בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

כדי לחקור את ההיבטים הביולוגיים של רקמת השומן החום, חיוני לנקות את גודל השומן החום המטוהר. נכון לעכשיו לא הגיע טיהור גודל השומן החום וההמונים זמינים. במחקר זה פיתחנו פרוטוקול פשוט לטיפול בבעיה זו.

כעת, נדרשת מיומנות אחת לפרוטוקול זה. הוא זקוק להרבה פחות חומרי לימוד מאשר שיטות אחרות, וגודל השומן החום המטוהר יכול לשמש ישירות לניתוח ביטוי גנים וחלבונים. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לחקר הביולוגיה של גודל השומן החום הקלאסי.

זה יכול להיות מיושם גם כדי לחקור תהליך השחמה אדיפוציטים לבנים. מי שתדגים את ההליך תהיה אמנדה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בהנחת הבקבוקון עם BAT ותמיסת עיכול על מערבל מגנטי ב-60 סיבובים לדקה באינקובטור של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

השתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לשבש את גושי הרקמה המצטברים של פרוסות BAT סביב מוט המערבל. לאחר העיכול, מניחים מסנן מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר ופיפטה סביב ארבעה מיליליטר של תרחיף תאים דרך המסננת. ואז לשטוף אותו עם ארבעה מיליליטר של 12% יודיקסנול פתרון.

פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים עם תמיסת יודיקסנול ואז להעביר את תערובת התאים לשתי מבחנות פוליסטירן שקופות של חמישה מיליליטר. מניחים את צינורות הפוליסטירן המכילים את תערובת התאים על קרח למשך שעה אחת, מה שגורם ל-BAs ליצור שכבה בחלק העליון. הוציאו 20 מיקרוליטרים של ה-BAs המבודדים לבדיקת מיקרוסקופ.

עבור בידוד RNA וחלבונים, פיפטה את שכבת BA לתוך שני צינורות microcenterfuge 1.7 מיליליטר. לאחר מכן הסר בזהירות את התמיסה היודית המוגזמת מבלי לשבש את שכבת ה- BA. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של TRIzol לתמיסת התא כדי לבודד בו זמנית RNA, DNA וחלבון ולערבב מספיק כדי ללכלך את התאים.

כדי להפריד בין הפאזות, הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם וצנטריפוגה לצינור ב 9, 981 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפאזה המימית לבידוד RNA. מעבירים 300 מיקרוליטרים של הפאזה האורגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר ומוסיפים 750 מיקרוליטרים של 100% אתנול.

לאחר מערבולת במשך 10 שניות, להוסיף 200 microliters של 1-Bromo-3-chloropropane מערבולת שוב במשך 10 שניות. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים לפני המערבולת למשך 10 שניות. תנו לתמיסה המעורבת לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר צנטריפוגה, להוסיף 9, 981 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלבים יופרדו כאשר שלב החלבון ימוקם בשכבה האמצעית. הסר את התמיסה המימית העליונה והוסף מיליליטר אחד של 100% אתנול לתוך התמיסה הנותרת.

לאחר צנטריפוגה ב 9, 981 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant ולשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של 100% אתנול. צנטריפוגה ב 9, 981 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש לייבש את הכדור באוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולמדוד את משקל הכדור הרטוב.

הוסף תמיסת SDS של 1% ביחס של 20 מיקרוליטר למיליגרם של גלולה. ממיסים את הכדור לחלוטין על ידי הכנסת הצינור לשייקר מחומם בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס ו-11 גרם למשך חמש עד 10 דקות. בפרוטוקול, PBS המכיל 3%BSA שימש להפרדת BAs מ- BAT.

התאים המבודדים היו בצורת פטל עם טיפות שומנים רב-לוקולריות בפנים והיו חיוביים ל-tdTom, מה שאישר שהם BAs. החלבון בודד מה-BAs עם פרוטוקול GTPC משופר ולאחר מכן נבדק באמצעות ג'ל SDS-PAGE. פס דומיננטי הקשור ל-BSA נצפה בדגימת BA, מה שמרמז על התערבותו במיצוי חלבונים.

כדי למנוע הפרעות BSA, נעשה שימוש בתמיסה של 6% יודיקסונאל לבידוד של BAs, שהייתה בעלת צורת פטל טיפוסית והכילה טיפות שומנים רב-לוקולריות. חלבונים שהופקו מ-BAs אלה הופרדו היטב בג'ל SDS-PAGE. תאים אלה נמצאו חיוביים ל-tdTomato ואילו תאים שהתאוששו מהכדור היו שליליים ל-tdTomato ללא טיפות שומנים ברורות, מה שמרמז על הפרדה יעילה של ה-BAs מהתאים שאינם שומנים.

בניתוח ביטוי גנים, רמות ה-mRNA של UCP1 ו-PDGFA היו גבוהות משמעותית ב-BAs המבודדים. אבל ה-mRNA של PDGFRA זוהה רק ב-BAT. חלבון UCP1 נמצא מועשר ב-BAs מבודדים.

EDGFR אלפא זוהה ב- BAT, אך לא ב- BAs מבודדים. תוצאות אלה מאשרות את יעילות השיטה לבידוד BAs ומוכיחות כי ה-BAs המבודדים מתאימים למחקרי ביטוי גנים וחלבונים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, השתמש במאגר עיכול טרי כדי לנתק רקמת שומן חום ולמנוע היווצרות גושים ברקמה במהלך תקופת העיכול.

שיטה חדשה זו מקלה על חקירת הביולוגיה של רקמת השומן החום ברמת ברז של תא בודד. על ידי יישום שיטה זו, ניתן לבצע מחקרי GN וביטוי חלבונים עם אדיפוציטים חומים טהורים המנתחים במדויק את תוכנית ביטוי הגנים של אדיפוציטים חומים, מבלי לדאוג לזיהום שמקורו בתאים שאינם שמנים.