Name: ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: חקור אינטראקציות חלבון-ליגנד בזמן אמת בתאים אנושיים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR בתוך התא עם ביוריאקטור ייעודי. השיטה מאפשרת ניטור אטומי של תהליכים ביולוגיים דינמיים ומאפשרת ניתוח כמותי באמצעות MCR-ALS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery, מספר מענק 871037, במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית, על ידי Instruct-ULTRA, מספר מענק 731005, פרויקט H2020 של האיחוד האירופי לפיתוח נוסף של השירותים של Instruct-ERIC, ועל ידי Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca PRIN גרנט 20177XJCHX. המחברים מכירים בתמיכתו של Instruct-ERIC, פרויקט ESFRI לנדמרק, באמצעות פרס JRA מספר 815 ושימוש במשאבים של מרכז CERM / CIRMMP איטליה. אנו מודים למתיאו פניסטרי (ברוקר, בריטניה) על מתן התמיכה בפעולת יחידת הזרימה InsightMR.

<ol><li>Inomata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+multi-dimensional+NMR+spectroscopy+of+proteins+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells.</a> Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).</li>
<li>Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR%3A+a+topical+review%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR: a topical review.</a> IUCrJ. 4, Pt 2 108-118 (2017).</li>
<li>Dzatko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+stability+of+DNA+i-motifs+in+the+nuclei+of+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).</li>
<li>Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+in+human+cells%3A+direct+protein+expression+allows+structural+studies+of+protein+folding+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+protein+3D+structure+determination+in+living+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).</li>
<li>Siegal, G., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells%2C+drugs+and+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Cells, drugs and NMR.</a> Journal of Magnetic Resonance. 306, San Diego, Calif. 202-212 (1997).</li>
<li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+monitoring+of+protein+maturation+in+live+human+cells+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR.</a> Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).</li>
<li>Luchinat, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+reveals+potential+precursor+of+toxic+species+from+SOD1+fALS+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants.</a> Nature Communications. 5, 5502(2014).</li>
<li>Theillet, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+disorder+of+monomeric+%CE%B1-synuclein+persists+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells.</a> Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).</li>
<li>Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+metal+binding+and+redox+behavior+of+human+DJ-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+inorganic+chemistry%3A+JBIC%3A+A+Publication+of+the+Society+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1.</a> Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).</li>
<li>Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+redox-controlled+protein+fold+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of redox-controlled protein fold in living cells.</a> Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).</li>
<li>Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+structural+evidence+of+protein+redox+regulation+obtained+by+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).</li>
<li>Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+patterns+in+different+cellular+environments+are+revealed+by+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR.</a> Scientific Reports. 5, 14456(2015).</li>
<li>Luchinat, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+human+cells+by+NMR+spectroscopy+allows+the+early+assessment+of+drug+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).</li>
<li>Luchinat, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+binding%2Funbinding+kinetics+of+approved+drugs+to+carbonic+anhydrase+II+observed+by+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR.</a> ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).</li>
<li>DeMott, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+inhibitors+of+mycobacterium+tuberculosis+growth+identified+by+using+in-cell+NMR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).</li>
<li>Krafcikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+DNA-ligand+interactions+in+living+human+cells+using+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).</li>
<li>Broft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+of+functional+riboswitch+aptamers+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).</li>
<li>Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioreactor+for+in-cell+protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+magnetic+resonance%22%5BJournal%5D)">A bioreactor for in-cell protein NMR.</a> Journal of magnetic resonance. 202 (2), San Diego, Calif. 140-146 (2010).</li>
<li>Kubo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel-encapsulated+bioreactor+system+for+NMR+studies+of+protein-protein+interactions+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).</li>
<li>Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cellular+health+conditions+on+the+protein+folding+state+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells.</a> Chemical Communications. 53 (81), Cambridge, England. 11245-11248 (2017).</li>
<li>Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in-cell+nuclear+magnetic+resonance%3A+ribosome-targeted+antibiotics+modulate+quinary+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions.</a> Biochemistry. 57 (5), 540-546 (2018).</li>
<li>Cerofolini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+insights+into+biological+events%3A+in-cell+processes+and+protein-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions.</a> Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).</li>
<li>Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+metabolism+unmasks+functional+protein-protein+interactions+in+real+time+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR.</a> Communications Biology. 3, (2020).</li>
<li>Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+in-cell+NMR%3A+ligand+binding+and+protein+oxidation+monitored+in+human+cells+using+multivariate+curve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution.</a> Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).</li>
<li>Koczula, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+plasticity+in+CLL%3A+adaptation+to+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche.</a> Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).</li>
<li>Alshamleh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+NMR+spectroscopy+for+studying+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).</li>
<li>Supuran, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrases%3A+novel+therapeutic+applications+for+inhibitors+and+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).</li>
<li>Neri, D., Supuran, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+pH+regulation+in+tumours+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).</li>
<li>Alterio, V., Di Fiore, A., D'Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+binding+modes+of+inhibitors+to+carbonic+anhydrases%3A+how+to+design+specific+drugs+targeting+15+different+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms.</a> Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).</li>
<li>Capper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cysteine-reactive+small+molecule+ebselen+facilitates+effective+SOD1+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation.</a> Nature Communications. 9 (1), 1693(2018).</li>
<li>Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+in+health+and+disease%3A+How+a+front-line+antioxidant+becomes+neurotoxic%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).</li>
<li>Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+curve+resolution+applied+to+second+order+data%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Multivariate curve resolution applied to second order data.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).</li>
<li>Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proteins+by+in-cell+NMR+spectroscopy+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR+spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions.</a> Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).</li>
<li>Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+a+large+enzyme-drug+complex+by+proton-detected+solid-state+NMR+spectroscopy+without+deuteration%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).</li>
<li>Schanda, P., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+fast+two-dimensional+NMR+spectroscopy+for+real-time+investigation+of+dynamic+events+in+proteins+on+the+time+scale+of+seconds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).</li>
<li>Ogino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+NMR+signals+from+proteins+introduced+into+living+mammalian+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+using+a+pore-forming+toxin%2C+streptolysin+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים.

המטרה של שימוש bioreactor לניסוי NMR בתוך התא היא לשמור על תאים בחיים ופעיל מטבולית במשך תקופה ממושכת של זמן. יש לקחת בחשבון מספר היבטים קריטיים כדי להשיג מטרה זו. ראשית, יש חשיבות עליונה להימנע מזיהום חיידקי בעת הכנת דגימת התא ובמהלך רכישת נתוני NMR. אם זנים של E. coli או חיידקים אחרים המשמשים בדרך כלל לשיבוט גנים וביטוי חלבון רקומביננטי משמשים במעבדה, הם עלולים לזהם את התאים במהלך הכנת מדגם. פעם אחת בביוריאקטור, החיידקים יגדלו במהירות תוך ניצול מדיום הצמיחה הטרי ויגרמו למוות של תאים עקב ייצור אנדוטוקסינים. זיהום חיידקי מזוהה רק בשלב מתקדם, כאשר הוא הופך את הצמיחה בינונית צהובה ועכורה. יתר על כן, ניקוי לא שלם של bioreactor עלול לגרום לזיהום של המשאבה או צינורות עם חיידקים, שמרים, או תבניות נפוצות.
דרישה להצלחת הניסוי היא הימנעות מהיווצרות בועת גז. בועות גז שנלכדו בין חוטי האגרוז בנפח הפעיל של סליל NMR יציגו אינומוגניות של שדה מגנטי גדול, ויגרמו לדיכוי חלקי של אות H2O ולאובדן חמור של איכות ספקטרלית (איור 2d). בועות עשויות להיגרם על ידי אוויר לכוד במערכת או על ידי היווצרות של CO2 גזי. הראשון ניתן להימנע בקלות על ידי שטיפה של המערכת עם בינוני לפני החדרת מדגם התא, בעוד כדי למנוע את האחרון מומלץ להפחית את הריכוז של NaHCO3 במדיום הצמיחה, ולשמור על כל חלקי המערכת בטמפרטורה קבועה כדי למזער את ההבדלים מסיסות CO2 . חילוף החומרים האירובי התאי עלול גם לגרום להיווצרות CO2 גזי, אשר ניתן למנוע על ידי הגדלת קצב הזרימה.
יש לבדוק את הכדאיות של התא לאחר כל הפעלה על-ידי מבחן טריפאן כחול. עם זאת, זה לא מספק תובנות על הפעילות המטבולית. כדי לקבל תמונה מלאה יותר של המצב המטבולי של התאים במהלך פעולת bioreactor, ספקטרום NMR 31P יכול להתבצע כדי להעריך את הייצור של ATP כפונקציה של זמן23,25. עם זאת, בדיקה ייעודית נחוצה לעתים קרובות עבור מדידה זו, אשר עשוי לאפשר הקלטה בו זמנית עם 1H NMR.
במקרה של CA II, נוכחות של אותות עיתונאיים שנפתרו היטב באזור יוצא דופן בספקטרום 1H מקלה על הניתוח מספקטרום NMR 1D פשוט ואינה דורשת העשרת איזוטופים במהלך ביטוי חלבון. באופן כללי, חלבונים אחרים יכולים להוליד אותות 1H שימושי לניטור שינויים ספקטרליים באזורים אחרים, כגון זה אופייני של הליבה ההידרופובית חלבון בין 0 ל -1 ppm11; עם זאת, אזורים אלה נוטים להיות צפופים עבור חלבונים מקופלים גדולים מ ~ 10 kDa. במקרה זה, כפי שמוצג עבור SOD1, עדיף להעשיר את החלבון עם 15N, על ידי מתן מדיום צמיחה מועשר באופן אחיד 15N במהלך ביטוי חלבון, וכדי לפקח על שינויים בזמן אמת בספקטרום 2D 1H-15N NMR. ספקטרום דו-ממדי מיובא כמערך דו-ממדי ב- MATLAB, מסודרים מחדש למערכי 1D ומוערמים לפני ניתוח MCR-ALS. הגישה השנייה חלה בדרך כלל על כל חלבון תאי שמוליד אותות הניתנים לזיהוי, ומספקת מידע על שינויים קונפורמציה בחלבון ברמת השאריות הבודדות. באופן עקרוני, הגישה השנייה יכולה להיות מוכללת לספקטרום nD ולתוכניות אחרות של תיוג איזוטופים.
לגבי היישום לסוגים שונים של תאים, הפרוטוקול צריך להיות מותאם בקלות לקווי תאים שונים ואינו דורש כי חלבון העניין בא לידי ביטוי ישירות בתאים. לכן, גישות אחרות NMR בתוך התא ניתן לשלב עם פרוטוקול זה, שבו macromolecule של עניין מיוצר רקומביננטי, או מסונתז, ולאחר מכן מוכנס לתאים על ידי אלקטרופורציה או על ידי שיטות משלוח אחרות1,9,38. בעת עבודה עם קווי תאים שונים או פרוטוקולי הכנת מדגם, פרמטרים כגון ריכוז האגרוז, עובי החוט, ואת צפיפות התא הסופית בחוטי agarose ייתכן שיהיה צורך לייעל אמפירית. יתר על כן, תחולתו של הפרוטוקול המתואר כאן מוגבלת לתאים הסובלים אנקפסולציה agarose. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש ניסוחים הידרוג'ל שונים, ואילו התקנה שונה מומלצת בעת ניתוח תאים הגדלים באופן טבעי בהשעיה, למשל, תוך שימוש בקרום מיקרודיאליזה קואקסיאלי כדי להבטיח דיפוזיה תזונתית תוך שמירה על תאים מושעים כלואים בצינור NMR23.
בהשוואה לתכנונים אחרים של NMR bioreactor19,20,21,22, המכשיר המתואר כאן מסתמך על יחידת זרימה זמינה מסחרית, המותאמת לשינויים קלים. לכן, המכשיר יכול להיות משוכפל בקלות במעבדות שונות עם רבייה גבוהה. יתר על כן, הוא מאפשר פעולה סטנדרטית ועמידה מלאה בתקנות בטיחות מעבדה קפדניות, במידת הצורך. בסך הכל, הגמישות וקלות הפעולה של הביו-ריאקטור אמורות לאפשר יישומים רבים אחרים של פתרון NMR, הן בתאים והן במבחנה, בנוסף לאלה כפי שכבר דווחו23,25. בסופו של דבר, אותו עיצוב ביו-ריאקטור יכול להיות מיושם על דגימות הדומות יותר לסביבה הפיזיולוגית של רקמה, כגון כדוריות או אורגנוידים, בתנאי שנמצאים פיגומים מתאימים לשמירה על דגימות כאלה בחיים - או אפילו לקיים את הצמיחה שלהם - בספקטרומטר NMR.

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית בתוך התא (NMR) התגלתה לאחרונה כגישה רבת עוצמה לחקור תכונות מבניות ודינמיות של מקרומולקולות בתוך הסביבה התאית1,2,3,3,4,5,6. NMR בתוך התא הצליח בחקירה של תהליכים רלוונטיים מבחינה תפקודית כגון קיפול חלבונים/זיהוי שגוי7,8,9, כריכת מתכת7,10, היווצרות קשר דיסולפידי11,12, וחלבון−אינטראקציה חלבון−חלבון13, אינטראקציה חלבון-ליגנד14,15,16, ואינטראקציה חומצה-ליגנד גרעין17 18 בתאים אנושיים חיים. אחד הגורמים המגבילים של יישומי NMR בתוך התא הוא אורך החיים הקצר של התאים במהלך הניסוי. הפתרון לבעיה זו כרוך בשימוש ביו-ראקטורים של NMR. במכשירים אלה, זרימה מתמדת של מדיום צמיחה מוחלת על התאים, אשר נשמרים מוגבלים בתוך ספקטרומטר NMR, על מנת לספק חמצן וחומרים מזינים ולהסיר תוצרי לוואי רעילים. בעקבות הופעתו של NMR בתוך התא, פותחו מספר עיצובים של ביו-ראקטורים של NMR כדי לשפר את הכדאיות של התא לפרקי זמן ארוכים יותר, שבהם חיידקים או תאי יונקים עטופים בהידרו-ג'ל19,20,20,21,22 או נשמרים בהשעיה ומונעים באמצעות שימוש בקרום מיקרודיאליזה23 . ביו-ריאקטורים כאלה אפשרו רכישה של ניסויי NMR ארוכים יותר עם יחס אות לרעש מוגבר (S/N)5, וחשוב מכך, ניתן להשתמש בהם כדי לחקור תהליכים סלולריים בזמן אמת22,23,24. הודות לרגישות הכימית והקונפורמציה הגבוהה של NMR, היישום האחרון יכול לספק תובנות יקרות ערך על הקינטיקה של תהליכים פונקציונליים בתוך תאים חיים ברזולוציה אטומית.
בפרוטוקול זה, אנו מראים כיצד להגדיר ולהפעיל bioreactor משופר לאחרונה דיווח25, אשר הושג על ידי שילוב עיצוב bioreactor מודולרי קיים23 עם הגישה המסתמכת על אנקפסולציה התא הידרוג'ל שהיו חלוצים על ידי קבוצות אחרות19,20,20,21,22,22,26,27 . אנו מתארים את היישום של הביו-ריאקטור למחקרי NMR בתוך התא בזמן אמת של ליגנד תאיים עם ליגנד בתאי HEK293T. ב bioreactor, תאים הם encapsulated בצפיפות גבוהה בחוטי ג'ל agarose והם נשמרים קיימא מאוד ופעיל מטבולית עד 72 שעות, שבמהלכו ניסויים NMR בזמן אמת בתא נרשמים. הביו-ריאקטור מורכב מצינור זכוכית שמתאים לבדיקות NMR סטנדרטיות בקוטר 5 מ"מ, האטום למים ומחובר למחזיק צינור, כך שלתא המדגם הפנימי יש קוטר פנימי של 4.2 מ"מ, גובה 38 מ"מ ונפח של 526 μL. הכניסה היא נימי PEEK באורך 7 מטר (o.d. = 1/32 אינץ', כלומר = 0.5 מ"מ) המוחדר לתא המדגם עד ~ 6 מ"מ מלמטה, ואילו השקע הוא נימי PTFE באורך 7 מטר (O.d. = 1/32 אינץ', כלומר = 0.5 מ"מ) המחובר בחלק העליון של מחזיק הצינור (איור 1). הצינורות מוכנסים באופן קואקסיאלי לקו מבוקר טמפרטורה המחובר לאמבטיית מים. הכניסה והשקע מחוברים באמצעות צינורות PEEK לשסתום דו-כיווני בעל 4 כיוונים המחובר למשאבת FPLC לשליטה בזרימה הבינונית ובמכל פסולת.
הביו-ריאקטור מוחל כדי לחקור את הקינטיקה של האינטראקציה, שדווחה בעבר14,25, בין שתי תרופות, פרצטזולמיד (AAZ) ומתאזולמיד (MZA), בתאים אנושיים עם האיזופורם השני של אנהידרז פחמתי אנושי (CA II), יעד רלוונטי מבחינה פרמקולוגית 28,29,30, ואת הקינטיקה של היווצרות הקשר הדיסולפידי תוך מולקולרי, מקודם על ידי המולקולה הקטנה ebselen25, 31, של הצורה נטולת הנחושת, אבץ קשורה של נחושת אנושית, אבץ סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD1), אנזים נוגד חמצון המעורב בהתפרצות של טרשת אמיוטרופית לרוחב7,8,32. לבסוף, ניתוח כמותי של נתוני NMR בזמן אמת מבוצע ב- MATLAB באמצעות אלגוריתם רזולוציית העקומה הרב-משתנית-חילופים -ריבועים לפחות מתחלפים (MCR-ALS) 33, שבאמצעותו הרכיבים הספקטרליים הטהורים ופרופילי הריכוז כפונקציה של זמן מתקבלים עבור המינים שנצפו, שניתן לנתח עוד יותר כדי לקבל פרמטרים קינטיים רלוונטיים.
הפרוטוקול מתחיל מבקבוק T75 של תאי HEK293T (~ 3 x 107 תאים לבקבוק) המבטא באופן חולף יתר על המידה CA II אנושי (ללא תווית) או SOD1 אנושי (15N שכותרתו). התאים גדלו ונשמרו בבקבוקונים T75 עם גלוקוז גבוה DMEM על ידי 1:10 קטעים כל 3-4 ימים ו transfected עם cDNA קידוד החלבון של עניין 48 שעות לפני הניסוי. השלבים המעורבים בשלב זה מדווחים בפירוט במקום אחר34.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>453366</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>Life Technologies</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, אבקת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td> <td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז דל ג'לינג, אבקת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, אבקה</td><td>Carlo Erba</td><td>478537</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין&ndash; סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, כדוריות</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחולה (0.4% (משקל/נפח)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>הצהרת סיכון: H350 עלול לגרום לסרטן.</td></tr><tr><td>טריפסין&ndash; EDTA (0.05% (wt/vol)))</td> <td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avance III ספקטרומטר מצויד ב-CryoProbe Bruker n/a 5 מ"מ</td><td></td><td></td><td>כל הספקטרומטרים המודרניים והמגנטים צרי הקדח המצוידים בבדיקות 5 מ"מ תואמים.</td></tr><tr><td>יחידת זרימה InsightMR</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מודול משאבה P-920 מבית &Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>n/A</td><td>כל משאבת FPLC, HPLC פריסטלטית או מזרק צריכה להיות תואמת ליחידת הזרימה.</td></tr></tbody></table>

ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי nmr כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות bioreactor צפיפות תאים גבוהה

Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor

NMR בתוך התא היא גישה ייחודית להתבונן בתכונות המבניות והדינמיות של מקרומולקולות ביולוגיות ברזולוציה אטומית ישירות בתאים חיים. ניתן לראות קיפול חלבונים, שינויים כימיים ושינויים קונפורמציה הנגרמים על ידי איגוד ליגנד. לכן, שיטה זו יש פוטנציאל גדול בהקשר של פיתוח תרופות. עם זאת, אורך החיים הקצר של תאים אנושיים המרותקים לספקטרומטר NMR מגביל את טווח היישום של NMR בתוך התא. כדי להתגבר על בעיה זו, ביו-ריאקטורים של NMR מועסקים שיכולים לשפר מאוד את יציבות מדגם התא לאורך זמן, וחשוב מכך, לאפשר הקלטה בזמן אמת של ספקטרום NMR בתוך התא. בדרך זו, האבולוציה של תהליכים כגון חדירת ליגנד וקשירה ליעד החלבון התאי ניתן לפקח בזמן אמת. Bioreactors מוגבלים לעתים קרובות על ידי הכדאיות התא נמוך במספרי תאים גבוהים, מה שמביא לפשרה בין הרגישות הכוללת של הניסוי לבין הכדאיות התא. לאחרונה דיווחנו על bioreactor NMR אשר שומר על מספר גבוה של תאים אנושיים פעיל מטבולית לתקופות ממושכות של זמן, עד 72 שעות. התקנה זו הוחלה כדי לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד ושינוי כימי חלבון. הצגנו גם זרימת עבודה לניתוח כמותי של נתוני NMR בזמן אמת, המבוססת על רזולוציית עקומה רב-משתנית. השיטה מספקת פרופילי ריכוז של המינים הכימיים הקיימים בתאים כפונקציה של זמן, אשר ניתן לנתח עוד יותר כדי לקבל פרמטרים קינטיים רלוונטיים. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הגדרת הביו-ריאקטור של NMR ויישומה לניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים.

הפרוטוקול לעיל מאפשר אנקפסולציה של תאים בחוטים של הידרוג'ל כדי למקסם את הכדאיות של התא לתקופות זמן ארוכות, הכרחי כדי לחקור בזמן אמת תהליכים תאיים. בביוריאקטור, התאים נשמרים חיים ופעילים מטבולית עד 72 שעות, כפי שאושר בבדיקה הכחולה של טריפאן (איור 2a-c). באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לבחון חלבון תאי של עניין עובר כל שינויים קונפורמציה או כימיים. ביישום הראשון שתואר לעיל, הביו-ריאקטור מוחל לפקח בזמן אמת על האיגוד של שני מעכבים, AAZ ו- MZA, ל- CA II יתר על המידה בציטוסול של תאי HEK293T. ספקטרום פיסול עירור 1H הראשון (zgesgp) שנרשם משמש להערכת עוצמת האות הכוללת (שהיא פרופורציונלית למספר התאים), נוכחות של אותות מהחלבון המובע יתר על המידה וההומוגניות בשדה (איור 2d). במקרה של CA II, האיגוד התאי של שני מעכבי ניתן לפקח על ידי WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR ספקטרום (p3919gp), על ידי התבוננות אותות 1H באזור בין 11 ל 16 עמודים לדקה. אותות אלה נובעים מהתידינים המתאמים אבץ ושאריות ארומטיות אחרות של CA II36 ומוטרדים על מחייב ליגנד 14,15. ריכוזי ליגנד יכולים להיבחר על סמך שיעור הדיפוזיה או, אם זמין, מערכי חדירות שנקבעו בעבר14. כריכה מוצלחת מאושרת חזותית על ידי הופעת קבוצה נוספת של אותות באזור הספקטרלי של עניין, המחליף בהדרגה את האותות המקוריים (איור 3). עקומות כריכה תלויות זמן מתקבלות על ידי ניתוח MCR-ALS, המפריד בין שתי קבוצות האותות NMR הנובעות מ- CA II חופשי וכבול (איור 4a) ובו זמנית מספק את פרופילי הריכוז היחסיים של שני המינים (איור 4b). ביישום השני, הביו-ריאקטור מוחל כדי לפקח על היווצרות של קשר דיסולפידי SOD1 תוך מולקולרי הקשור לאבץ המקודם על ידי ebselen, חיקוי גלוטתיון פרוקסידאז, בתאים אנושיים. תהליך זה מנוטר על ידי התבוננות בשינויים בספקטרום 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 (המספק טביעת אצבע של קונפורמציה של עמוד השדרה של החלבון) הנגרמת על ידי הפרעות של מבנה החלבון המושרה על ידי היווצרות קשר דיסולפיד. אותות נוספים הנובעים מ- SOD1 מחומצן דיסולפיד מופיעים בספקטרום 1H-15N ומחליפים בהדרגה את אלה מ- SOD1 מופחת דיסולפיד. ניתוח MCR-ALS על אזורים נבחרים בספקטרום הדו-ממדי מפריד בין האותות הנובעים משני המינים (איור 5a) ומספק את פרופילי הריכוז היחסיים שלהם (איור 5b). עקומות הריכוז המתקבלות ניתן לנתח עוד יותר על ידי התאמה לא ליניארית כדי לספק מידע על הקינטיקה של התהליכים תחת מחקר25.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig01.jpg"> איור 1: ערכת הביו-ריאקטור. משמאל: תצוגת חתך רוחב של יחידת הזרימה הריקה. מימין: ערכה של מערך הביו-ריאקטור. צינורות הכניסה PEEK מוצגים בירוק; צינורות שקע PTFE מוצגים בכחול. הלוח השמאלי משוחזר באישור Luchinat et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig02.jpg"> איור 2: בדיקת טריפאן כחולה על תאים עטופים ובדיקת מדגם על ידי 1H NMR. פרוסות מייצגות של אגרווז המכילות תאים מוטבעים ומוכתמות בכחול טריפאן (א) מיד לאחר הליהוק ו-(ב) לאחר 72 שעות בביוריאקטור; (ג) כדאיות התא כפונקציה של זמן ביו-ריאקטור NMR תחת זרימה פעילה (שחור) ובתנאים סטטיים (אדום), נמדד על ידי מבחן כחול טריפאן. (ד) ספקטרום zgesgp 1H NMR נרשם על תאים מוטבעים אגרווז overexpressing CA II בהיעדר (שחור) ובנוכחות (אדום) של בועות גז bioreactor. במקרה האחרון, ירידה בהומוגניות השדה גורמת להרחבת הקו ולהופעתם של ממצאי דיכוי ממסים. תכונות ספקטרליות מעניינות מסומנות. לוחות (a-c) משוחזרים באישור Luchinat et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig03.jpg"> איור 3: נתוני NMR מייצגים בזמן אמת בתא 1H המתקבלים על תאים עטופים באגרוז בביוריאקטור. חלקות מפל של ספקטרום 1D 1H NMR (אזור בין 15.6 ל 11.1 עמודים לדקה) של תאי HEK293T overexpressing CA II ולאחר מכן טופל עם (א) 25 מיקרומטר AAZ ו (ב) 10 מיקרומטר MZA, נרשם כפונקציה של זמן בביוריאקטור NMR. הזמן של טיפול ligand מוצג עם חץ. העוצמה הספקטרלית (a.u.) מקודדת בצבע מכחול (הנמוך ביותר) לצהוב (הגבוה ביותר). נתון זה משוחזר באישור של Luchinat et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig04.jpg"> איור 4: פלט MCR-ALS מייצג מספקטרום NMR 1D. (א) ספקטרום NMR של 1H של הרכיבים הטהורים ששוחזרו על ידי MCR-ALS: CA II בהיעדר ליגנדים (שחורים) ובמתחם עם AAZ (אדום) או MZA (מגנטה); (ב) פרופילי ריכוז יחסיים של CA II חופשי (שחור) וכבול כפונקציה של זמן עם הוספת AAZ (אדום) או MZA (מגנטה) שהתקבלו על ידי MCR-ALS. הזמנים של טיפול ליגנד מסומנים בחצים. נתון זה משוחזר באישור של Luchinat et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig05.jpg"> איור 5: תפוקת MCR-ALS מייצגת מספקטרום NMR דו-ממדי. (א) אזורים ספקטרליים של 1H-15N (המסומנים I-IV) של הרכיבים הטהורים ששוחזרו על ידי MCR-ALS: SOD1 מופחת דיסולפידים (שחור) ו-SOD1 מחומצן דיסולפידי (אדום); (ב) פרופיל ריכוז יחסי של הרכיבים הטהורים כפונקציה של זמן עם הוספת אבסלן (מסומן בחץ) שהושג על ידי MCR-ALS. נתון זה משוחזר באישור של Luchinat et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של bioreactor NMR כדי לשמור על תאים אנושיים אנקפסולציה קיימא עבור עד 72 שעות, ואחריו זמן נפתר בתוך התא NMR נתונים וניתוח. המתודולוגיה מוחלת כדי לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד תאיות בזמן אמת.

ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה

In-cell NMR is a unique approach to observe the structural and dynamic properties of biological macromolecules at atomic resolution directly in living ...

ספקטרוסקופיית NMR בתא מציעה גישה ייחודית לחקר מבנה ותפקוד החלבון ישירות בתאים חיים ולניטור תהליכים רלוונטיים ביולוגית כגון אינטראקציות חלבון-ליגנד. זה bioreactor NMR יכול לשמור על מספר גבוה של תאים אנושיים קיימא ופעיל מטבולית במשך מספר ימים בספקטרומטר, לאפשר יישומי NMR בזמן אמת בתוך התא. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל חלבון תאי מסיס, מתגלגל בחופשיות עובר שינויים קונפורמצונליים או כימיים.תיוג איזוטופים מרחיב עוד יותר את תחולת השיטה. כדי להתחיל, להרכיב את יחידת הזרימה באמצעות צינור NMR יחידת זרימה שנייה, אשר יוחלף מאוחר יותר עם אחד המכיל תאים. עיין בהוראות ההפעלה של יחידת הזרימה להרכבה נכונה.הגדר את אמבט המים המחובר לבקרת הטמפרטורה של יחידת הזרימה ל-37 מעלות צלזיוס והנח את בקבוק המאגר באמבט המים. חברו את צינורות ה-FEP של בקבוק המאגר למשאבה. סובבו את שסתום הביו-ריאקטור כדי לעקוף ולמלא מראש את המשאבה במדיום.לאחר מכן, להפוך את שסתום bioreactor לזרום מראש למלא את הביו-ריאקטור עם המדיום ב 0.1 מיליליטר לדקה. קח בקבוק T75 של תאי HEK 293 T שהודבקו מהחממה של פחמן דו חמצני ולהסיר את המדיום בילה. הוסף שני מיליליטרים של טריפסין EDTA לתאים ודגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק את התאים.להשבית את הטריפסין עם 20 מיליליטר של DMEM שלם ולהשהות ביסודיות את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה. לאחר מכן, להעביר אותם בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 800X G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.מעבירים את גלולה התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם 1.5 מיליליטר. כדי להטמיע את התאים בחוטי אגרוז, להמיס aliquot אחד של agarose מוצק ב 85 מעלות צלזיוס בתנור בלוק, ולאחר מכן לשמור אותו בתמיסה ב 37 מעלות צלזיוס בתנור בלוק. עם פיפטת פסטר, מלאו את תחתית צינור NMR של יחידת הזרימה ב-60 עד 70 מיקרוליטרים של ג'ל 1.5% אגרוז והניחו אותו על קרח כדי ליצור תקע תחתון בגובה חמישה מילימטר.לחמם את גלולה התא במשך 15 עד 20 שניות בתנור בלוק בזהירות להשעות את התאים ב 450 microliters של פתרון agarose, הימנעות היווצרות של בועות. שאפו את ההשעיה התאית/האגרוז לתוך צינורות PEEK כרומטוגרפיים באורך 30 ס"מ בקוטר פנימי של 0.75 מ"מ המחוברים למזרק של מיליליטר אחד. מניחים לצינורות להתקרר בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.מלאו מראש את צינור NMR של יחידת הזרימה ב-100 מיקרוליטרים של PBS בטמפרטורת החדר. חוטים יצוקים של תאים המוטבעים באגרוז לתוך צינור NMR יחידת הזרימה על ידי דחיפה עדינה של המזרק. הסר את צינור NMR הריק מיחידת הזרימה ולהגדיל את קצב הזרימה לשני מיליליטר לדקה במשך כמה דקות כדי להסיר בועות גז שיורית בצינורות הכניסה.הגדר את קצב הזרימה ל 0.2 מיליליטר לדקה והכנס את צינור NMR המכיל את התאים על ידי דחיפתו כלפי מעלה לאט אך בהתמדה. ספק את מדיום הביו-ריאקטור בקצב זרימה של 0.1 מיליליטר לדקה. הגדר את הטמפרטורה בספקטרומטר NMR ל 310 קלווין והכנס את יחידת הזרימה בספקטרומטר.לאחר הביו-ריאקטור מוכנס לספקטרומטר NMR, המתן מספר דקות כדי לאפשר את ההחלפה הבינונית. התאם את ההתאמה והכוונון של ערוץ הפרוטון, כוון את המגנט וחשב את אורך הדופק הקשיח של הפרוטון ב-90 מעלות. התאם את רמות כוח הפרוטון בכל רצף דופק בהתאם לפעימה הקשה של הפרוטון.הקלט ספקטרום NMR פרוטון zgesgp הראשון כדי להקליט את התוכן לדוגמה בהומוגניות שדה. העתק את הניסויים zgesgp ו- p3919gp או את הניסויים SOFAST-HMQC למספר הרצוי ולתור אותם במנגנון הרכש. הזריקו פתרון מרוכז של המולקולה החיצונית לבקבוק המאגר הבינוני על ידי פירסינג של צינורות הסיליקון עם מזרק סטרילי וארוך מחט.בסוף הניסוי NMR, להחליף את הצינור המכיל את התאים עם צינור ריק לשטוף את יחידת הזרימה עם מים. עבור תאים המבטאים אנהידראז פחמתי ללא תווית, עבדו את ספקטרום ה-p3919gp על-ידי החלת פונקציית חלון אפס מילוי והרחבת קו מעריכית. עבור תאים המבטאים חנקן-15 המסומנים בתווית, סופראוקסיד דיסמוטאז, לעבד את ספקטרום SOFAST-HMQC על ידי החלת פונקציית חלון פעמון אפס מילוי וסימן בריבוע בשני הממדים.ב- MATLAB, יבא את האזורים הספקטרליים באמצעות קובץ ה- Script המותאם אישית Load_ascii_spectra. הפעל את סקריפט Load_acqus כדי לחלץ את חותמות הזמן מהספקטרום 1D. פתח את MCR-ALS 2.0 GUI על-ידי הפעלת קובץ ה- Script של mcr_main, ובכרטיסיה בחירת נתונים, טען את מטריצת הספקטרום.בדוק את הנתונים על-ידי התוויית הנתונים. הערך את מספר הרכיבים, על-ידי פירוק ערך יחיד או באופן ידני, ובחר שיטה להערכה הראשונית של הספקטרום הטהור. ניתן להשתמש בזיהוי המשתנים הטהור ביותר או בניתוח גורמים מתפתחים.בחלון בחירת ערכת הנתונים, בחר המשך. הגדר את האילוצים עבור הריכוזים בחלון אילוצים:מצב שורה. החל אילוץ אי שליליות, בחירת fnnls כיישום, ושניים כמספר המינים.לאחר מכן, החל אילוץ סגירה אחד, הגדר את האילוץ לאחד, את תנאי אילוץ הסגירה כשווה לו, והחל על כל המינים. הגדר את האילוצים עבור הספקטרום בחלון מצב אילוצים:עמודה. החל אילוץ אי שליליות, בחירת fnnls כיישום, ושניים כמספר המינים.בחלון האחרון, הגדר 50 איטראציות וקריטריון התכנסות של 0.01. ציין את שמות הפלט עבור ריכוזים, ספקטרום וסטיית תקן. לחץ על המשך כדי להפעיל את התאמת MCR-ALS.התאים בביוריאקטור יכולים להישמר בחיים עד 72 שעות, כפי שאושר על ידי בדיקה כחולה טריפאן. הביו-ריאקטור שימש לניטור בזמן אמת של כריכת שני מעכבים, אצטזולמיד ומתאזולמיד לאנהידריז פחמתי המובע יתר על המידה בציטוסול של תאי HEK 293 T. נוכחותם של אותות מהחלבון המוגזם וההומוגניות בשדה הוערכה עם ספקטרום הפרוטונים הראשון של פיסול עירור.במקרה של אנהידרז פחמתי, הכריכה התאית של שני המעכבים הייתה במעקב על ידי התבוננות באותות פרוטון באזור בין 11 ל -16 חלקים למיליון של ספקטרום WATERGATE, הנובעים מהיסטידינים תיאום האבץ ושאריות ארומטיות אחרות. איגוד מוצלח אושר על ידי הופעת אותות נוספים. MCR-ALS שימש להפרדת אותות NMR הנובעים מאנהידרז קרבוני חופשי וכבול, וכדי לספק את פרופילי הריכוז היחסיים של שני המינים.הביו-ריאקטור הוחל כדי לפקח על היווצרותו של קשר דיסולפיד תוך-מולקולרי הקשור לאבץ שמקודם על ידי אבסלן, חיקוי של גלוטתיון פרוקסידאז. ניתוח MCR-ALS על אזורים נבחרים בספקטרום הדו-ממדי הפריד בין האותות הנובעים משני המינים וסיפק את פרופיל הריכוז היחסי שלהם. חשוב להכניס ולהסיר את צינור NMR יחידת הזרימה לאט ובהתמדה כדי למנוע קפיצות לחץ שעלולות לגרום להיווצרות של בועות.הפיתוח של ביו-ריאקטורים של NMR סלל את הדרך לחקר תהליכים תלויי זמן ברזולוציה אטומית, כגון התוויית ויסות redux ואינטראקציות בין תרופות למטרה בתאים חיים.

monitoring-protein-ligand-interactions-human-cells-real-time

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית בתוך התא כדי לחקור אינטראקציות חלבון-ליגנד בין חלבונים לא מסומנים בעלי ביטוי יתר לבין מולקולות קטנות. האינטראקציה המוצלחת בין ליגנד לחלבון מאושרת חזותית על ידי הופעתה של קבוצה נוספת של פסגות באזור העניין הספקטרלי שמחליפה בהדרגה את הפסגות המקוריות.

ספקטרוסקופיית NMR כמותית של מימן בתוך התא לניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

פרוטוקול מפורט עבור הפעולה בו-זמניות של תרביות תאים מקבילים 48 בתנאים מגוונים במערכת microbioreactor מוצג. תהליך התרבות תאים, קציר וניתוח כייל נוגדנים הבאים מתוארים.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול על ההפקה ועל טיהור של חלבונים עם התווית עם איזוטופים יציבים, ואפיון עוקבות של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו- MicroScale ניסויים Thermophoresis (MST).

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

כאן, אנו מציגים הליך מפורט כדי להריץ עיצוב של ניסוי במיקרו-bioreactor חקן אוטומטי ואחריו הקציר התאים וכימות החלבון באמצעות חלבון A עמודה.

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

פרוטוקול זה משלב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בהתאמה אישית עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR היפרפולרית כדי למדוד מטבוליזם פירובט בזמן אמת בתאים חיים, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי עבור מחקרים מטבוליים ויישומי סינון תרופות.

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

חקור אינטראקציות חלבון-ליגנד בזמן אמת בתאים אנושיים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR בתוך התא עם ביוריאקטור ייעודי. השיטה מאפשרת ניטור אטומי של תהליכים ביולוגיים דינמיים ומאפשרת ניתוח כמותי באמצעות MCR-ALS.

ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה

גלה סרטונים נוספים