בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים
12 במרץ 2021
מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.
כדי לחקור את ההיבטים הביולוגיים של רקמת השומן החום, חיוני לנקות את גודל השומן החום המטוהר. נכון לעכשיו לא הגיע טיהור גודל השומן החום וההמונים זמינים. במחקר זה פיתחנו פרוטוקול פשוט לטיפול בבעיה זו.
כעת, נדרשת מיומנות אחת לפרוטוקול זה. הוא זקוק להרבה פחות חומרי לימוד מאשר שיטות אחרות, וגודל השומן החום המטוהר יכול לשמש ישירות לניתוח ביטוי גנים וחלבונים. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לחקר הביולוגיה של גודל השומן החום הקלאסי.
זה יכול להיות מיושם גם כדי לחקור תהליך השחמה אדיפוציטים לבנים. מי שתדגים את ההליך תהיה אמנדה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בהנחת הבקבוקון עם BAT ותמיסת עיכול על מערבל מגנטי ב-60 סיבובים לדקה באינקובטור של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
השתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לשבש את גושי הרקמה המצטברים של פרוסות BAT סביב מוט המערבל. לאחר העיכול, מניחים מסנן מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר ופיפטה סביב ארבעה מיליליטר של תרחיף תאים דרך המסננת. ואז לשטוף אותו עם ארבעה מיליליטר של 12% יודיקסנול פתרון.
פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים עם תמיסת יודיקסנול ואז להעביר את תערובת התאים לשתי מבחנות פוליסטירן שקופות של חמישה מיליליטר. מניחים את צינורות הפוליסטירן המכילים את תערובת התאים על קרח למשך שעה אחת, מה שגורם ל-BAs ליצור שכבה בחלק העליון. הוציאו 20 מיקרוליטרים של ה-BAs המבודדים לבדיקת מיקרוסקופ.
עבור בידוד RNA וחלבונים, פיפטה את שכבת BA לתוך שני צינורות microcenterfuge 1.7 מיליליטר. לאחר מכן הסר בזהירות את התמיסה היודית המוגזמת מבלי לשבש את שכבת ה- BA. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של TRIzol לתמיסת התא כדי לבודד בו זמנית RNA, DNA וחלבון ולערבב מספיק כדי ללכלך את התאים.
כדי להפריד בין הפאזות, הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם וצנטריפוגה לצינור ב 9, 981 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפאזה המימית לבידוד RNA. מעבירים 300 מיקרוליטרים של הפאזה האורגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר ומוסיפים 750 מיקרוליטרים של 100% אתנול.
לאחר מערבולת במשך 10 שניות, להוסיף 200 microliters של 1-Bromo-3-chloropropane מערבולת שוב במשך 10 שניות. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים לפני המערבולת למשך 10 שניות. תנו לתמיסה המעורבת לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר צנטריפוגה, להוסיף 9, 981 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלבים יופרדו כאשר שלב החלבון ימוקם בשכבה האמצעית. הסר את התמיסה המימית העליונה והוסף מיליליטר אחד של 100% אתנול לתוך התמיסה הנותרת.
לאחר צנטריפוגה ב 9, 981 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant ולשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של 100% אתנול. צנטריפוגה ב 9, 981 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש לייבש את הכדור באוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולמדוד את משקל הכדור הרטוב.
הוסף תמיסת SDS של 1% ביחס של 20 מיקרוליטר למיליגרם של גלולה. ממיסים את הכדור לחלוטין על ידי הכנסת הצינור לשייקר מחומם בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס ו-11 גרם למשך חמש עד 10 דקות. בפרוטוקול, PBS המכיל 3%BSA שימש להפרדת BAs מ- BAT.
התאים המבודדים היו בצורת פטל עם טיפות שומנים רב-לוקולריות בפנים והיו חיוביים ל-tdTom, מה שאישר שהם BAs. החלבון בודד מה-BAs עם פרוטוקול GTPC משופר ולאחר מכן נבדק באמצעות ג'ל SDS-PAGE. פס דומיננטי הקשור ל-BSA נצפה בדגימת BA, מה שמרמז על התערבותו במיצוי חלבונים.
כדי למנוע הפרעות BSA, נעשה שימוש בתמיסה של 6% יודיקסונאל לבידוד של BAs, שהייתה בעלת צורת פטל טיפוסית והכילה טיפות שומנים רב-לוקולריות. חלבונים שהופקו מ-BAs אלה הופרדו היטב בג'ל SDS-PAGE. תאים אלה נמצאו חיוביים ל-tdTomato ואילו תאים שהתאוששו מהכדור היו שליליים ל-tdTomato ללא טיפות שומנים ברורות, מה שמרמז על הפרדה יעילה של ה-BAs מהתאים שאינם שומנים.
בניתוח ביטוי גנים, רמות ה-mRNA של UCP1 ו-PDGFA היו גבוהות משמעותית ב-BAs המבודדים. אבל ה-mRNA של PDGFRA זוהה רק ב-BAT. חלבון UCP1 נמצא מועשר ב-BAs מבודדים.
EDGFR אלפא זוהה ב- BAT, אך לא ב- BAs מבודדים. תוצאות אלה מאשרות את יעילות השיטה לבידוד BAs ומוכיחות כי ה-BAs המבודדים מתאימים למחקרי ביטוי גנים וחלבונים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, השתמש במאגר עיכול טרי כדי לנתק רקמת שומן חום ולמנוע היווצרות גושים ברקמה במהלך תקופת העיכול.
שיטה חדשה זו מקלה על חקירת הביולוגיה של רקמת השומן החום ברמת ברז של תא בודד. על ידי יישום שיטה זו, ניתן לבצע מחקרי GN וביטוי חלבונים עם אדיפוציטים חומים טהורים המנתחים במדויק את תוכנית ביטוי הגנים של אדיפוציטים חומים, מבלי לדאוג לזיהום שמקורו בתאים שאינם שמנים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול חדש ויעיל לבידוד אדיפוקיטים חומים (BAs) מרקמת שומן חומה של עכבר (BAT), המאפשר ניתוחים מדויקים של ביטוי גנים וחלבונים. השיטה עושה שימוש בעיכול אנזימטי ובהפרדה מבוססת צפיפות באמצעות iodixanol, ובכך היא גוברת על מגבלותיהם של טכניקות צנטריפוגה מסורתיות וממזערת זיהום מתאיים שאינם אדיפוקיטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר רקמת שומן
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- רקמת שומן חומית (BAT) חיונית לתרמוגנזה ללא רעד ביונקים.
- אדיפוציטים חומים (BAs) מאופיינים בטיפות ליפידים מולטי-לוקולריות, בכמות רבה של מיטוכונדריה ובביטוי של חלבון הניתוק 1 (UCP1).
- קשה לבודד BAs בשל צפיפותם הנמוכה והנוכחות של תאי זיהום שאינם אדיפוציטים.
- שיטות קיימות לבידוד BAs אינן יעילות או מובילות לאוכלוסיות שאינן טהורות, מה שמגביל ניתוחים המשכיים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד BAs טהורים מ-BAT של עכבר.
- מתן אפשרות למחקרים מדויקים של ביטוי גנים וחלבונים ב-BAs מבודדים.
- אספקת פלטפורמה למחקר ביולוגיית BA ברמת תאי בודדים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עיכול אנזימטי של BAT בין-שכמתי באמצעות Collagenase ו-Dispase.
- סינון של הרקמה המעוכלת דרך מסננת של 70 µm.
- העשרה של BAs על בסיס צפיפות באמצעות תמיסת iodixanol בריכוז 6% ודגירה בקירור.
- אישור מיקרוסקופי של מורפולוגיית BAs וסימון פלואורסצנטי באמצעות tdTomato.
- בידוד סימולטני של RNA, DNA וחלבון מ-BAs באמצעות ריאגנט TRIzol והפרדה של פאזות.
- ניתוח ביטוי גנים (למשל, UCP1, PDGFA) וניתוח חלבונים באמצעות SDS-PAGE.
תוצאות עיקריות
- תמיסת iodixanol בריכוז 6% העשירה ביעילות BAs, והניבה תאים בעלי טיפות ליפידים רב-לולייתיות (multilocular) אופייניות וביטוי חיובי של tdTomato.
- BAs מבודדים הראו רמות mRNA גבוהות משמעותית של UCP1 ו-PDGFA בהשוואה ל-BAT שלם; PDGFRA זוהה רק ב-BAT.
- מיצוי חלבונים מ-BAs הצליח ללא הפרעה מצד BSA כאשר נעשה שימוש בהפרדה מבוססת iodixanol.
- BAs מבודדים היו מתאימים למחקרי ביטוי גנים וחלבונים המשכיים, עם זיהום מינימלי של תאים שאינם אדיפוציטים.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד יעיל וטהור של BAs מרקמת BAT של עכבר.
- BAs מבודדים מתאימים מאוד לניתוחים של ביטוי גנים וחלבונים.
- שיטה זו מקלה על ביצוע מחקרים מפורטים של הביולוגיה של אדיפוציטים חומים ותוכניות ביטוי גנים, ללא זיהום מסוגי תאים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד מדויק של אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חומה של עכברים מאפשר ניתוח בעל רמת ביטחון גבוהה של ביטוי גנים וחלבונים, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים במחקר של מחלות מטבוליות. פרוטוקול זה נותן מענה לצוואר בקבוק מרכזי בביולוגיה של האדיפוציטים על ידי מזעור זיהומים ומאפשר בחינה של סוג תא בודד, דבר שהוא קריטי לתיקוף מטרות ולהבנת מסלולים ביולוגיים. השיטה מגבירה את הביטחון החוזה בנקודות התפנית של שלב הגילוי והשלב הפרה-קלני, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח של תרופיה למטבוליזם ולהשמנה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של תוכניות ביטוי גנים ספציפיות לאדיפוציטים חומים לצורך תיקוף מטרות מנגנוניות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד אוכלוסיות תאים טהורות, ובכך מפחית אותות מבלבלים מתאים שאינם אדיפוציטים.
- מסייע בהבהרת מסלולים עבור מטרות תרמוגניות ומטבוליות הרלוונטיות להשמנת יתר ולהפרעות מטבוליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק דגימות מאומתות וטהורות של אדיפוקיטים חומים עבור בדיקות גנים וחלבונים המשך.
- משפר את השחזור והסטנדרטיזציה של הבדיקות על ידי מזעור ההטרוגניות של הדגימה.
- מאפשר קריאות כמותיות מהימנות לסריקת תרכובות ולמחקרים של גנומיקה פונקציונלית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי כך שהוא מאפשר ניתוח של הביולוגיה של אדיפוקיטים חומים ברמת תא בודד.
- תומך בגילוי ביומרקרים תרגומיים באמצעות מדידה מדויקת של ביטוי גנים וחלבונים ב-BAs מבודדים.
- מסייע בקידום יעדים למחלות מטבוליות עם התאמה לסיכונים, על ידי אספקת נתונים פרה-קליניים חסונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול בידוד זה מתאים לממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ומאפשר מעבר חלק מזיהוי המטרה לוולידציה תפקודית ולפיתוח ביומרקרים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובניתוח מסלולים על ידי אספקת דגימות של אדיפוציטים חומים שאינן מזוהמות.
- סריקה: מספק תאים מוכנים לבדיקה לצורך ניתוחים המשכיים כמותיים וניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מאפשר מדידות חסונות של ביטוי גנים וחלבונים למחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים על ידי הבטחת סגוליות לסוג התא.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים פלטפורמה סטנדרטית לשימוש חוזר בתוכניות מחקר מטבוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של אדיפוקיטים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (סקלאביליות) של תהליכי בידוד תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות של המשך או הפסקת הפעילות (go/no-go) ואת היעילות של השקעת ההון באמצעות אספקת נתונים באיכות גבוהה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של יעדים ותוכניות למחלות מטבוליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעיכור רקמות, בידוד תאים ובניתוח מולקולרי.
- נדרש גישה לריאגנטים לעיכור אנזימטי, לתמיסות מדרג צפיפות ולמכשור אנליטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנה וניתוח רב-דגימתי הניתנים לשחזור.
- ניתן להתאמה למודלים עכבריים שונים ופוטנציאלית לסוגים אחרים של רקמת שומן.
- טיפול זהיר נחוץ כדי למנוע זיהום ולשמור על שלמות התאים, כפי שמתואר בפרוטוקול.
