ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה

ספקטרוסקופיית NMR בתא מציעה גישה ייחודית לחקר מבנה ותפקוד החלבון ישירות בתאים חיים ולניטור תהליכים רלוונטיים ביולוגית כגון אינטראקציות חלבון-ליגנד. זה bioreactor NMR יכול לשמור על מספר גבוה של תאים אנושיים קיימא ופעיל מטבולית במשך מספר ימים בספקטרומטר, לאפשר יישומי NMR בזמן אמת בתוך התא. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל חלבון תאי מסיס, מתגלגל בחופשיות עובר שינויים קונפורמצונליים או כימיים.

תיוג איזוטופים מרחיב עוד יותר את תחולת השיטה. כדי להתחיל, להרכיב את יחידת הזרימה באמצעות צינור NMR יחידת זרימה שנייה, אשר יוחלף מאוחר יותר עם אחד המכיל תאים. עיין בהוראות ההפעלה של יחידת הזרימה להרכבה נכונה.

הגדר את אמבט המים המחובר לבקרת הטמפרטורה של יחידת הזרימה ל-37 מעלות צלזיוס והנח את בקבוק המאגר באמבט המים. חברו את צינורות ה-FEP של בקבוק המאגר למשאבה. סובבו את שסתום הביו-ריאקטור כדי לעקוף ולמלא מראש את המשאבה במדיום.

לאחר מכן, להפוך את שסתום bioreactor לזרום מראש למלא את הביו-ריאקטור עם המדיום ב 0.1 מיליליטר לדקה. קח בקבוק T75 של תאי HEK 293 T שהודבקו מהחממה של פחמן דו חמצני ולהסיר את המדיום בילה. הוסף שני מיליליטרים של טריפסין EDTA לתאים ודגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק את התאים.

להשבית את הטריפסין עם 20 מיליליטר של DMEM שלם ולהשהות ביסודיות את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה. לאחר מכן, להעביר אותם בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 800X G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.

מעבירים את גלולה התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם 1.5 מיליליטר. כדי להטמיע את התאים בחוטי אגרוז, להמיס aliquot אחד של agarose מוצק ב 85 מעלות צלזיוס בתנור בלוק, ולאחר מכן לשמור אותו בתמיסה ב 37 מעלות צלזיוס בתנור בלוק. עם פיפטת פסטר, מלאו את תחתית צינור NMR של יחידת הזרימה ב-60 עד 70 מיקרוליטרים של ג'ל 1.5% אגרוז והניחו אותו על קרח כדי ליצור תקע תחתון בגובה חמישה מילימטר.

לחמם את גלולה התא במשך 15 עד 20 שניות בתנור בלוק בזהירות להשעות את התאים ב 450 microliters של פתרון agarose, הימנעות היווצרות של בועות. שאפו את ההשעיה התאית/האגרוז לתוך צינורות PEEK כרומטוגרפיים באורך 30 ס"מ בקוטר פנימי של 0.75 מ"מ המחוברים למזרק של מיליליטר אחד. מניחים לצינורות להתקרר בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.

מלאו מראש את צינור NMR של יחידת הזרימה ב-100 מיקרוליטרים של PBS בטמפרטורת החדר. חוטים יצוקים של תאים המוטבעים באגרוז לתוך צינור NMR יחידת הזרימה על ידי דחיפה עדינה של המזרק. הסר את צינור NMR הריק מיחידת הזרימה ולהגדיל את קצב הזרימה לשני מיליליטר לדקה במשך כמה דקות כדי להסיר בועות גז שיורית בצינורות הכניסה.

הגדר את קצב הזרימה ל 0.2 מיליליטר לדקה והכנס את צינור NMR המכיל את התאים על ידי דחיפתו כלפי מעלה לאט אך בהתמדה. ספק את מדיום הביו-ריאקטור בקצב זרימה של 0.1 מיליליטר לדקה. הגדר את הטמפרטורה בספקטרומטר NMR ל 310 קלווין והכנס את יחידת הזרימה בספקטרומטר.

לאחר הביו-ריאקטור מוכנס לספקטרומטר NMR, המתן מספר דקות כדי לאפשר את ההחלפה הבינונית. התאם את ההתאמה והכוונון של ערוץ הפרוטון, כוון את המגנט וחשב את אורך הדופק הקשיח של הפרוטון ב-90 מעלות. התאם את רמות כוח הפרוטון בכל רצף דופק בהתאם לפעימה הקשה של הפרוטון.

הקלט ספקטרום NMR פרוטון zgesgp הראשון כדי להקליט את התוכן לדוגמה בהומוגניות שדה. העתק את הניסויים zgesgp ו- p3919gp או את הניסויים SOFAST-HMQC למספר הרצוי ולתור אותם במנגנון הרכש. הזריקו פתרון מרוכז של המולקולה החיצונית לבקבוק המאגר הבינוני על ידי פירסינג של צינורות הסיליקון עם מזרק סטרילי וארוך מחט.

בסוף הניסוי NMR, להחליף את הצינור המכיל את התאים עם צינור ריק לשטוף את יחידת הזרימה עם מים. עבור תאים המבטאים אנהידראז פחמתי ללא תווית, עבדו את ספקטרום ה-p3919gp על-ידי החלת פונקציית חלון אפס מילוי והרחבת קו מעריכית. עבור תאים המבטאים חנקן-15 המסומנים בתווית, סופראוקסיד דיסמוטאז, לעבד את ספקטרום SOFAST-HMQC על ידי החלת פונקציית חלון פעמון אפס מילוי וסימן בריבוע בשני הממדים.

ב- MATLAB, יבא את האזורים הספקטרליים באמצעות קובץ ה- Script המותאם אישית Load_ascii_spectra. הפעל את סקריפט Load_acqus כדי לחלץ את חותמות הזמן מהספקטרום 1D. פתח את MCR-ALS 2.0 GUI על-ידי הפעלת קובץ ה- Script של mcr_main, ובכרטיסיה בחירת נתונים, טען את מטריצת הספקטרום.

בדוק את הנתונים על-ידי התוויית הנתונים. הערך את מספר הרכיבים, על-ידי פירוק ערך יחיד או באופן ידני, ובחר שיטה להערכה הראשונית של הספקטרום הטהור. ניתן להשתמש בזיהוי המשתנים הטהור ביותר או בניתוח גורמים מתפתחים.

בחלון בחירת ערכת הנתונים, בחר המשך. הגדר את האילוצים עבור הריכוזים בחלון אילוצים:מצב שורה. החל אילוץ אי שליליות, בחירת fnnls כיישום, ושניים כמספר המינים.

לאחר מכן, החל אילוץ סגירה אחד, הגדר את האילוץ לאחד, את תנאי אילוץ הסגירה כשווה לו, והחל על כל המינים. הגדר את האילוצים עבור הספקטרום בחלון מצב אילוצים:עמודה. החל אילוץ אי שליליות, בחירת fnnls כיישום, ושניים כמספר המינים.

בחלון האחרון, הגדר 50 איטראציות וקריטריון התכנסות של 0.01. ציין את שמות הפלט עבור ריכוזים, ספקטרום וסטיית תקן. לחץ על המשך כדי להפעיל את התאמת MCR-ALS.

התאים בביוריאקטור יכולים להישמר בחיים עד 72 שעות, כפי שאושר על ידי בדיקה כחולה טריפאן. הביו-ריאקטור שימש לניטור בזמן אמת של כריכת שני מעכבים, אצטזולמיד ומתאזולמיד לאנהידריז פחמתי המובע יתר על המידה בציטוסול של תאי HEK 293 T. נוכחותם של אותות מהחלבון המוגזם וההומוגניות בשדה הוערכה עם ספקטרום הפרוטונים הראשון של פיסול עירור.

במקרה של אנהידרז פחמתי, הכריכה התאית של שני המעכבים הייתה במעקב על ידי התבוננות באותות פרוטון באזור בין 11 ל -16 חלקים למיליון של ספקטרום WATERGATE, הנובעים מהיסטידינים תיאום האבץ ושאריות ארומטיות אחרות. איגוד מוצלח אושר על ידי הופעת אותות נוספים. MCR-ALS שימש להפרדת אותות NMR הנובעים מאנהידרז קרבוני חופשי וכבול, וכדי לספק את פרופילי הריכוז היחסיים של שני המינים.

הביו-ריאקטור הוחל כדי לפקח על היווצרותו של קשר דיסולפיד תוך-מולקולרי הקשור לאבץ שמקודם על ידי אבסלן, חיקוי של גלוטתיון פרוקסידאז. ניתוח MCR-ALS על אזורים נבחרים בספקטרום הדו-ממדי הפריד בין האותות הנובעים משני המינים וסיפק את פרופיל הריכוז היחסי שלהם. חשוב להכניס ולהסיר את צינור NMR יחידת הזרימה לאט ובהתמדה כדי למנוע קפיצות לחץ שעלולות לגרום להיווצרות של בועות.

הפיתוח של ביו-ריאקטורים של NMR סלל את הדרך לחקר תהליכים תלויי זמן ברזולוציה אטומית, כגון התוויית ויסות redux ואינטראקציות בין תרופות למטרה בתאים חיים.