעמים, עד שהמשקע הופך לבן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי שימוש חוזר המשקעים עם 2 מ"ל של PBS. ואז צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתחתית הצינור.</li>
	<li>תווית נויטרופילים עם CD16 microbeads על ידי שימוש חוזר משקעים עם 50 μL של מאגר מיון תאים מגנטיים precooled. לאחר מכן לערבב עם 50 μL של מיקרוביאדות CD16 אנושי ביסודיות. דגירה את התערובת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הערה: יש לקרר מראש פתרונות כדי למנוע מכסה של נוגדנים על פני התא ותיוג לא ספציפי. רוב המבוגרים יש כ 4,000 כדי 10,000 כדוריות דם לבנות לכל microliter של דם, ביניהם, נויטרופילים מהווים כ 50-70%. על פי הערכה, הסעיפים של סך תאי הדם הלבנים ב 5 מ"ל של דם היקפי אנושי הם בדרך כלל עד 2-5 x 107.</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של מאגר מיון תאים מגנטיים צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס, 300 x גרם במשך 10 דקות. השלך את supernatant לחלוטין ו resuspend את המשקעים עם 500 μL של מאגר מיון.</li>
	<li>להרכיב את העמודה המגנטית ולהפריד מדף. הזז את המפריד למדף עם העמודה המגנטית ושטוף את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ מיון.</li>
	<li>זרוק את המתלה התא לתוך העמודה כדי לאפשר נויטרופילים שכותרתו על ידי חרוזים מגנטיים לצרף את העמודה המגנטית.</li>
	<li>שטפו את התאים שאינם מסומנים בתווית על-ידי הוספת מאגר מיון תאים מגנטיים 3 מ"ל 3 פעמים, וודאו שמאגר העמודות ריק בכל פעם.</li>
	<li>הסר את העמודה מהמפריד המגנטי והכנס אותה לצינור של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר מיון תאים מגנטיים לעמודה. לדחוף את התאים המסומנים מגנטי באמצעות בוכנה. הערה: כדי לשפר את טוהר הנויטרופילים, ניתן לחזור על שלבי המיון באמצעות עמודה חדשה.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינור ב 300 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant לחלוטין resuspend את המשקעים עם 1 מ"ל של מדיום תרבות. קבע את מספר התא עם מונה תאים והכן את התאים לניסויים נוספים.</li>
</ol>4. מדידה של ROS
<ol><li>צנטריפוגה נויטרופילים מבודדים ב 300 x g במשך 5 דקות, resuspend את המשקעים, ולהתאים את ריכוז התא ל 2 x 106/mL עם מדיום תרבות המכיל 5 μM DHE בדיקת פלואורסצנטיות.</li>
	<li>דגירה נויטרופילים ב 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות כדי לטעון את החללית DHE, ולאחר מכן להקצות את השעיית התא 96-היטב פוליסטירן שחור microplate עם 200 μL לכל באר.</li>
	<li>הפעל את קורא המיקרו-פלטה ופתח את תוכנת האיתור. בחרו תבנית צלחת אטומה של 96 בארות וקבעו את אזור הקריאה.<ol>
<li>הגדר את הפלואורסצנטיות (Ex/Em = 518/605 ננומטר) במצב קינטי כל 5 דקות במשך 60 דקות ב 37 °C (60 °F). הקפידו לנער את הצלחת במשך 3 שניות לפני כל קריאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מוציאים את המיקרופלטה מהאינקובטור, מוסיפים את ה-E44 (MOI=100) התרבותי או את הפורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA) (100 ng/mL) לכל באר המכילה נויטרופילים טעונים מראש עם 3 שכפולים. השתמש ב- PMA כפקד חיובי.</li>
	<li>מניחים את הצלחת בקורא המיקרופלאט ומתחילים את ההסתעפות מיד.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).</li>
<li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+%3C%2F%3D60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis%3A+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31(2019).</li>
<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li>
<li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li>
<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Molecules%2C+Functions+and+Pathophysiological+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li>
<li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+ROS-induced+ROS+release%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li>
<li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li>
<li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neutrophil%27s+Role+During+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li>
<li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases%3A+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li>
<li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Neutrophil+Oxidants%3A+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li>
<li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+%28ETs%29+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li>
<li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neutrophil+function+test%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li>
<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

נויטרופילים פועלים כמרכיב הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים במחזור הדם האנושי. הם תאים משפיעים חשובים במערכת החיסון האנושית המולדת, אשר בונה את קו ההגנה הראשון נגד הפלישה של פתוגנים11. הדור של ROS מייצג את אחד המנגנונים bactericidal העיקריים של נויטרופילים בעקבות phagocytosis11. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מבנה דמוי רשת שפורסם על ידי נויטרופילים הנקראים מלכודת חוץ תאית נויטרופילים (NET) מעורב גם בתהליך הרג החיידקים6,11<s...

דלקת קרום המוח חיידקית יילודים היא מחלה זיהומית בילדים נפוצה. Escherichia coli (E. coli) עם כמוסה K1 הוא הפתוגן הגרם שלילי הנפוץ ביותר גורם דלקת קרום המוח חיידקי יילודים, המהווה כ 80% מכלל השכיחות1,2,3. למרות ההתקדמות בכימותרפיה מיקרוביאלית וטיפול תומך, דלקת קרום המוח חיידקית היא עדיין אחד התנאים ההרסניים ביותר עם תחלואה גבוההותמותה 4.
המופע של דלקת קרום המוח חיידקי יילודים בדרך כלל מתחיל עם חיידקים הנגרמים על ידי כניסת חיידקים פתוגניים לתוך זרימת הדם ההיקפית מן הנגעים המקומיים של התינוקות, ואחריו חדירה דרך מחסום הדם - מוח (BBB) לתוך המוח, וכתוצאה מכך דלקת של קרום המוח4. הופעת החיידק תלויה באינטראקציה בין חיידקים לתאי חיסון מארחים כולל נויטרופילים ומאקרופאגים וכו '. נויטרופילים, המהווים ~ 50-70% מתאי הדם הלבנים, הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים חיידקיים5,6. במהלך הפלישה של חיידקים, נויטרופילים מופעל מגויסים לאתרים זיהומיות ולשחרר מינים חמצן תגובתי (ROS) כולל אניון סופראוקסיד, מי חמצן, רדיקלים הידרוקסיל, וחמצןסינגלט 7. ROS לעבור תגובות redox עם קרום התא, מולקולות חומצת גרעין וחלבונים של החיידקים, וכתוצאה מכך פציעה ומוות של חיידקים פולשים8. המיטוכונדריה היא האתר העיקרי של ייצור ROS בתאים אוקריוטיים, ואוקסידאזים שונים (למשל, ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט (NADPH) קומפלקס אוקסידאז, מערכת ליפוקסיגנאז, חלבון קינאז C ומערכת ציקלואוקסיגניאז) מתווכים את הייצור של ROS9,10. המדידה בזמן אמת של הייצור של ROS, המייצג את המנגנון האנטי מיקרוביאלית העיקרית נויטרופילים, היא שיטה שימושית לחקר ההגנה המארחת במהלך האינטראקציה חיידקים מארח.
בפרוטוקול זה, ייצור ROS תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה מכמת עם DHE בדיקה ROS פלואורסצנטי, זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה להיות מיושמת גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים אחרים במהלך האינטראקציה פתוגן מארח.

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים מאושר</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>בטיחות ביולוגית קרבינט</td><td>שנחאי Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>עירוי לב מוח</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 מיקרו-חרוזים, אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>עמודות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>דיהידרואתידיום (DHE)</td> <td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>MACS מאגר הפרדה</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td> <td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>יחידת הפרדה QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>בינוני סנגון ביוטק</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>שייקר תרמוסטטי</td><td>שנחאי Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי escherichia קולי

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) הוא החיידק הגרם שלילי הנפוץ ביותר הגורם לדלקת קרום המוח יילודים. המופע של חיידקים וחדירה חיידקית דרך מחסום הדם - מוח הם צעדים הכרחיים להתפתחות של דלקת קרום המוח E. coli. מינים תגובתיים של חמצן (ROS) מייצגים את המנגנונים הבקטריואידיים העיקריים של נויטרופילים כדי להשמיד את הפתוגנים הפולשים. בפרוטוקול זה, ייצור ROS תאיים תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה לכמת באמצעות בדיקות ROS פלואורסצנטי זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה לחול גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים במהלך אינטראקציות מארח פתוגן.

באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, נויטרופילים היו מבודדים מדם היקפי אנושי טעון עם בדיקה פלואורסצנטית DHE כדי לזהות את השינויים של רמות ROS בתגובה לזיהום E44. כאן, אנו מספקים נתונים מייצגים המדגימים את ייצור ROS עורר על ידי זן E44 נקבע על ידי קורא microplate בזמן אמת. על ידי הוספת זני E44 ב- MOI של 100, רמות ה- ROS עלו באופן מיידי והראו מגמת עלייה מתמשכת באופן תלוי זמן (איור 1). על ידי הוספת PMA, גורם ROS ידוע של ROS תאיים נויטרופילים, ראינו עקומה בצורת S המציגה עקומה שטוחה בשלב הראשוני ואחר...

Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli הוא החיידק הגרם שלילי הנפוץ ביותר גורם דלקת קרום המוח יילודים. המופע של דלקת קרום המוח חיידקי יילודים אך ורק מתחיל עם החיידק ולאחר מכן החיידקים בדם לחדור דרך מחסום הדם מוח כדי לגרום לדלקת קרום המוח. נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים חיידקיים.במהלך פלישת חיידקים, נויטרופילים פעיל לשחרר ROS. ROS מייצג את המנגנונים הבקטריוציאליים העיקריים של תאים מארחים כדי להרוס את הפתוגנים הפולשים. מדידת הייצור של ROS בנייטרופילים היא שיטה שימושית להתחלת ההגנה של המארח במהלך אינטראקציה מארח חיידקים.קח מושבת חיידקים אחת מהצלחת עם פיפטה סטרילית ולשים אותו בחמישה מיליליטר המוח לב עירוי מדיום המכיל ריפאמפיצין בבקבוק קעור. דגירה את תרבות החיידקים ב 37 צלזיוס, עם 90 סל"ד במשך 17 שעות בשייקר הדגירה. צנטריפוגה דגימות הדם ההיקפיות ב 2000 סל"ד במשך חמש דקות.לאחר צנטריפוגה, דגימות הדם מחולקות לשלוש שכבות. מלמטה למעלה, שכבת תאי הדם האדומים, שכבת תאי הדם הלבנים ושכבת הפלזמה. לשאוף את שכבת תאי הדם הלבנים לצינור חדש עם פיפטה סטרילית.מוסיפים חיץ תמוגה תלת-פעמי של תאי דם אדומים. מערבבים את התערובת ביסודיות, ומניחים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. צנטריפוגה הצינור ב 2000 סל"ד במשך חמש דקות.לשאוף את העל-טבעי לחלוטין ולהשליך. חזור על הליך התמוגה של כדוריות דם אדומות במשך פעם או פעמיים, עד משקעים להפוך לבן. לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של המשקע עם PBS שני מיליליטר.ואז צנטריפוגה הצינור ב 1000 סל"ד במשך חמש דקות. תחדש את המשקע עם 15 מיקרוליטר קוד מקדים מאגר מיון תאים מגנטיים עבור 15 מיליון תאים. מוסיפים 15 מיקרוביאדות מגנטיות מיקרוליטר ומערבבים היטב.הדגירה את התערובת בארבעה צלזיוס במשך 30 דקות. בתנאים רגילים, לאדם הבוגר יש בערך 4 עד 10,000 תאי דם לבנים לכל דם מיקרוליטר. אז העלות של סה"כ תאי דם לבנים בדם היקפי אנושי 5 מיליליטר, כמעט פחות מ -50 מיליון.ו-50 חרוזים מגנטיים מיקרוליטר ב-15 מאגר מיון מגנטי מיקרוליטר זה מספיק. האחוז הנורמלי של הנויטרופילים הוא 50 עד 70% מכלל תאי הדם הלבנים. אז בערך 10 מיליון נויטרופילים יכולים להתקבל מדם של חמישה מיליליטר.לשטוף את התאים על ידי הוספת חיץ מיון מגנטי שני מיליליטר, לכל 10 מיליון תאים לצינור, וצנטריפוגה בארבעה צלזיוס, 1, 200 סל"ד במשך 10 דקות. להרכיב את העמודה המגנטית ולהפריד מדף. השלך את supernatant לחלוטין, ולהשתיל מחדש את המשקעים עם 500 מאגר מיון מגנטי microliter עבור עד 100 מיליון תאים.שטף את העמודה עם חיץ מיון מגנטי של 3 מיליליטר. החל את השעיית התא על העמודה כדי לאפשר את נויטרופילים שכותרתו על ידי חרוזים מגנטיים, מחובר לעמודה. שטף את התאים הספציפיים שאינם ספציפיים על ידי הוספת מאגר של שלושה מיליליטר במשך שלוש פעמים, לאחר מאגר העמודות ריק בכל פעם.הסר את העמודה מהמפריד המגנטי, והכנס אותה לצינור חדש. הוסף חיץ מיון מגנטי של 5 מיליליטר לעמודה. לדחוף את התאים המסומנים מגנטי באמצעות בוכנה.צנטריפוגה הצינור ב 1, 200 סל"ד במשך חמש דקות. שאפו את הסופרנט לחלוטין, ובזבזו מחדש את המשקע עם מדיום תרבות מיליליטר אחד. קבע את מספר התא עם מונה.התאים את ריכוז התאים ל-2 מיליון למיליליטר במדיום התרבות המכיל בדיקת פלואורסצנטיות DHE. מניחים את הנויטרופילים באינקובטור במשך 30 דקות כדי לטעון את הגשוש DHE. הקצה את המתלה התא למיקרופלאט שחור 96 באר עם 200 מיקרוליטר לבאר.הפעל את קורא המיקרופלאטים. הגדר את הטמפרטורה ל- 37 צלזיוס, בחר מצב קריאת פלואורסצנטיות, סוג קריאה קינטי, הגדר את אורך הגל של הפלואורסצנטיות. בחר את תבנית הלוח.קבע את אזור הקריאה. למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות כל חמש דקות במשך שעה. מנערים את הצלחת במשך שלוש שניות לפני כל קריאה.תוציא את המיקרופלטה מהאינקובטור. הוסף זני PMA או E44 עם שלוש חזרות. שים את הצלחת בקורא microplate, לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל את ההסתעפות מיד.באמצעות קווי המתאר של הפרוטוקול במאמר זה, הנויטרופילים היו מבודדים מהדם ההיקפי האנושי, ועמוסים בבדיקת פלואורסצנטיות DHE. על ידי הוספת PMA, ROS תאיים נויטרופילים, הראה עלייה משמעותית מ 20 ל 40 דקות, והגיע לשיא ב 60 דקות. אבל אני חושב E44 זנים, ייצור ROS מתרחשת באופן מיידי ומגדיל את הזמן תלוי.הביטוי של ROS שנגרם על ידי זן E44 דומה לזה שנגרם על ידי PMA. הגילוי של ייצור ROS בניטרופילים עשוי לתרום למחקר נוסף של המנגנונים הבקטריוציאליים של נויטרופילים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים דרך קלה יותר לזהות את ייצור ROS בנויטרופילים באופן בזמן אמת.השיטה הפשוטה יכולה לשמש גם כדי לפקח על ייצור ROS בסוגי תאים מארחים אחרים במהלך אינטראקציות מארח-חיידקים.

real-time-quantification-reactive-oxygen-species-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Neisseria meningitidis (ננומטר), שלילי גרם אדם ספציפי פתוגן הנשימה, ניתן לאגד את האדם α-actinin. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה של colocalisation של החיידק עם תאיים α-actinin לאחר כניסת חיידקים לתוך כלי הדם לתאי המוח האנושי האנדותל (HBMECs).

Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת כימילומינסנציה במבחנה כדי לזהות את הדור של מיני חמצן תגובתי על ידי נויטרופילים לאחר חשיפה לביופילם חיידקי opsonized.

קביעת ייצור ROS על ידי נויטרופילים באינטראקציה עם ביופילם אופסוני

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים...

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

זיהום של עכברים יילודים עם bioluminescent E. coli O1:K1:H7 תוצאות זיהום ספיגה עם דלקת ריאות משמעותית ופתולוגיה ריאות. כאן, אנו מתארים נהלים למודל וחקר נוסף אלח דם יילודים באמצעות הדמיה תוך ויציתית אורך במקביל ללקטואר של נטל חיידקי מערכתי, פרופיל דלקתי, היסטופתולוגיה ריאות.

מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של אינטראקציות נויטרופיל-ביופילם. ביופילמים של Staphylococcus aureus מבוססים במבחנה ודוגרים עם נויטרופילים אנושיים שמקורם בדם היקפי. תגובת פרץ החמצון של נויטרופילים ניתנת לכימות, ולוקליזציה של הנויטרופילים בתוך הביופילם נקבעת על ידי מיקרוסקופיה.

בדיקות סטנדרטיות במבחנה כדי להמחיש ולכמת אינטראקציות בין נויטרופילים אנושיים לבין סטפילוקוקוס אאורוס ביופילמים

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

למד כיצד לכמת ייצור מיני חמצן תגובתי בזמן אמת בנויטרופילים הנגועים ב-Escherichia coli מנינגיטי. הפרוטוקול משתמש בחיישן פלואורסצנטי ובקורא מיקרופלייט לניטור דינמי של תגובת המערכת החיסונית.

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

גלה סרטונים נוספים