גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה
19 במרץ 2021
פרוטוקול לתרבות ומניפולציה של רקמת עובר עכבר על שבב microfluidic מסופק. על ידי החלת פולסים של אפננים מסלול, מערכת זו יכולה לשמש כדי לשלוט חיצונית תנודות איתות לחקירה פונקציונלית של סמיטוגנזה עכבר.
מסלולי איתות השולטים במערכות רב-תאיות הם דינמיים. כדי להבין את הפונקציה של דינמיקה זו, זה חיוני כדי להיות מסוגל לווסת בעדינות דינמיקה זו מבלי להשפיע על פעילות איתות הכוללת. פרוטוקול זה משתמש במערכת מיקרופלואידית המאפשרת ניתוח פונקציונלי של תנודות איתות בפיתוח עוברי עכבר.
דינמיקת איתות נמצאה ברקמות רבות, כולל אלה של מבוגרים. Microfluidics הוא כלי רב-תכליתי שניתן להתאים למערכות מודל רבות, כולל תרבויות תאים, רקמות ואורגנוידים. כדי להתחיל, להכין את הכמות הנדרשת של PDMS על ידי ערבוב מונומר עם הזרז ביחס תשע לאחד כדי לגרום פילמור.
השתמש בכלים חד פעמיים וודא כי ערבוב מושגת כראוי. מניחים את תערובת PDMS במייבש ומניחים ואקום במשך כ -30 דקות כדי להסיר אוויר. יוצקים שכבת PDMS של כשלושה עד חמישה מילימטרים לתוך תבנית השבב ומחזירים למייבש במשך כ -30 דקות.
לרפא את התבנית על ידי הצבתו בתנור לילה ב 65 מעלות צלזיוס או נמוך יותר בהתאם לחומר עובש. חותכים את השבב מהתבנית באמצעות אזמל. חורי מפרצון ושקע אגרוף עם אגרוף ביופסיה מילימטר אחד החל מבפנים של התא microfluidic.
נקו את מגלשת הזכוכית עם אוויר דחוס. כדי לחבר את השבב למגלשת הזכוכית, מניחים את שקופית השבב והזכוכית לתנור הפלזמה עם הצדדים להיות מלוכדים כלפי מעלה. צור פלזמה באמצעות הפרוטוקול הספציפי למכונה המשומשת, ולאחר מכן קשר את השבב לזכוכית על ידי הצבת המשטחים הפעילים אחד על השני והפעלת לחץ באופן שווה.
כדי להכין את הצינורות ואת השבב לניסוי, לחתוך את הצינורות בזווית של 45 מעלות ולחבר מחט אחת לכל אחד הצינורות. מניחים את הצינורות עם מחטים, השבב, ואת התקעים בצלחת לחטא אותם על ידי חשיפה לאור אולטרה סגול במשך כ 15 דקות. כדי לצפות את השבב עם פיברונקטין, מניחים את השבב בכוס המכילה PBS בתוספת 1% פניצילין או סטרפטומיצין בטמפרטורת החדר.
יש לשטוף את השבב עם PBS כדי להסיר אוויר עם פיפטה P200. טען מזרק 3 מיליליטר לכל תא של השבב. חבר את המחט למזרק המכיל פיברונקטין וחבר את המזרק למשאבת המזרק.
יש לשטוף צינורות באופן ידני כדי להסיר אוויר. חבר את צינורות השקע לשקע של השבב. הקפד לדחוף את הצינורות כל הדרך לתחתית ולקבוע קצב זרימה נמוך כדי לצפות את השבב.
תן למשאבת המזרק לפעול לפחות שעתיים או לילה. בסיום, עצרו את המשאבה וחתכו את הצינורות מיד לאחר המחט. הכן מזרקים מלאים במדיום לניסוי ודגים הן את מדיום התרבות והן את השבב בתוך PBS.
נסה לשטוף החוצה או למצוץ את רוב בועות האוויר מהשבב, ולאחר מכן להתקין מזרקים במשאבות ולחבר צינורות מפרצון למזרקים. כדי לטעון רקמות על השבב, לנתח את הקצה האחורי ביותר של הזנב. לשטוף את השבב עם מדיום תרבות עם 25 HEPES micromolar כדי להסיר את PBS.
טען את הרקמה לתוך השבב באמצעות פיפטה P200. לאחר כל שלב טעינת רקמות, סגור את הכניסה המתאימה לטעינת רקמות באמצעות חתיכת צינורות מלאים PDMS. כדי להרכיב את ההתקנה המיקרופלואידית, חברו צינורות לשבב המיקרופלואידי מבלי להכניס פנימה בועות אוויר.
כדי לעשות זאת, ודא כי יש טיפה של נוכח בינוני בסוף הצינורות. לאחר שכל הצינורות מחוברים לשבב, מוציאים אותו מהכוס ומניחים אותו בצלחת המכילה רקמה רטובה. שים את המנה וכ 1.5 מטר של צינורות מפרצון באינקובטור לתרבות לילה.
להבטיח לחות גבוהה כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר במהלך התרבות. לחלופין, לייבש את החלק החיצוני של השבב ולהניח אותו במחזיק מיקרוסקופ, ולאחר מכן לשים את המחזיק כ 1.5 מטר של צינורות מפרצון בתוך תא הדגירה של מיקרוסקופ הפוך לניסוי הדמיה חי. לאחר לפחות 20 דקות של זרימה מתמדת, התחל את השאיבה המתוכננת לניסוי.
כדי לאמן איתות חריץ בעובר העכבר פילוח, להשתמש בתוכנית שאיבה של 100 דקות בינוני ו 30 דקות פולסים סמים חוזרים על עצמו עד סוף הניסוי, בדרך כלל במשך 24 שעות. להדמיה בזמן אמת, התחילו בהדמיה לאחר 30 דקות לפחות. כדי לאשר אימון של תנודות איתות, ניסויים מרובים מיושרים באמצעות התזמון של פולסים התרופה ודמיינו עם צבע כחול מפל.
תנודות מכמתות ניתן לבטל ולהציג כממוצע סטיות תקן או שלבים של התנודות ניתן לחשב. ניתן לנתח את הקשר הפאזה בין תנודות של תרבויות עובריות אחוריות עצמאיות זו לזו ולפולסות התרופה החיצוניות. כדי לאשר אימון, אפשר למשל לקבוע את התקופה של תנודות איתות אנדוגני באמצעות pyBOAT תוכנית המבוססת על פייתון.
בעת החלת פולסים עם פרק זמן של 130 דקות, תנודות איתות חריץ גם להראות תקופה של 130 דקות. זה קריטי כדי למנוע את אידוי של נוזל במהלך הניסוי microfluidic. אחרת, בועות אוויר ייווצרו בשבב שמפריעות לזרימה בינונית.
כדי למנוע זאת, degas המדיום ואת השבב ולוודא כי הלחות באינקובטור הוא גבוה מספיק. באמצעות שיטה זו, דינמיקת איתות ניתן לאפות וניתן לנתח את השפעותיהם על ידי הדמיה בזמן אמת של כתבים פלואורסצנטיים, חיסונים, או בהכלאה במקום. יתר על כן, ניתן גם לחלץ את הרקמה מהשבב לניתוח נוסף.
אפשר להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את הפונקציה של איתות תנודות בהתפתחות עוברית. זה הוחל כדי להדגים את החשיבות של המעבר פאזה בין שני נתיבי איתות מתנדנד עבור פילוח של עובר העכבר. באופן כללי יותר, כעת ניתן להשתמש בו כדי לנתח את המנגנון של קידוד איתות דינמי במערכות רב-תאיות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית לניתוח תפקודי של תנודות באותות (signaling oscillations) בעוברים של עכברים בשלבי התפתחות, תוך התמקדות ספציפית בפילוח של המזודרמה הפרסומיטית (presomitic mesoderm). גישה זו מאפשרת Modulation וסנכרון מדויקים של דינמיקת אותות אנדוגנית באמצעות פולסים חיצוניים של מווסני מסלולים. השיטה ניתנת להתאמה למערכות מודל שונות ומספקת פלטפורמה לדימוי ואנליזה בזמן אמת של דינמיקת אותות במהלך ההתפתחות העוברית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- מיקרופלואידיקה
- אמבריולוגיה
רקע
- פילוח מחזורי במזודרמה הפרסומיטית מווסת על ידי מסלולי שסגנל דינמיים.
- תנודתיים ומדרגים בסיגנלינג שולטים בעיתוי ובריווח של היווצרות הסומיטים.
- הראיות התפקודיות הישירות לתפקידן של תנודות סיגנלינג בתהליך הסומיטוגנזה היו מוגבלות.
- מיקרופלואידיקה מציעה דרך לווסת דינמיקות של איתות בדיוק גבוה.
מטרת המחקר
- להקים פרוטוקול מיקרופלואידי לאפנון וסנכרון של תנודות איתות ברקמה עוברית של עכבר.
- לספק מדריך מפורט למשתמשים חדשים להקמה ולניצול של מערכות מיקרופלואידיות במחקר בביולוגיה התפתחותית.
- לאפשר חקירה פונקציונלית של דינמיקת האיתות והשפעתה על הסגמנטציה העוברית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של שבבי מיקרופלואידיקה מבוססי PDMS באמצעות תבניות מודפסות בתלת-ממד.
- הדבקה של השבבים למשטחי זכוכית באמצעות טיפול בפלסמה.
- ציפוי של השבבים בפיברונקטין ועיקור של הרכיבים.
- הטענה וגידול של רקמה עוברית ראשונית של עכבר בתוך המכשיר המיקרופלואידי.
- סנכרון של תנודות באותות באמצעות פולסים מתוכננים של מודולטורים של מסלולי איתות.
- דימיון בזמן אמת ואנליזה כמותית של דינמיקת האיתות.
תוצאות עיקריות
- סחיפה מיקרו-פלואידית סנכרנה בהצלחה תנודות של איתות אנדוגני ברקמה עוברית של עכבר.
- ניתן היה לווסת את תקופות התנודה כדי להתאים אותן למשך הפולסים של תרופות חיצוניות (למשל, 130 דקות).
- ניתוח כמותי נערך ליחסי הפאזה בין נתיבי התנודה לבין הגירויים החיצוניים.
- השיטה הדגימה את חשיבותן של הזזות הפאזה בין נתיבי איתות לצורך סגמנטציה תקינה.
מסקנות
- המערכת המיקרופלואידית מאפשרת ניתוח תפקודי מדויק של סיגנלינג דינמי במערכות רב-תאיות.
- היא מספקת פלטפורמה חסונה לחקירת המנגנונים העומדים בבסיס הפילוח העוברי וקוד האיתות.
- הגישה ניתנת להתאמה למודלים אחרים, הן in vivo והן in vitro, כגון אורגנואידים וגסטרולואידים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תנודות סיגנלינג דינמיות הן מרכזיות בתהליכי התפתחות ובמידול מחלות, אך תפקידיהן הפונקציונליים נותרים לעיתים קרובות מעורפלים בשל מגבלות טכניות בבמיסום מדויק. גישה זו, המבוססת על מיקרופלואידיקה, מאפשרת סנכרון מבוקר (entrainment) וניתוח כמותי של דינמיקת הסיגנלינג במערכות רב-תאיות, ובכך מספקת תמיכה ישירה בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי. יכולת ההתאמה של הפלטפורמה למערכות מודל מגוונות ממצבת אותה כנכס הניתן לשימוש חוזר לצורך תיקוף מטרות ומסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה תפקודית של דינמיקת מסלולי איתות במודלים של רקמות ואורגנואידים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת התפקיד הסיבתי של איתות תנודתי (oscillatory signaling) בסגמנטציה התפתחותית.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרות על ידי מתן אפשרות לוויסות זמני מדויק וניתוח פאזה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביולוגיות דינמיות ומאומתות עבור תהליכי סינון תרכובות בהמשך השלבי העבודה.
- מנstandardizes תנאי בדיקה באמצעות סנכרון (entrainment) ניתן לתכנות ומדידות כמותיות.
- מאפשר ניתוח הדיר ושחזור של השפעות ויסות מסלולים על דפוסי רקמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים in vitro ו-ex vivo לדינמיקה של אותות הרלוונטית למחלה לצורך רצף תרגומי.
- תומכת בגילוי סמנים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לדימוי בזמן אמת וניתוח כמותי של יחסי פאזה.
- מספקת פלטפורמה לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכון המבוסס על חקירת מסלולים תפקודיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
מערכת גרירה מיקרופלואידית זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למודולציה מבוססת-השערה של תנודות אותים ומדרגי ריכוזים במודלים של רקמות מורכבות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות סנכרון מבוקר וניתוח פאזה.
- סריקה: מספק מערכות רקמה דינמיות המוכנות לבדיקה (assay-ready), עם פלטים כמותיים וסטנדרטיים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של תקופות תנודה, קשרי פאזה ותגובה למודולטורים.
- מחקר תרגומי: מאפשר המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות מידול של דינמיקת אותות הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ברמה ארגונית: ניתן להתאמה למערכות מודלים שונות, ובכך תומך ביישומים רחבים של פורטפוליו בניתוח אותים פונקציונלי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בסגמנטציה ובדפוסים מונחי-מסלול.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תרביות רקמה דינמיות ושל ויסות סיגנלינג עבור תהליכי עבודה הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך ביצוע (go/no-go) ותעדוף יעיל של מטרות ומודלים מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים ובמעבר ידע בין תוכניות באמצעות פלטפורמות מיקרופלואידיות הניתנות לשימוש חוזר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, תרביות רקמה וניתוח דימות כמותי.
- דורש גישה להדפסה בתלת-ממד, קישור פלסמה ותשתית לדימות בזמן אמת.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת השבבים ולפרוטוקולים ניסיוניים.
- ניתן להתאמה למודלים של רקמות, אורגנואידים ועוברים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- ניהול קפדני של הלחות ובועות אוויר הוא קריטי לשמירה על תקינות הניסוי.
