Name: גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: חקור מערכת מיקרופלואידיקה לניתוח תנודות איתות בעוברי עכברים מתפתחים. השיטה מאפשרת מודולציה מדויקת של דינמיקת האיתות וסינכרון אוסצילציות אנדוגניות לחקירת מנגנוני סמיטוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ליאנג לי וג'וס מלדה מאוטרכט UMC על העזרה בהדפסת תבניות בתלת-ממד, קארן ואן דן אנקר מקבוצת זונן על משוב שימושי מאוד על הפרוטוקול, וטג'רד פאזה מהסדנה המכנית במכון הוברכט למחזיק שבבים מיקרופלואידיים בתוך המיקרוסקופ. ברצוננו להודות לכל קבוצת Sonnen על הקריאה הביקורתית של כתב היד והסוקרים על המשוב הבונה שלהם. עבודה זו קיבלה מימון ממועצת המחקר האירופית במסגרת הסכם מענק התחלתי של ERC מס ' 850554 ל- K.F.S.

<ol><li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+live+imaging+links+HES5+dynamics+with+cell-state+and+fate+in+murine+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jag1+modulates+an+oscillatory+Dll1-Notch-Hes1+Signaling+module+to+coordinate+growth+and+fate+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors.</a> Developmental Cell. , 1-17 (2020).</li>
<li>Hubaud, A., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a+plays+a+major+role+in+the+segmentation+clock+controlling+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%CE%B2-catenin+gradient+links+the+clock+and+wavefront+systems+in+mouse+embryo+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+propagation+of+Hes7+oscillation+are+cooperatively+regulated+by+Fgf+and+Notch+signaling+in+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock.</a> Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+types+of+oscillations+in+notch+and+Fgf+signaling+regulate+the+spatiotemporal+periodicity+of+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis.</a> Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).</li>
<li>Sonnen, K. F., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signal+encoding+-+From+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic signal encoding - From cells to organisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).</li>
<li>Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+acts+upstream+of+the+NOTCH+and+WNT+signaling+pathways+to+control+segmentation+clock+oscillations+in+mouse+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis.</a> Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).</li>
<li>Sonnen, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+shift+between+Wnt+and+Notch+signaling+oscillations+controls+mesoderm+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation.</a> Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).</li>
<li>Sonnen, K. F., Merten, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+an+emerging+precision+tool+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology.</a> Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).</li>
<li>Cimetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+generating+stable+concentration+gradients+for+long+term+cell+culture%3A+Application+to+Wnt3a+regulation+of+%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling.</a> Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).</li>
<li>Demers, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development-on-chip%3A+In+vitro+neural+tube+patterning+with+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device.</a> Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Frank, T., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-switching+allows+independently+programmable%2C+extremely+stable%2C+high-throughput+diffusion-based+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160 (3), 381-392 (2015).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+positioning+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subcellular positioning of small molecules.</a> Nature. 411 (6841), 1016(2001).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+treatment+of+cellular+microdomains+using+multiple+laminar+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams.</a> Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li>
<li>Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+pipeline+for+systematic+modulation+and+analysis+of+3D+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments.</a> Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineers+are+from+PDMS-land%2C+biologists+are+from+polystyrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li>
<li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).</li>
<li>Lo, J. F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+control+of+oxygen+microenvironment+at+the+single+islet+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+of+developing+C.+elegans+larvae+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Drosophila+embryonic+patterning+network+perturbed+in+space+and+time+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics.</a> Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. , (2020).</li>
<li>Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D%C2%B5F+-+Interactive+design+environment+for+continuous+flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Yoshioka-kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+delay+controls+synchronized+oscillation+in+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock.</a> Nature. 16, (2019).</li>
<li>Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+frequency+analysis+for+biological+data+-+pyBOAT%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+Interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Dettinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microfluidic+system+for+dynamic+stimulation+and+tracking+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).</li>
<li>Manfrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+signaling+centers+for+the+spatially+controlled+patterning+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).</li>
<li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 965, 960-965 (2019).</li>
<li>Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for%3A+Caenorhabditis+elegans+culture+and+oxygen+consumption+rate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements.</a> Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כיצד דינמיקת האיתות שולטת במערכות רב-תאיות הייתה שאלה ארוכת שנים בתחום. חקירה פונקציונלית מהווה אתגר מרכזי, כי הדינמיקה הזאת צריכה להיות מאופננת בעדינות כדי לאפשר את זה11. שליטה זמנית כזו על הפרעות מסלול ניתן להשיג באופן עקרוני עם אופטוגנטיקה, אשר מאפשר גם שליטה מרחבית גבוהה34. עם זאת, אופטוגנטיקה דורשת הקמת כלים גנטיים מתוחכמים לניתוח כל מסלול איתות המדובר. הפרוטוקול הנוכחי המתואר כאן מספק כלי רב תכליתי מאוד עבור ההפרעה של כל מסלול איתות. ניסוי המיקרופלואידיקה מאפשר יישום של פולסים תרופתיים מבוקרים זמנית כדי לחקור באופן פונקציונלי את הדינמיקה של מסלולי איתות בתרביות רקמות. כאן, ההתמקדות היא בחקר סומיטוגנזה בתרבויות ex vivo , אך ניתן להתאים את הפרוטוקול כך שיתאים לכל מערכות מודל אחרות.
שלבים מסוימים בפרוטוקול הם קריטיים לביצוע ניסוי מוצלח במיקרופלואידיקה (המסוכם בטבלה 1). נקודות מפתח נדונות כדלקמן. בשל זרימה בינונית במהלך הניסוי, תרבית הרקמה חווה מתח גזירה. חשיפה של מערכת המודל לזרימה רציפה יכולה לגרום ללחץ תאי ובמקרים קיצוניים למוות של תאים עקב אפקט הגזירה. עבור תרביות רקמת ex vivo של tailbuds העכבר ואת עיצוב השבב הנוכחי, קצב זרימה של 60 μL / h (מקסימום של 100 μL / h) נמצא לעבוד היטב עם אפקט גזירה מינימלי. כאשר משאבות מרובות מופעלות בו זמנית עבור אותו שבב, קצב הזרימה של משאבות בודדות צריך להיות מותאם בהתאם כדי לא לגרום לעלייה בקצב הזרימה הכולל. כאשר הפרוטוקול הנוכחי מותאם למערכות מודל אחרות ולעיצובי שבבים, יש למטב את קצב הזרימה. לחלופין, ניתן לא לשטוף בינוני ברציפות, אבל מעת לעת לשנות מדיום על השבב35. התקנה כזו יכולה להיות מיושמת גם על תנודות איתות בקרה בסומיטוגנזה של העכבר (לא פורסם, נתונים לא מוצגים). יתר על כן, ניתן גם לדמיין התקנה, שבה תרביות רקמות אינן חשופות לזרימת נוזלים ישירה, אך תרופות מגיעות לרקמה על ידי דיפוזיה מערוץ סמוך. מערכות כאלה שימשו בהצלחה כדי להחיל שיפועים של גורמי גדילה על מודלים במבחנה של בידול ESC14,36.
נושא מרכזי אחד של ניסויים מיקרופלואידיים הוא התרחשות של בועות אוויר על שבב במהלך הניסוי. בועות אוויר בתוך השבב או הצינורות עלולות להפריע לזרימה נוזלית אחידה על השבב ויכולות להוביל להסרת תרבות העובר ממיקומה. כדי למנוע נוכחות של בועות אוויר, צעדים שונים של הפרוטוקול הם הכרחיים. ראשית, מדיום תרבות בתוך מזרקים ואת השבב microfluidic עצמו חייב להיות degassed באמצעות ייבוש (שלב 3.1.3). שנית, בעת טעינת דגימות לתוך מפרצוני הטעינה, יש להיזהר שלא להזרים אוויר לתוך השבב יחד עם המדגם (שלב 3.2.3). שלישית, בעת מילוי הצינורות עם בינוני, כל בועות האוויר חייב להיות נשאב החוצה לפני הצמדת השבב (שלב 3.3.2). אחרת, בועות אלה יידחפו לתוך השבב הראשי במהלך הניסוי. לבסוף, במהלך הניסוי, המדיום הוא שיווי משקל בתוך תא ההדמיה או החממה בשל צינורות חדיר למחצה. חדירות הצינור מאפשרת גם אידוי של המדיום, לכן ודא כי הלחות מווסתת במהלך הניסוי כדי למנוע היווצרות של בועות חדשות בצינורות.
באופן כללי, microfluidics הוא כלי רב תכליתי מאוד שניתן להתאים לשאלה הספציפית של החוקר. הגישה העיצובית הנוכחית מאפשרת הדמיה של עד 12 תרביות ex vivo במקביל לשבב. מספר זה מוגבל בעיקר על ידי מספר העוברים לכל ניסוי והזמן שלוקח לדמיין כל תרבות עובר ברזולוציה מספקת. אם יש צורך להשוות תנאים מרובים בניסוי יחיד, ניתן להרכיב שבבים מרובים על שקופית זכוכית אחת. עיצוב שבב מסופק, אשר אידיאלי עבור הדמיה של explants רקמות מרובות במקביל, אבל עיצובים מותאמים אישית יכולים להתגבר על מגבלות במספר המדגם כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ולהגדיל את השילוב של תנאים נוספים בתוך ניסוי אחד16,17. Microfluidics מוגבלת לדגמים שניתן לתרבות על שבב ותרבות על שבב יהיה צורך אופטימיזציה עבור כל מערכת מודל בנפרד 27,37,38.
במהלך 5-10 השנים האחרונות, microfluidics יושם כדי לטפל בשאלות ביולוגיות שונות בשל הפוטנציאל שלה גישות תפוקה גבוהה אפנון עדין של דינמיקת איתות ושיפועים. כיום, מיקרופלואידיקה הפכה לכלי ישים, זול ורב-תכליתי בקלות שמעבדות יכולות להקים בקלות. כאן, הפרוטוקול הנוכחי ממוטב עבור יישום מסוים, כלומר, לימוד דינמיקת איתות השולטת בסמיטוגנזה. זה פשוט להתאים את הפרוטוקול הזה ואת העיצוב כדי להתאים את שאלות מחקר בודדים בביולוגיה רקמות.

הפיתוח נשלט על ידי תקשורת בין-תאית באמצעות מסלולי איתות. יש רק מספר מוגבל של מסלולי איתות המתזמרים היווצרות מורכבת של רקמות ובידול תאים נכון במרחב ובזמן. כדי לווסת את ריבוי התהליכים, מידע יכול להיות מקודד בדינמיקה של מסלול איתות, שינוי מסלול לאורך זמן, כגון תדירות או משך של אות 1,2.
במהלך סמיטוגנזה, רקמה סומיטית מחולקת מעת לעת מן mesoderm presomitic (PSM)3. ה- PSM מאורגן באופן מרחבי על ידי שיפועים של Wnt, גורם גדילה פיברובלסט (FGF) ואיתות חומצה רטינואית. ב- PSM הקדמי בחזית הקביעה, כאשר אותות Wnt ו- FGF נמוכים, התאים מוכנים לבידול לסומיטים. הבחנה מתרחשת כאשר גל של הפעלה תמלולית מגיע לחזית קביעה זו. בתוך PSM, Wnt, FGF, ו Notch איתות תנודה. תאים שכנים מתנדנדים מעט מחוץ לפאזה, מה שגורם לגלים של הפעלה תמלולית מתנדנדת במורד הזרם של מסלולי Wnt, FGF ו- Notch הנוסעים מהחלק האחורי ל- PSM הקדמי. בעוברי עכבר, גל תמלול מגיע לחזית הקביעה בערך כל 2 שעות ויוזם היווצרות מוכה. לימוד סומיטוגנזה על ידי הפרעה או הפעלה של מסלולי איתות יכול להמחיש את החשיבות של מסלולים אלה4,5,6,7,8,9. עם זאת, כדי להיות מסוגל לחקור את הפונקציה של דינמיקת איתות בשליטה של התנהגות הסלולר, זה חיוני כדי לווסת בעדינות נתיבי איתות במקום להפעיל או לעכב אותם לצמיתות.
כדי לווסת זמנית את פעילות מסלול האיתות בתוך עובר העכבר פילוח, Sonnen ואח ' פיתחו מערכת מיקרופלואידית10. מערכת זו מאפשרת שליטה הדוקה של זורם נוזלים בתוך מיקרוצנלים של שבב המכיל את המדגם הביולוגי11. כדי ללמוד את החשיבות של דינמיקת איתות עבור פילוח נכון של PSM, התקנה זו microfluidics מנוצל כדי לווסת את הדינמיקה איתות של שעון פילוח העכבר ex vivo. על ידי מפעילי מסלול פועם ברצף או מעכבים לתוך תא התרבות, שליטה חיצונית של הדינמיקה של Wnt, FGF, ו Notch איתות מושגת10. לדוגמה, ניתן לשנות את התקופה של מסלולים בודדים ואת יחסי הפאזה בין מסלולי איתות מתנדנדים מרובים. באמצעות הדמיה בזמן אמת בו זמנית של כתבי איתות דינמיים, ניתן לנתח את ההשפעה של אימון על המסלולים עצמם, על בידול ועל היווצרות סומיט. באמצעות רמה זו של שליטה על דינמיקת איתות, החשיבות של יחסי הפאזה בין Wnt - ו Notch איתות מסלולים במהלך somitogenesis הודגש10.
עיצובי שבבים מותאמים אישית מאפשרים שפע של אפשרויות להפרעות מרחביות בתוך הסביבה המקומית, למשל, היווצרות שיפוע יציבה12,13,14,15, הפעלה/עיכוב פועם10,16,17,18 או הפרעות מקומיות19,20 . Microfluidics יכול גם לאפשר קריאה לשחזור יותר ותפוקה גבוהה יותר עקב אוטומציה של טיפול ניסיוני21,22,23. הפרוטוקול הנוכחי נועד להביא מיקרופלואידיקה ו entrainment של תנודות איתות אנדוגני בתוך רקמות לכל מעבדת מדעי החיים סטנדרטית. גם בהיעדר ציוד מתוחכם לייצור שבבים, כגון חדר נקי וציוד לליתוגרפיה רכה, ניתן לייצר שבבים מיקרופלואידיים ולהשתמש בהם כדי לענות על שאלות ביולוגיות. ניתן לעצב תבניות באמצעות תוכנת עיצוב (CAD) הזמינה באופן חופשי בעזרת מחשב. תבנית לייצור שבבים מיקרופלואידיים, המורכבת בדרך כלל מפולידימתילסילוקסן (PDMS), ניתנת להדפסה עם מדפסת תלת-ממד, או להזמין מחברות הדפסה. בדרך זו, שבבים microfluidic ניתן לייצר בתוך יום אחד ללא הדרישה של ציוד יקר24. כאן, עיצוב שבב מסופק, שבו עובש עבור entrainment של שעון פילוח העכבר בתרבויות ex vivo דו-ממדי (2D) ex vivo25 ניתן להדפיס עם מדפסת 3D.
תרביות על שבב ו ההפרעות המדויקות, המופעלות על ידי מיקרופלואידיקה, מחזיקות בפוטנציאל יוצא מן הכלל בפענוח המנגנונים המולקולריים של האופן שבו מסלולי איתות שולטים בהתנהגות רב-תאית. דינמיקת איתות ושיפועי מורפוגן נדרשים לתהליכים רבים בפיתוח. בעבר, מעבדות היו תאים תרבית, רקמות ואורגניזמים שלמים שבבים microfluidic ופרוטוקולים עבור הפרעה spatiotemporal של תרבית תאים דו-ממדיים בעיקר מסופקים במקומות אחרים 12,26,26,27,28,29. החלת מיקרופלואידיקה לווסת סביבות מקומיות במערכות רב-תאיות פותחת נקודות מבט חדשות עבור הפרעות מרחביות בעלות תפוקה גבוהה ומדויקות. תחום המיקרופלואידיקה הגיע כעת לנקודה שהוא הפך לכלי לא מומחה, זול וישים בקלות לביולוגים התפתחותיים.
כאן, פרוטוקול עבור entrainment של שעון פילוח העכבר לפולסים של מעכב איתות חריץ מסופק. ניסוי כזה מורכב מהשלבים הבאים: (1) ייצור שבב מיקרופלואידי, (2) הכנת צינורות וציפוי של השבב, ו-(3) הניסוי המיקרופלואידי עצמו (איור 1A). מחקרים הקשורים למערכות מודל בעלי חוליות דורשים אישור אתי מוקדם מהוועדה האחראית.

<table><tbody><tr><td>מזרק 10 מ"ל</td><td>בקטון, דיקינסון והחברה</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>184 חומר ריפוי סיליקון אלסטומר</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>184 סיליקון אלסטומר PDMS</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים 3 מ"ל</td><td>בקטון, דיקינסון והחברה</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>סרט</td><td></td><td></td> דבק <td>סקוטש מג'יק טייפ או דומה</td></tr><tr><td>מלקחיים עם קצה קהה Bochem 18/10 נירוסטה</td><td>Fisher Scientific</td><td>10663341</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין Lyophilized pH~7</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>מערכת</td><td></td><td></td><td></td>אוויר דחוס</tr><tr><td>צלחת התגבשות</td><td>VWR</td><td>10754-7</td><td>מעוקר</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז 45%</td> <td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>מייבש</td><td>VWR</td><td>467-0104</td><td></td></tr><tr><td>כוסות חד פעמיות</td><td>Duni</td><td>173 941</td><td></td></tr><tr><td>מזלגות חד פעמיים</td><td>סיכות</td><td>511514</td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td>דיסקציה</tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>טכנולוגיות תרבית תאים</td><td>מותאמות אישית</td><td>DMEM/F-12, ללא פנול אדום, ללא L-גלוטמין, ללא גלוקוז</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>מכסה מנוע זרימה BioVanguard Greenline</td><td>CleanAir על ידי Baker</td><td>511514</td><td>עבור מקור אור UV</td></tr><tr><td>זכוכית שקופית מס 1.5H דיוק גבוה, 70x70 מ"מ</td><td>Marienfeld</td><td>107999098</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Leica SP8 MP</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 22G</td><td>Becton, dickinson ו company</td><td>z412139-100EA</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td>VWR</td><td>390-09</td><td></td></tr><tr><td>PBS0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>תנור פלזמה Femto</td><td>Diener אלקטרוני</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוף ואוסלאש; 1 מ"מ</td><td>חד ליבת</td><td>WB100073</td><td></td></tr><tr><td>סולם</td><td>Sartorius</td><td>Entris</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>WPI</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ואוסלאש; 1 מ"מ</td><td>APT</td><td>AWG24T</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>VWR</td><td>181-0308</td><td></td></tr></tbody></table>

גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

פילוח תקופתי של המזודרם הפרזומיטי של עובר עכבר מתפתח נשלט על ידי רשת של מסלולי איתות. תנודות איתות ושיפועים נחשבים לשלוט על התזמון והמרווח של היווצרות קטע, בהתאמה. בעוד מסלולי איתות המעורבים נחקרו בהרחבה בעשורים האחרונים, ראיות ישירות לתפקוד של איתות תנודות בשליטה סומיטוגנזה כבר חסר. כדי לאפשר חקירה פונקציונלית של דינמיקת איתות, microfluidics הוא כלי שהוקם בעבר עבור אפנון עדין של דינמיקה זו. עם זה microfluidics מבוסס entrainment גישה אנדוגני איתות תנודות מסונכרנות על ידי פולסים של אפננים מסלול. זה מאפשר אפנון של, למשל, תקופת התנודה או את הפאזה-יחסים בין שני מסלולים מתנדנדים. יתר על כן, שיפועים מרחביים של אפננים מסלול ניתן להקים לאורך הרקמה כדי ללמוד כיצד שינויים ספציפיים בשיפועי איתות להשפיע על סמיטוגנזה.
הפרוטוקול הנוכחי נועד לעזור ליצור גישות מיקרופלואידיות עבור המשתמשים הראשונים של מיקרופלואידיקה. העקרונות הבסיסיים והציוד הדרושים להקמת מערכת מיקרופלואידית מתוארים, וניתן עיצוב שבב, שאיתו ניתן להכין תבנית לייצור שבבים בנוחות באמצעות מדפסת תלת-ממד. לבסוף, כיצד לתרבות רקמת עכבר ראשית על שבב microfluidic וכיצד לאמן תנודות איתות לפולסים חיצוניים של אפננים מסלול נדונים.
מערכת מיקרופלואידית זו יכולה להיות מותאמת גם לאספקת מערכות מודל אחרות של vivo ו - vio במבחנה כגון gastruloids ו organoids לחקירה פונקציונלית של דינמיקת איתות ושיפועי מורפוגן בהקשרים אחרים.

עם פרוטוקול זה, מוצגת שיטה לאימון חיצוני של תנודות איתות של שעון פילוח העכבר באמצעות מיקרופלואידיקה. על ידי החלת פולסים של מעכב איתות Notch, איתות תנודות בתרבויות עובר עצמאיות לקבל מסונכרן זה לזה10. תנאי מוקדם ליישום של מערכת זו כדי ללמוד את הפונקציונליות של שעון הפילוח הוא כי דינמיקת איתות וסגמנטציה עדיין קיימים על שבב. בעבר הוכח כי הן דינמיקת האיתות של Wnt והן של Notch נשמרות למרות זרימה בינונית מתמדת ויצירת גבולות פיזיים נמשכת בתרבויות דו-ממדיות היקפיות, המייצגות את PSM10 הקדמי.
כדי לאשר אימון של תנודות איתות לפולסים תרופתיים חיצוניים, הדמיה בזמן אמת של, למשל, כתב איתות Notch LuVeLu5, המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי הצהוב ונוס, במהלך הניסוי המיקרופלואידי מבוצעת. מאז אוריינטציה של תרביות 2D על שבב קשה לשלוט, תנודות איתות ברקמה הקדמית מנותחים. ניתן לזהות את הפריפריה של התרבות הדו-ממדית. הכיוון של מקטעי הרקמה על השבב לא ניתן לשלוט כרצונו ואת כל פני השטח הפנימיים של השבב מקבל מצופה פיברונקטין. לכן, זה קורה מדי פעם כי תרבויות לצרף את הצדדים או התקרה של השבב. במקרה שהדגימות יוצאות משדה הראייה (בכיוון x, y ו- z) או שהן מתחברות לקצה האחורי של הזנב הפונה כלפי מטה, בדרך כלל דגימות אלה אינן נכללות.
לניתוח נוסף, משולבים מספר רב של ניסויי אימון כאלה. ניסויים עצמאיים יכולים להיות מיושרים זה לזה באמצעות התזמון של פולסים סמים דמיינו על ידי הצבע, Cascade כחול, על כ 400 ננומטר. כדי לנתח ולהציג סינכרון באופן חזותי, ניתן לבטל תנודות מכמתות (איור 2B,D) ולאחר מכן להציגן כממוצע וניתן לחשב סטיית תקן או שלבים של התנודות. זה מאפשר ניתוח של יחסי הפאזה בין תנודות של תרבויות עובר אחוריות עצמאיות זה לזה לבין פולסים סמים חיצוניים (איור 2C,E). התוכנית המבוססת על פיתון pyBOAT33 היא כלי פשוט וידידותי למשתמש כדי לקבוע תקופה, שלב, משרעת של תנודות איתות כאלה. כדי לאשר אימון, אפשר, למשל, לקבוע את התקופה של תנודות איתות אנדוגני. בעת החלת פולסים בפרק זמן של 130 דקות, תנודות איתות נוטש מציגות גם פרק זמן של 130 דקות (איור 2F)10. בנוסף, באמצעות פולסים כחולים מפל, ניסויים עצמאיים עם כתבי איתות שונים יכולים להיות מיושרים זה לזה. בדרך זו ניתן לקבוע בעקיפין את יחסי הפאזה בין תנודות של כתבי איתות מרובים.
לכן, המערכת המיקרופלואידית המוצגת מאפשרת שליטה על תנודות איתות בתרבויות ex vivo של עובר העכבר המתפתח. בשילוב עם הדמיה של סמנים להיווצרות קטע ובידול, מערכת זו יכולה כעת להיות מיושמת כדי לנתח כיצד מסלולי איתות של שעון הפילוח אינטראקציה וכיצד הם שולטים היווצרות somite.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול המיקרופלואידיקה. (A) ניתן לתכנן תבניות שבבים באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). עיצוב שבב כדי לאמן תנודות איתות בדגמי ex vivo של עכבר סמיטוגנזה מסופק. תבניות יכולות, למשל, להיווצר על ידי הדפסה בתלת-ממד או לפי הזמנה. שבבים מיקרופלוידיים מיוצרים על ידי דפוס של PDMS. שבב PDMS מוקשח נחתך ונקשר באופן קוולנטי למגלשת זכוכית באמצעות תנור פלזמה. משטח הזכוכית בתוך השבב מצופה פיברונקטין כדי לאפשר לרקמה המנותחת להתחבר. רקמה עוברית נטענת על השבב באמצעות מפרצונים טעינה, אשר נסגרים לאחר מכן. משאבות עם תנאי מדיה שונים מחוברות לכניסות השבב ותוכנית זרימה מאותחלת. ניתן לצלם רקמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי במהלך הניסוי. (קימוגרפיות מעובדות מתוך Sonnen et al., 201810. הודפס מחדש ושונה מהתא בהתאם לייחוס Creative Commons CC BY-NC-ND 4.0.) (B) ציור סכמטי של עיצוב עובש לתרבות על שבב של רקמת עובר עכבר אחורית. הגובה של הערוצים המיקרופלואידיים הוא 500 מיקרומטר, מספיק לתרבות זנבות העכבר העובריים האחוריים. הקובץ להדפסת תבנית זו מסופק בקובץ משלים 1, ואלטרנטיבה ניתנת בקובץ משלים 2. (ג) תמונת ברייטפילד של זנב עכבר חתוך E10.5 המוקף בעמודי PDMS על השבב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig02.jpg"> איור 2: תוצאות מייצגות מניסוי מיקרופלואידיקה. (א) ייצוג סכמטי של ניסוי אימון עם משאבה בינונית ותרופות. פולסים של אפנן מסלול איתות מוחלים על תרבויות ex vivo של עוברי עכבר ואת תנודות איתות ניתן לדמיין על ידי הדמיה בזמן אמת של כתבים איתות דינמי (למשל, נוטש איתות כתב LuVeLu5 ו Wnt איתות כתב Axin2T2A10). קווים מקווקווים מציינים את האזור המשמש לניתוחים לאורך זמן. (ב-פ) תנודות כתב LuVeLu הם entrained על ידי פולסים תקופתיים של DAPT מעכב איתות Notch. (ב,ד) כימותים של תנודות איתות חריץ ב- PSM הקדמי בעת אימון באמצעות DAPT או פקד DMSO. (ג,ה) התוויות קשר פאזה-פאזה בין השלב של תנודות איתות Notch ואת התזמון של פולסים DAPT / DMSO חיצוניים. במקרה של אימון, נוצר קשר פאזה יציב. (ו) כימות התקופה הממוצעת ו- SEM של תנודות עיתונאיות המשווה דגימות המורכבות עם פולסים DMSO ו- DAPT. (איור מעובד מסונת אל, 201810). הודפס מחדש ושונה מהתא בהתאם לייחוס Creative Commons CC BY-NC-ND 4.0.). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>בעיה</td>
			<td>פתרונות מוצעים</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">ה-PDMS לא מתחבר לזכוכית.</td>
			<td>- ודא גם PDMS וזכוכית נקיים.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- ודא שיש מספיק PDMS סביב התא עבור מליטה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- לייעל את ההגדרות של תנור הפלזמה.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">יש בועות אוויר על השבב שלי.</td>
			<td>תבדוק אם המשאבה הופעלה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- דגה השבב לפני טעינת רקמה על השבב.</td>
		</tr>
<tr>
<td>דגה המדיום לפני תחילת הניסוי.</td>
		</tr>
<tr>
<td>תוודא שהלחות בתא הדגירה גבוהה מספיק.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">הרקמה מתה בתחילת הניסוי.</td>
			<td>- הוסף HEPES למדיום בעת טעינה והרכבת השבב.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- אין לשטוף את הרקמה פנימה והחוצה לעתים קרובות מדי במהלך הטעינה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- ודא כי קצב הזרימה אינו גבוה מדי.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">הרקמה מתה במהלך ההדמיה.</td>
			<td>- ודא שאין פוטוטוקסיה מההדמיה</td>
		</tr>
<tr>
<td>תוודא שאין זיהום.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- קצב הזרימה לא צריך להיות גבוה מדי.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">המוקד משתנה במהלך ההדמיה.</td>
			<td>- השתמש במיקוד אוטומטי במהלך ההדמיה כדי להתאים את הסחף של שקופית ההדמיה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- תן לשבב להתכווץ לטמפרטורה בתוך המיקרוסקופ למשך 30 דקות לפחות.</td>
		</tr>
<tr>
<td>שקעים / מפרצונים מתנתקים.</td>
			<td>- לדחוף את כל הצינורות לחלוטין למטה לתחתית.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">השבב נשברת.</td>
			<td>תיזהר יותר, הזכוכית מאוד שברירית.</td>
		</tr>
<tr>
<td>הזכוכית הדקה נדרשת רק להדמיה. אם הדמיה אינה מבוצעת, ניתן להשתמש במגלשת זכוכית עבה רגילה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- אם ההפסקה היא מחוץ לשבב, זה לא יכול להיות בעיה. אם חותם הזכוכית לשבב שבור, הנוזל ידלוף החוצה והאוויר ייכנס.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">יש זיהום על השבב שלי.</td>
			<td>תוסיף אנטיביוטיקה למדיום התרבותי.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- לחטא את כל הציוד וצינורות.</td>
		</tr>
<tr>
<td>תעבדו מהר ונקי.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פתרון בעיות
קובץ משלים 1: קובץ STL להדפסת תבנית עם מדפסת תלת-ממד. תבנית זו משמשת ליצירת שבב מיקרופלואידי לתרבות על השבב של הרקמה העוברית האחורית (עיצוב המוצג באיור 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-1.stl" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: קובץ STL להדפסת תבנית עם מדפסת תלת-ממד ליצירת שבב מיקרופלואידי לתרבות על השבב של הרקמה העוברית האחורית. בניגוד לקובץ המשלים 1 ולעיצוב המוצג באיור 1, עיצוב זה מכיל מלכודות בועות בכל הכניסות כדי למנוע מכמויות קטנות של אוויר להיכנס לתא המיקרופלואידי הראשי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-2.stl" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: עצב קובץ עבור יצירת מחזיק כדי למקם את השבב במיקרוסקופ. למחזיק זה יש את הממדים של צלחת 96 בארות והוא צריך להתאים למחזיקים סטנדרטיים של רוב המיקרוסקופים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-3.dwg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול לתרבות ומניפולציה של רקמת עובר עכבר על שבב microfluidic מסופק. על ידי החלת פולסים של אפננים מסלול, מערכת זו יכולה לשמש כדי לשלוט חיצונית תנודות איתות לחקירה פונקציונלית של סמיטוגנזה עכבר.

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

מסלולי איתות השולטים במערכות רב-תאיות הם דינמיים. כדי להבין את הפונקציה של דינמיקה זו, זה חיוני כדי להיות מסוגל לווסת בעדינות דינמיקה זו מבלי להשפיע על פעילות איתות הכוללת. פרוטוקול זה משתמש במערכת מיקרופלואידית המאפשרת ניתוח פונקציונלי של תנודות איתות בפיתוח עוברי עכבר.דינמיקת איתות נמצאה ברקמות רבות, כולל אלה של מבוגרים. Microfluidics הוא כלי רב-תכליתי שניתן להתאים למערכות מודל רבות, כולל תרבויות תאים, רקמות ואורגנוידים. כדי להתחיל, להכין את הכמות הנדרשת של PDMS על ידי ערבוב מונומר עם הזרז ביחס תשע לאחד כדי לגרום פילמור.השתמש בכלים חד פעמיים וודא כי ערבוב מושגת כראוי. מניחים את תערובת PDMS במייבש ומניחים ואקום במשך כ -30 דקות כדי להסיר אוויר. יוצקים שכבת PDMS של כשלושה עד חמישה מילימטרים לתוך תבנית השבב ומחזירים למייבש במשך כ -30 דקות.לרפא את התבנית על ידי הצבתו בתנור לילה ב 65 מעלות צלזיוס או נמוך יותר בהתאם לחומר עובש. חותכים את השבב מהתבנית באמצעות אזמל. חורי מפרצון ושקע אגרוף עם אגרוף ביופסיה מילימטר אחד החל מבפנים של התא microfluidic.נקו את מגלשת הזכוכית עם אוויר דחוס. כדי לחבר את השבב למגלשת הזכוכית, מניחים את שקופית השבב והזכוכית לתנור הפלזמה עם הצדדים להיות מלוכדים כלפי מעלה. צור פלזמה באמצעות הפרוטוקול הספציפי למכונה המשומשת, ולאחר מכן קשר את השבב לזכוכית על ידי הצבת המשטחים הפעילים אחד על השני והפעלת לחץ באופן שווה.כדי להכין את הצינורות ואת השבב לניסוי, לחתוך את הצינורות בזווית של 45 מעלות ולחבר מחט אחת לכל אחד הצינורות. מניחים את הצינורות עם מחטים, השבב, ואת התקעים בצלחת לחטא אותם על ידי חשיפה לאור אולטרה סגול במשך כ 15 דקות. כדי לצפות את השבב עם פיברונקטין, מניחים את השבב בכוס המכילה PBS בתוספת 1% פניצילין או סטרפטומיצין בטמפרטורת החדר.יש לשטוף את השבב עם PBS כדי להסיר אוויר עם פיפטה P200. טען מזרק 3 מיליליטר לכל תא של השבב. חבר את המחט למזרק המכיל פיברונקטין וחבר את המזרק למשאבת המזרק.יש לשטוף צינורות באופן ידני כדי להסיר אוויר. חבר את צינורות השקע לשקע של השבב. הקפד לדחוף את הצינורות כל הדרך לתחתית ולקבוע קצב זרימה נמוך כדי לצפות את השבב.תן למשאבת המזרק לפעול לפחות שעתיים או לילה. בסיום, עצרו את המשאבה וחתכו את הצינורות מיד לאחר המחט. הכן מזרקים מלאים במדיום לניסוי ודגים הן את מדיום התרבות והן את השבב בתוך PBS.נסה לשטוף החוצה או למצוץ את רוב בועות האוויר מהשבב, ולאחר מכן להתקין מזרקים במשאבות ולחבר צינורות מפרצון למזרקים. כדי לטעון רקמות על השבב, לנתח את הקצה האחורי ביותר של הזנב. לשטוף את השבב עם מדיום תרבות עם 25 HEPES micromolar כדי להסיר את PBS.טען את הרקמה לתוך השבב באמצעות פיפטה P200. לאחר כל שלב טעינת רקמות, סגור את הכניסה המתאימה לטעינת רקמות באמצעות חתיכת צינורות מלאים PDMS. כדי להרכיב את ההתקנה המיקרופלואידית, חברו צינורות לשבב המיקרופלואידי מבלי להכניס פנימה בועות אוויר.כדי לעשות זאת, ודא כי יש טיפה של נוכח בינוני בסוף הצינורות. לאחר שכל הצינורות מחוברים לשבב, מוציאים אותו מהכוס ומניחים אותו בצלחת המכילה רקמה רטובה. שים את המנה וכ 1.5 מטר של צינורות מפרצון באינקובטור לתרבות לילה.להבטיח לחות גבוהה כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר במהלך התרבות. לחלופין, לייבש את החלק החיצוני של השבב ולהניח אותו במחזיק מיקרוסקופ, ולאחר מכן לשים את המחזיק כ 1.5 מטר של צינורות מפרצון בתוך תא הדגירה של מיקרוסקופ הפוך לניסוי הדמיה חי. לאחר לפחות 20 דקות של זרימה מתמדת, התחל את השאיבה המתוכננת לניסוי.כדי לאמן איתות חריץ בעובר העכבר פילוח, להשתמש בתוכנית שאיבה של 100 דקות בינוני ו 30 דקות פולסים סמים חוזרים על עצמו עד סוף הניסוי, בדרך כלל במשך 24 שעות. להדמיה בזמן אמת, התחילו בהדמיה לאחר 30 דקות לפחות. כדי לאשר אימון של תנודות איתות, ניסויים מרובים מיושרים באמצעות התזמון של פולסים התרופה ודמיינו עם צבע כחול מפל.תנודות מכמתות ניתן לבטל ולהציג כממוצע סטיות תקן או שלבים של התנודות ניתן לחשב. ניתן לנתח את הקשר הפאזה בין תנודות של תרבויות עובריות אחוריות עצמאיות זו לזו ולפולסות התרופה החיצוניות. כדי לאשר אימון, אפשר למשל לקבוע את התקופה של תנודות איתות אנדוגני באמצעות pyBOAT תוכנית המבוססת על פייתון.בעת החלת פולסים עם פרק זמן של 130 דקות, תנודות איתות חריץ גם להראות תקופה של 130 דקות. זה קריטי כדי למנוע את אידוי של נוזל במהלך הניסוי microfluidic. אחרת, בועות אוויר ייווצרו בשבב שמפריעות לזרימה בינונית.כדי למנוע זאת, degas המדיום ואת השבב ולוודא כי הלחות באינקובטור הוא גבוה מספיק. באמצעות שיטה זו, דינמיקת איתות ניתן לאפות וניתן לנתח את השפעותיהם על ידי הדמיה בזמן אמת של כתבים פלואורסצנטיים, חיסונים, או בהכלאה במקום. יתר על כן, ניתן גם לחלץ את הרקמה מהשבב לניתוח נוסף.אפשר להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את הפונקציה של איתות תנודות בהתפתחות עוברית. זה הוחל כדי להדגים את החשיבות של המעבר פאזה בין שני נתיבי איתות מתנדנד עבור פילוח של עובר העכבר. באופן כללי יותר, כעת ניתן להשתמש בו כדי לנתח את המנגנון של קידוד איתות דינמי במערכות רב-תאיות.

a-microfluidics-approach-for-functional-investigation-signaling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

Somitogenesis הוא תהליך התפתחותי קצבי שמרחבית דפוסי ציר הגוף של עוברי החולייתנים. בעבר, פיתחנו קווי דג הזברה מהונדסים המשתמשים בכתבי ניאון להתבונן גנים מחזוריים המניע את התהליך הזה. כאן, אנו תרבות מפוזרת תאים משורות אלה ותמונת התנודות שלהם לאורך זמן במבחנה.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

עירורים אופטו-מכניים פרמטריים הודגמו לאחרונה בניסוי בתהודה אופטומכנית מיקרופלואידית באמצעות לחץ קרינה אופטי ופיזור ברילואין מגורה. מאמר זה מתאר את הייצור של מהודים מיקרופלואידיים אלה יחד עם מתודולוגיות ליצירה ואימות של תנודות אופטומכניות.

ייצור ובדיקה של מתנדים optomechanical Microfluidic

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

שעון הסגמנטציה מניע ביטוי גנים תנודתי על פני המזודרם הקדם-סומיטי (PSM). פעילות חריץ דינמית היא המפתח לתהליך זה. אנו משתמשים בהדמיה וניתוחים חישוביים כדי לחלץ דינמיקה זמנית מנתוני ביטוי מרחבי כדי להוכיח שביטוי ליגנד דלתא וקולטן Notch מתנדנד ב-PSM של בעלי חוליות.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

העדר כלים למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו מונע אימות התפקידים שלהם במהלך הפיתוח. אנחנו מועסקים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומעקב nanoparticle לכמת תכונות מכניות על התא חלמון העובר תקין דג זברה במהלך epiboly. שיטות אלה הינם אמינים החלים נרחב הימנעות התערבויות פולשניות.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

הפרוטוקול מדגים שיטה נוחה להפקת זרימה מתנדתית הרמונית מ-10-1000 הרץ במיקרו-ערוצים. זה נעשה על ידי התממשקות דיאפרגמה רמקול מבוקרת מחשב למיקרו-ערוץ באופן מודולרי.

הרכבה ואפיון של דרייבר חיצוני ליצירת זרימה תנודתית תת-קילוהרץ במיקרו-ערוצים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנון, ייצור ואפיון של מערכת מיקרופלואידית המסוגלת ליישר, לשתק ולדחוס במדויק מאות עוברי Drosophila melanogaster עם התערבות מינימלית של המשתמש. מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור של דגימות לניתוח לאחר גירוי וניתן לשנות את קנה המידה שלה כך שיתאים למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.

מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור והפעלה של מערכת מיקרופלואידית החושפת תאי אנדותל להיפרגליקמיה אוסצילטורית מסונכרנת ולמתח גזירה פועם. גישה זו מספקת מודל פיזיולוגי רלוונטי לחקר תפקוד לקוי של אנדותל סוכרתי. פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של לחץ חמצוני ותגובות תאי אנדותל.

מערכת מיקרופלואידית למידול תפקוד לקוי של האנדותל תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי פועם והיפרגליקמיה אוסצילטורית

חקור מערכת מיקרופלואידיקה לניתוח תנודות איתות בעוברי עכברים מתפתחים. השיטה מאפשרת מודולציה מדויקת של דינמיקת האיתות וסינכרון אוסצילציות אנדוגניות לחקירת מנגנוני סמיטוגנזה.

גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה

גלה סרטונים נוספים