Name: הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: למד הכנת למלות זכוכית מדגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני ברזולוציה גבוהה של Plasmodium falciparum בתאי דם אדומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן במלואו או בחלקו על ידי Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY לכל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.
פרויקט זה שעבורו פותחה שיטה זו מומן על ידי מענק MR/P010288/1 של המועצה למחקר רפואי שהוענק להלן ר. סאיביל, רולנד א. פלק ומייקל ג' בלקמן. תרבויות של P. falciparum גודלו במכון פרנסיס קריק, בתמיכת חברי הקבוצה של מייקל ג'יי בלקמן. המחברים רוצים להודות לד"ר סר יינג (מישל) טאן על שסיפק את התמונות של סכיזונטים שטופלו בתרכובת 2 ו-E64 בכתמי דם דקים. רוב הלמלות יוצרו בתמיכת צוות eBIC ואנו אסירי תודה על הגישה ל- Scios dual-beam cryoFIB-SEM בהצעת מחקר NT21004. המחברים מודים גם על תמיכתה של תוכנית מלגות התעשייה של החברה המלכותית (INF\R2\202061) בהמשך הפיתוח של טכניקת כרסום FIB בתוך CUI. המחברים רוצים גם להודות להלן ר. סאיביל על דיונים מועילים ביחס למאמר שיטות זה ופיקוח על הפרויקט.

דם אנושי נלקח מתורמים אנונימיים באמצעות שירות הדם וההשתלות הלאומי בבריטניה ונעשה בו שימוש תוך שבועיים מקבלתו. אין צורך באישור אתי לשימוש בו.
1. הכנה והקפאה של פלסמודיום falciparum נגוע כדוריות דם אדומות נגועות
<ol><li>בודד סכיזונטים בוגרים על ידי צנטריפוגה (1,580 x גרם) מעל תווך שיפוע צפיפות איזוטונית של 70% (v/v) (להליכים סטנדרטיים כיצד לגדל בתרבית שלבי דם א-מיניים של 3D7 Plasmodium falciparum באריתרוציטים אנושיים ראה Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>תקן את יריעות הדם הדקות המיובשות באוויר על מגלשת זכוכית עם 100% מתנול כדי לבדוק את ההומוגניות המורפולוגית של הסכיזונטים לפני הצביעה בכתם 10% Giemsa במאגר פוספט 6.7 mM, pH 7.1. הערה: כדי להעשיר את ההכנה לסכיזונטים שנתקעו בנקודות יציאה ספציפיות, ניתן לסנכרן סכיזונטים עם מעכבי תרכובת 2 ו-E64 (ראו תוצאות מייצגות ואיור 1 להסבר על ההשפעה של מעכבים אלה). זהירות: פלסמודיום פלציפרום הוא פתוגן אנושי ויש לטפל בו רק במתקן הכלה מתאים בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות המקומיות.</li>
	<li>סכיזונט צנטריפוגות בעדינות (240 x גרם) כדי לגלול אותם ולהשהות מחדש בנפח פי 2 של גלולת התא של מדיית RPMI, וכתוצאה מכך מתלה המטוקריט 50%.</li>
	<li>במתקן הקפאה ידני, יש למרוח 2.5 μL של סכיזונטים על צד הפחמן של פריקת זוהר (השתמש בהגדרות יחידת פריקת זוהר של 60 שניות, 30 mA באוויר, תוך טיפול בצד הפחמן של הרשת בלבד) רשת נחושת של 200 רשת עם סרט פחמן 2/4 חור וכתם עבור ~20 שניות מגב הרשת באמצעות נייר סינון דרגה 1 עם קצה קרוע. צללו לתוך אתאן נוזלי מקורר בחנקן והעבירו את הרשתות לאחסון (ראו טבלת חומרים לציוד המשמש במחקר זה). הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, ולאחסן רשתות תחת חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן. זהירות: חנקן נוזלי הוא חומר חונק וגורם לכוויות קור; לטפל בזהירות בסביבה מתאימה עם ניטור חמצן. אזהרה: אתאן נוזלי גורם לכוויות חמורות והוא דליק; יש להשתמש במכסה אדים הרחק ממקורות ההצתה. הערה: סכיזונטים קפואים אינם בני קיימא עוד. זה נקבע על ידי דגירה של דם אנושי עם כמה רשתות זהב של סכיזונטים קפואים שהופשרו באוויר ולא צפו בצמיחת טפילים לאחר מספר ימים, בהשוואה לבקרות שלא הוקפאו. לפיכך, רשתות קפואות של סכיזונטים בטוחות לטיפול מחוץ למתקני הכלה באמצעות נהלי בטיחות וטיהור רגילים (כפפות, עיקור משטח/כלים עם >70% אתנול וסילוק רשתות באתנול >70%).</li>
	<li>רשתות מסך המשתמשות בשלב הקפאה עבור מיקרוסקופ אור, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לשיפוע הקרח על פני הרשת. באזורים הדקים יותר של קרח, בדוק את כיסוי התאים בריבועי רשת בודדים. הערה: הריבועים הטובים ביותר צריכים להיות בעובי תא אחד במרכז ריבוע הרשת (איור 2). זה מבטיח שניתן יהיה לטחון למלה במרכז הריבוע מבלי לפגוע בקרח העבה יותר בקצוות כנגד פסי הרשת. ניתן להשהות את הניסוי כאן, ולאחסן רשתות תחת חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן. אם תאים נושאים סמן פלואורסצנטי, רשתות יכולות גם להיות מוקרנות על ידי cryoCLEM כדי לאתר מיקומי X/Y בעלי עניין, אשר יכולים להיות מתואמים עם מיקומי רשת ב- cryoFIB-SEM לכרסם ישיר.</li>
</ol>2. כרסום FIB ברשת של תאים קפואים צוללים
<ol><li>סמנו את החלק הקדמי של חישוקי רשת אוטומטית ספציפיים ל-cryoFIB בעט טוש שחור בלתי מחיק כדי לציין את מרכז מקטע החיתוך ואת הצד הנגדי של השפה (איור 3). הגדר את תחנת החיתוך ואת רשתות החיתוך לטבעות המסומנות בצד הפחמן כלפי מטה.</li>
	<li>טען רשתות לתוך מעבורת cryoFIB-SEM (בדרך כלל 2 רשתות, תלוי במעבורת) בצד פחמן כלפי מעלה והחל ציפוי פלטינום מתיז באטמוספירה ארגון (5 x 10-2 mbar) (5 mA עבור 60 s - עובי משתנה) או ציפוי סיבובי פחמן / פלטינה e-beam (~ 4 ננומטר עובי) על פני השטח של התאים. הערה: שני סוגי הציפויים מסייעים לפיזור מטען במהלך הדמיית SEM. היתרון של ציפוי סיבובי e-beam הוא שניתן להגדיר את העובי המדויק של הציפוי.</li>
	<li>טען את המעבורת לתוך cryoFIB-SEM והערך את התפלגות התאים בכל רשת על ידי SEM ב 5 kV (13 pA או 25 pA). קבל סקירה כללית של הגדלה נמוכה (~ 100x) כדי להסתכל על מעברי קרח ברחבי הרשת. לאחר מכן, צלם תמונות בהגדלה גבוהה יותר (~ 5,000x) כדי להסתכל על ריבועי רשת בודדים ולזהות את אזורי הרשת עם תכונות תאיות גלויות וזיהום פני שטח נמוך לטחינה.</li>
	<li>יש למרוח שכבת אורגנופלטינום >2 מיקרומטר על פני השטח של כל רשת באמצעות מערכת הזרקת הגז (GIS). לשם כך, הכנס את מחט ה- GIS לתא שמעל הרשת וחמם את מקור האורגנופלטינום לטמפרטורה מוגדרת לזמן מוגדר (לדוגמה, ~ 27 ° C עבור 3-10 שניות) כדי לייצר זרימה של אדים. הערה: יש למטב את זווית היישום, הטמפרטורה והתזמון של ציפוי אורגנופלטינום באמצעות מחט GIS כדי למקסם ציפוי אחיד. זה יהיה תלוי ב- cryoFIB-SEM הספציפי המשמש (ראה תוצאות מייצגות להסבר נוסף).</li>
	<li>הטה את הדגימה כך שמישור הרשת יהיה ~10° מזווית ההיארעות של קרן היונים והזז את המרכז של ריבוע רשת מתאים שניתן לראות הן בתמונות SEM והן בתמונות FIB.</li>
	<li>סקור את הרשת באמצעות קרן היונים בזרם נמוך (נומינלית 1.5 pA, 30 kV) ועבור להגדלה גבוהה מספיק (~ 7,000x) כדי לדמיין את התאים במרכז ריבוע רשת. יש למקד את הדגימה בזרם הכרסום הראשון (300 pA) ולתקן אסטיגמציה. התאם את הבהירות ואת הניגודיות, ולאחר מכן סמן שתי תבניות מלבניות לטחינה, אחת מעל ואחת מתחת לאזור מוגן בעובי 3 מיקרומטר, שמרכזו הוא המיקום הרצוי של הלמלה הסופית. הערה: הרוחב הנבחר של התבניות יהיה תלוי בטופוגרפיה של שכבת התא שמסביב ובגודל התא. 7-20 מיקרומטר הוא רוחב מתאים לסכיזונטים, אך ללמלות רחבות יותר לוקח זמן רב יותר לטחון. הגובה הנבחר של הדפוסים לשלב הכרסום הראשון תלוי בעובי המדגם, החל בסביבות 6 מיקרומטר; ייתכן שיהיה צורך להתאים זאת במהלך הטחינה. הכרסום מתבצע בכיוון מהקצוות החיצוניים העליונים והתחתונים של התבניות לכיוון פני הלמלה. ניתן לעשות זאת במקביל, כאשר שני התבניות נטחנות במקביל או ברצף, תחילה מסירים חומר מעל הלמלה ולאחר מכן מתחתיה.</li>
	<li>התחל כרסום בזרם הראשון; נטר את ההתקדמות בזמן אמת בתצוגת קרן היונים ולסירוגין באמצעות SEM (5 kV, 13 או 25 pA). בדקו שקרן היונים פרצה את הדגימה מעל ומתחת לאזור המוגן. אם לא, הגדילו את גובה הדוגמאות המלבניות כדי להסיר חומר נוסף. עצור כאשר המשטח מעל ומתחת ללמלה חלק לחלוטין בתצוגת קרן היונים. הערה: קרן היונים פרצה את הדגימה מעל ומתחת לאזור המוגן כאשר החלק הפנימי של התבניות המלבניות אינו מכיל תכונות במישור המוקד. תכונות מסוימות, כגון סרגלי רשת, עשויות להיות גלויות מחוץ למיקוד ברקע.</li>
	<li>שינוי לזרם הכרסום הבא (100 pA); התמקד וכוונן את הבהירות/ניגודיות. הקטן את הרווח בין שתי התבניות המלבניות ל- 1.5 מיקרומטר והקטנת גובה הדוגמה כך שיכסה רק את החומר הלא טחון. התחילו לכרסם בזרם החדש עד שהמשטח שמעל ומתחת ללמלה יהיה חלק לחלוטין.</li>
	<li>חזור על תהליך זה בהדרגה עד שתגיע לעובי של 0.3 מיקרומטר, תוך הפחתת זרם קרן היונים בכל פעם בהתאם לסכימת הכרסום בטבלה 1.</li>
	<li>טחנו מספר למלות (הכמות תלויה בעובי הדגימה ובזמן הזמין) על רשת אחת או שתיהן לעובי של 0.3 מיקרומטר, רשמו את מיקום X/Y/Z של כל למלה ושמרו ~1-2 שעות בסוף ההפעלה כדי ללטש את הלמלה לעובי הסופי שלהן (60-200 ננומטר).</li>
	<li>בצעו סקירה כללית של SEM בהגדלה נמוכה של הרשת כולה ותכננו מסלול ליטוש החל מ-lamellae בקדמת הרשת (קרוב יותר למקור קרן היונים) ועד lamellae בחלק האחורי של הרשת (הכי רחוק ממקור קרן היונים) (איור 5). הערה: פעולה זו מפחיתה את השקיעה מחדש של חומר ablated בחזרה על פני השטח של lamellae מלוטש.</li>
	<li>צמצמו את המרווח בין שתי התבניות המלבניות ל-100-200 ננומטר והתחילו את שלב הליטוש הסופי בזרם קרן יונים של 30 pA. עקוב אחר ההתקדמות על ידי SEM ב- 2-3 kV (13 pA, להתעכב = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s עבור מסגרת מלאה) ולהפסיק ללטש כאשר הניגודיות אובדת בלמלה על ידי SEM או כאשר ציפוי האורגנופלטינום של הלמלה עצמה מתחיל לאבד שלמות.</li>
	<li>לפני הסרת הרשתות, השג תמונת SEM בהגדלה נמוכה של הרשת כולה ושמור תמונות של כל למלה. השתמש בהם כדי להצליב את הרשת מאוחר יותר ב- TEM. השהה את הניסוי כאן ואחסן את הרשתות עם lamellae תחת חנקן נוזלי - לטפל בזהירות. הערה: רשתות יכולות להיות מצופות קלות עם הוצאתן מה- cryoFIB-SEM, מה שיכול לעזור להגביל את הסחף והטעינה ב- TEM בהגדלה גבוהה, אך יש לעשות זאת בזהירות מכיוון שציפוי יתר של מרזב יכול לטשטש את התוכן הביולוגי בתוך הלמלה. ניתן לסנן lamellae עבור פלואורסצנטיות בשלב זה; עם זאת, קבלת אות מספיק יהיה תלוי בשפע של חלבון מסומן בתוך עובי של lamella. יש לנקוט בזהירות רבה בטיפול ברשתות כדי להגביל את הנזק ללמלה ולמנוע זיהום פני השטח.</li>
</ol>3. רכישת סדרת Tilt וסקירה כללית של עיבוד נתונים
<ol><li>טען את הרשתות לתוך ה- TEM, ויישר את כיוון הכרסום בניצב לציר ההטיה של הבמה. הערה: יישור הרשתות נעשה באמצעות העין באמצעות הסימנים על שפת הרשת האוטומטית. שולי טעות ~ 10° מקובלים, אחרת קירות התעלה משני צדי הלמלה עלולים לטשטש את הלמלה כאשר הרשת מוטה.</li>
	<li>רכוש מפה בהגדלה נמוכה (~ 150x) של הרשת כולה ואתר את lamellae; לאחר מכן, רכשו מפת הגדלה בינונית (~1,500x, תלוי בגודל הלמלה) של כל למלה ואתרו את תחומי העניין.</li>
	<li>הטה מראש את הרשת ב- ±10° כדי להפוך את מישור הלמלה (לא הרשת) לניצב לציר האופטי הערה: ניתן לקבוע את כיוון ההטיה מראש על ידי מיקום הקצה הקדמי של הלמלה (מחפש את שאריות ציפוי האורגנופלטינה) במפות ההגדלה הנמוכה והבינונית. עבור ה- TEM המשמש כאן, רשתות דורשות הטיה מראש של +10° אם הקצוות הקדמיים של ה- lamellae מצביעים כלפי מעלה במפות ודורשות הטיה מראש של -10° אם הם מצביעים כלפי מטה. כל רשת עשויה להיות שונה בשל האופן שבו הם נאספו והוכנסו לטוען האוטומטי.</li>
	<li>קבל סדרת הטיה סימטרית38 (לדוגמה, -54° עד +54° עם הפרש קבוע של 3-5°) בגודל פיקסל המאפשר הן את שדה הראייה והן את הרזולוציה הדרושים לאזור העניין. השתמש בטווח של ערכי ביטול מיקוד בין -2 ל- -5 מיקרומטר. אסוף סרטים עם 3-10 מסגרות בכל הפרש קבוע ולשם כך, התאם פרמטרים אלה בהתאם לגודל הפיקסלים כדי לצבור מינון כולל של ~ 150 e-/Å2 (עבור 300 kV TEM). הערה: יש להימנע מסדקים בלמלה מכיוון שאזורים אלה עלולים להיסחף. יש להימנע גם מזיהום פני השטח מכיוון שהוא עלול לטשטש את אזור העניין או את אזור המיקוד בהטיה גבוהה.</li>
	<li>תנועה לתקן את הסרטים באמצעות תוכנית כגון MotionCor239. החל מסנן שקלול מינון על התמונות המתוקנות (e-/image מצטבר)40 והערך את ביטול המיקוד של כל תמונה באמצעות תוכנית כגון CTFFIND441.</li>
	<li>השתמש ביישור ללא פידוקיאל (מעקב אחר טלאים) בתוכנית כגון etomo (IMOD)42 כדי לחשב את היישור ואת הקשר הזוויתי של התמונות בסדרות הטיה.</li>
	<li>הזן את מידע היישור והסיבוב, יחד עם ערכי ביטול המיקוד לתוכנית שיכולה להחיל תיקון CTF תלת מימדי, לדוגמה, NovaCTF43. חשב טומוגרפיה מתוקנת כדי לקבל טומוגרפיות פלט עם גורמי קישור רלוונטיים לניתוח במורד הזרם.</li>
	<li>נתח את השחזורים והתכונן לכל עיבוד במורד הזרם, לדוגמה, סינון, סגמנטציה או ממוצע תת-טומוגרפיה.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעוד שכריית קריו-FIB הופכת שגרתית יותר, הכנת דגימות אופטימליות לטחינה לא; לכן, רוב השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה מתרחשים לפני שהדגימה מגיעה ל- cryoFIB-SEM. אופטימיזציה של הדגימה על ידי סבבים מרובים של הכנת תאים, הקפאת צלילה וסינון על ידי מיקרוסקופ אור ואלקטרונים נדרשים כדי להפיק את הדגימה הטובה ביותר האפשרית לפני ניסיון הטחינה. לאחר המדגם הטוב ביותר האפשרי לא רק מגדיל את סיכויי ההצלחה, אלא גם מייעל את השימוש בציוד. מסיבה זו, רוב המתקנים הלאומיים דורשים ראיות לכך שבוצעה אופטימיזציה מספקת לפני מתן זמן למכונות שלהם. ברגע שנכנסים ל-cryoFIB-SEM, מקסום היעילות של ציפוי האורגנופלטינום הוא קריטי על מנת לייצר למלה דקה באופן אחיד. לבסוף, סבלנות וטיפול טוב בדגימות הוא מיומנות הכרחית מהמשתמש, שיידרש לשבת מספר ימים בייצור ולאחר מכן העברת רשתות המכילות למלה עדינה. זה עשוי להשתנות עם הצגת אסטרטגיות כרסום אוטומטיות47,48, אך עדיין, תהליך הכרסום כולו עדיין ידני ברובו ברוב המתקנים.
בעוד שהעבודה התמקדה אך ורק בסכיזונטים של P. falciparum , ניתן היה לשנות בקלות את השיטה המוצגת כאן כדי לייעל את הכנת הרשת והכרסום עבור סוגי תאים אחרים. גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון הם צפיפות התאים המיושמים ברשת, סוג הרשת (נחושת רעילה לתאים מסוימים), גודל וריווח החורים בסרט הפחמן, זמן הניקוי ושיטת הכתמים (חד צדדית/דו-צדדית, ידנית או אוטומטית). בנוסף, אם התאים גדלים על הרשתות (בדרך כלל רשתות זהב עם סרט פחמן חורי), ניתן לבדוק את המפגש על ידי מיקרוסקופ אור לפני הכתמה והקפאה. אסטרטגיית הכרסום תלויה באופן שבו התאים מופקדים ברשת. עבור תאי דם אדומים נגועים במלריה, הרשת מצופה למעשה על ידי שכבה בלתי שבורה של תאים, עבה יותר באזורים מסוימים ודלילה יותר באזורים אחרים. הכרסום מתבצע במספר נקודות באזור אחד לאורך שיפוע זה שבו עובי הקרח מייצר lamellae כי הם בגודל מתאים טומוגרפיה. גישה זו פועלת היטב עבור תאים קטנים יותר, שכן ניתן לייצר lamellae המכיל פרוסה דרך תאים מרובים. עבור תאים גדולים יותר או גושים של תאים, זה יכול להיות המקרה כי תא אחד או גוש התא עשוי לייצר lamella אחד.
טיפול ברשת והעברת דגימות נותרו אחד האתגרים העיקריים של זרימת עבודה זו. Lamellae יכול ללכת לאיבוד עקב שברים או סדקים, וילונות חפצים לטשטש את הביולוגיה, זיהום מוגזם פני השטח, כמו גם בעיות כיוון הרשת בתוך TEM, הדורשים שלב טיפול נוסף כדי למקם מחדש את הרשת. מידת ההפסדים משתנה מיום ליום ומרשת לרשת, אך היא משתפרת באמצעות תרגול וניסיון בטיפול לאורך זמן. במחקר זה, נמצא כי ניתן לכוון מחדש בזהירות את הרשתות בטוען האוטומטי מספר פעמים מבלי להרוס lamellae וזה לפעמים יש את היתרון של שטיפת קרח פני השטח. מגבלה עיקרית נוספת של זרימת עבודה זו היא הזמן שלוקח לייצר lamellae. מכיוון שהייצור איטי, קריטי לקבל מדגם אופטימלי כראוי, מה שהופך את הכרסום ליעיל ככל האפשר.
לאחרונה הוצגו מספר התאמות לטחינת FIB של דגימות ביולוגיות זגוגיות. משנה משחק הוא היישום של כלי הרמה מקוררים קריוגנית בתוך תא cryoFIB-SEM המאפשרים לטחון בלוקים גדולים יותר של חומר מדגימות קפואות בלחץ גבוה. ניתן לחבר את הבלוקים למוט מתכת או להרים אותם באחיזה ולהעביר אותם למצב דגימה שני, המכיל רשת EM ששונתה במיוחד. לאחר מכן ניתן לצפות את הבלוקים באורגנופלטינום ולטחון אותם ליצירת למלה. היכולת לטחון lamellae מחומר קפוא בלחץ גבוה פירושו שניתן לעבד תאים ורקמות גדולים בהרבה, במיוחד להתמקד באזורים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאם12. התאמות אחרונות אחרות לשיטת הכרסום FIB כוללות הפחתת תוצרי וילונות על ידי כרסום טריז מראש של הדגימה16, קיבוע קריופלואיד מיקרופלואידי49 ופוטו-מיקרו-תבניות של רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים לשיפור התפלגות התא50. כמו כן, הוכח כי כרסום רווחי מיקרו-התפשטות משני צדי הלמלה יכול להקל על הדחיסה על ידי הדגימה הסובבת אותה כשהיא מגיעה לדקיקות הסופית שלה51. זה עשוי להיות שימושי במיוחד בעת כרסום שכבות תאים רציפות, כמו הדגימה במחקר זה, שם נראה לפעמים כיפוף של lamellae במהלך שלב הליטוש הסופי.
העתיד של מיקרוסקופ אלקטרונים יהיה ככל הנראה קביעת מבנים מולקולריים באתרם על ידי ממוצע תת-טומוגרפיה וכרסום FIB הוא כלי חשוב שיקל על ייצור דגימות ביולוגיות זגוגיות עבור סוגים אלה של זרימות עבודה. בעוד שכרסום FIB עדיין בחיתוליו עבור יישומים ביולוגיים, פיתוח שיטות מתרחש בקצב מהיר הודות לעבודה הקשה של חוקרים, הן אקדמיים והן במתקנים לאומיים, בתוספת השקעה מסחרית בפיתוח טכנולוגיית cryoFIB-SEM לתמיכה במחקר.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

רק התוכן התאי של דגימות ביולוגיות בעובי <500 ננומטר ניתן להדמיה יעילה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) בטמפרטורות קריוגניות, הגבלת טווח הדגימות לנגיפים, פרוקריוטים, אורגניזמים חד-תאיים פשוטים ואזורים דקים יותר של תאים איקריוטים גדולים יותר1. כרסום קרן יונים ממוקדת ברשת (FIB) מאפשר דילול דגימות ביולוגיות עבות יותר של צליפה קפואה ללמלה שקופה אלקטרונית בטמפרטורות קריוגניות (< -150°C). הלמלות המתקבלות מועברות לאחר מכן ל-TEM לצורך הדמיה ואיסוף נתונים טומוגרפיים, מה שמאפשר שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה של התכונות התאיות והמולקולריות בתוך התאים (לסקירות ראו Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, and Wagner et al., 20204).
כרסום FIB צמח מתחום מדעי החומרים, שם מדללים דגימות באופן שגרתי כדי להכין אותן לניתוח במורד הזרם5. הוא מתבצע במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), בעל שתי עמודות אופטיות: אופטיקה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קונבנציונלי וטור שני המכיל אופטיקה המסוגלת לייצר ולשלוט בעדינות באלומת יונים ממוקדת (FIB) - הנקראת FIB-SEM. זה מאפשר לאזור מסוים של הדגימה להיות ablated על ידי יונים שנוצרו על ידי מקור גליום, הסרת חומר עודף ולהשאיר מאחור lamella6. תהליך הכרסום מונחה על ידי הדמיית SEM של הטופוגרפיה של הדגימה, המשמשת לאיתור אזורי עניין ולמעקב אחר התקדמות הכרסום. עבור יישומים ביולוגיים, ההגדרה הבסיסית זהה במידה רבה, אך הכרסום מתבצע בטמפרטורות קריוגניות. זה דרש התאמה של FIB-SEMs סטנדרטיים לשלבים מקוררים בהקפאה השומרים על טמפרטורות קבועות ושיעורי זיהום פני שטח נמוכים, כמו גם מנעולים אוויריים כדי להקל על העברת הדגימה ללא סטייה או זיהום. מעבורות לדוגמה שונו גם כדי לאפשר למגוון של ספקים שונים להיות מותקנים בתוך cryoFIB-SEM, כולל רשתות TEM, פלנצ'טים ונימים. מספר קבוצות מפתח של חוקרים היו מרכזיות בפיתוח שיטות אלה ובהתקדמות הטכנולוגית המתמשכת בתחום זה 7,8,9,10,11,12. פתרונות מסחריים זמינים כעת באופן נרחב יותר עבור כרסום FIB ביולוגי בטמפרטורה קריוגנית, וכרסום ברשת של lamellae הופך שגרתי יותר, בהתחשב במדגם אופטימלי.
ניתן להשתמש במגוון טכניקות של טמפרטורת החדר ו-cryoEM כדי להמחיש מידע תאי בכל קנה מידה של חיים, החל מאורגניזמים רב-תאיים שלמים ברזולוציה צנועה, דרך הבנת ההקשר של תהליכים מורכבים ברמה התאית וביתר פירוט, ועד לקביעה של in situ מבנים מולקולריים13,14,15,16,17,18,19. טכניקות קלאסיות של טמפרטורת החדר כוללות חתך קבוע ומוכתם, תאים ורקמות מוטבעים בשרף על ידי אולטרה-מיקרוטומיה לניתוח מורפולוגיה תאית על ידי TEM (לסקירה ראו Studer et al., 200820). פותחו טכניקות חלופיות המנצלות פיזור אלקטרונים משני על ידי SEM כדי לדמות את פני השטח של בלוקים של תאים משומרים, לפני הסרה הדרגתית של חומר באמצעות סכין (הדמיית פנים של בלוק טורי) או קרן יונים ממוקדת21,22,23. טכניקה זו יושמה בהצלחה גם בטמפרטורות קריוגניות (המכונה דימות נפח קריו) עם cryoFIB-SEM על בלוקים זגוגיים ולא מוכתמים של תאים או רקמות24. לחלופין, ניתן לטחון ולחקור למלה עבה יותר (~ 15 מיקרומטר) באמצעות הדמיית STEM25. באמצעות טכניקות אלה, ניתן לצלם בלוקים שלמים המכילים תאים רבים כדי לאסוף מידע על האוכלוסייה או שניתן לצלם איבר/אורגניזם שלם ולשחזר אותו בתלת-ממד. עם זאת, כדי לגשת למידע מולקולרי ברזולוציה גבוהה מהתאים, הדגימות צריכות להישמר במצב כמעט טבעי, קפוא-מיובש, ולכן יש להכין אותן בתנאים קריוגניים. מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים של חלקי זגוגית (CEMOVIS) היא טכניקה שבה בלוקים קפואים בלחץ גבוה של חומר ביולוגי נחתכים בתנאים קריוגניים עם אולטרה-מיקרוטום. זה מייצר סרטים של קטעי הקפאה (40-100 ננומטר עובי)26אשר מחוברים לרשת EM ומצולמים ב- TEM., עם זאת, האינטראקציה הפיזית של הסכין עם דגימת הזגוגית גורמת לחריצים ודחיסה שיכולים לעוות קשות את מבנה התא27,28,29,30. חלקים עבים יותר נוטים יותר לחפצים אלה, מה שהופך את השימוש בקטעים עבים יותר מ~70 ננומטר לבלתי מעשי26. מגבלה זו מגבילה מאוד את הראייה התלת-ממדית של המבנה הביולוגי בטומוגרפיה. כרסום FIB בטמפרטורות קריוגניות אינו חווה בעיות אלה, אך יש לו ממצאים משלו הנגרמים על ידי קצבי כרסום דיפרנציאליים על פני חלקים של הדגימה, מה שמוביל לעובי משתנה בתוך למלה - הנקרא וילון. בעיה זו מתמתנת על ידי יישום של ציפוי אורגנופלטינום המיושם באמצעות מערכת הזרקת גז (GIS), המגנה על הקצה הקדמי של הלמלה במהלך הכרסום31. הגבול העליון של עובי הדגימה עבור כרסום FIB ברשת מוגדר על ידי היכולת לצלול, להקפיא את הדגימה תוך שמירה על זגוגית;32אם כי, עם כניסתן של טכניקות הרמת קריו, ונשאי דגימות מותאמים לדגימות ביולוגיות, ניתן להשתמש בכרסום FIB גם לעיבוד דגימות קפואות בלחץ גבוה.,31,33,34,35. בנוסף, דגימות קפואות צוללות אינן יכולות להיות דקות מדי מכיוון שחייב להיות מספיק חומר ביולוגי כדי ליצור למלה בגודל סביר שיספק מספיק שטח פנים לאיסוף סדרות הטיה בהגדלה הנדרשת. ניתן להקל על בעיה זו על ידי כרסום גושים של תאים קטנים יותר, כגון חיידקים או שמרים. עובי הלמלה הסופי (~100-300 ננומטר) מוכתב בדרך כלל על ידי שלמות הדגימה ואסטרטגיית הכרסום. למלות דקות יותר טובות יותר לעבודה מבנית ברזולוציה גבוהה, כגון ממוצע תת-טומוגרפיה, אך למלות עבות יותר מכילות נפחים תאיים גדולים בהרבה ממה שניתן להשיג על ידי CEMOVIS, ומספקות הקשר תאי רב יותר בדגימה שהשתמרה כמעט באופן מקורי. כרסום FIB יכול לשמש גם לדילול גבישי חלבון קפואים עבור מחקרי עקיפה של אלקטרונים36.
כרסום FIB של תאי זגוגית שווה את הזמן והמאמץ לביצוע אם השאלה המדעית דורשת פירוט מולקולרי ברזולוציה גבוהה של דגימות כמעט מקומיות באתרן. עם גישה למתקנים נוספים לייצור שגרתי של lamellae, השלב המגביל את קצב הוא לעתים קרובות אופטימיזציה של הדגימה לפני הטחינה, שבו יש לקחת זמן כדי להבטיח את הדגימה היא זגוגית ועובי מתאים כדי לייצר lamellae חזק ודק באופן אחיד. מתוארת כאן אופטימיזציה של הדגימה עבור כדוריות דם אדומות אנושיות קפואות הנגועות בטפילי פלסמודיום פלציפארום , הגורם הסיבתי למלריה, אך גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל דגימה נתונה.

<table><tbody><tr><td>c-clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>תחנת גזירה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>ציטוט ישיר מתחנת Thermo</td></tr><tr><td>Clipping</td><td>sub-angstrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Compound 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>מסונתז על ידי ד"ר סיימון א. אוסבורן, LifeArc</td></tr><tr><td>Cryo-FIB חישוקי אוטוגריד ספציפיים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>1205101</tr><tr><td>E64</td><td>Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K100X יחידת פריקת זוהר</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 מדיה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633012</td><td>ניסוח המשמש לתרבות מיוצר בהתאמה אישית (REF 041-91762 A) וכולל תוספי אלבומקס, גלוטמין, HEPES והיפוקסנטין</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>VWR International</td><td>350864X</td><td></td></tr><tr><td>מגלשות זכוכית</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11562203</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות רשת</td><td>תת-אנגסטרום</td><td>PB</td><td>עבור רשתות חתוכות</td></tr><tr><td>קופסאות רשת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>עבור רשתות חתוכות - ציטוט ישיר מ-Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Grid boxes</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>אסדת הקפאת צלילה ידנית תוצרת בית</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>עם סיר אתאן מבודד (קצף בצפיפות גבוהה) ואמבט חנקן נוזלי (פוליסטירן) על ספסל במתקן בלימה.</td></tr><tr><td>דם אנושי</td><td>n/</td><td>a</td><td>שירות הדם וההשתלות הלאומי בבריטניה</td></tr><tr><td>JEOL 4700F Z JSM עם Leica VCT500 tagמערכת קירור</td><td>JEOL</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 עם VCT500 cryostage</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>ציפוי מקרטע</td></tr><tr><td>Leica EM ACE900</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>ציפוי סיבובי e-beam. בחדר עם בקרת לחות.</td></tr><tr><td>Linkam cryo-stage למיקרוסקופ אור</td><td>Linkam</td><td>דגם מס' קלטות CMS196</td><td>לרשתות חתוכות ולא חתוכות. בחדר עם בקרת לחות.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור Nikon Eclipse E200</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>עם שלב קריו של Linkam בחדר מבוקר לחות.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR International</td><td>17-0891-01</td><td>פתרון לכרית פרקול הוא 35 מ"ל 10x PBS, 150 מ"ל RPMI 1640 מדיה ו-315 מ"ל Percoll</td></tr><tr><td>Quantifoil נחושת 200 רשת 2/4 פחמן חור EM רשתות Finder</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCuH2-01</td><td>100 חבילה</td></tr><tr><td>Quantifoil נחושת 200 רשת 2/4 רשתות EM פחמן חור</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCu20-01</td><td>100 חבילה</td></tr><tr><td>Quorum PP3010 הכנה תא</td><td>מניין</td><td>n/a</td><td>ציפוי מקרטע</td></tr><tr><td>Scios קרן כפולה המצוידת בשלב העברה של Quorum PP3010.</td><td>FEI</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Staedtler Lumocolor עט טוש קבוע שחור משובח</td><td>Viking Direct</td><td>ND538522</td><td></td></tr><tr><td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>TEM מצויד במצלמת K2 או K3.</td></tr><tr><td>נייר סינון Whatmann כיתה 1</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scope A1 מיקרוסקופ אור</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>עם Linkam cryo-stage בחדר מבוקר לחות.</td></tr></tbody></table>

הכנת lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

מוצג כאן פרוטוקול להכנת cryo-lamellae מרשתות קפואות של אריתרוציטים אנושיים נגועים בפלציפרום, אשר יכול בקלות להיות מותאם עבור דגימות ביולוגיות אחרות. העקרונות הבסיסיים להכנת דגימות, כרסום וצפייה בלמלה משותפים לכל המכשירים וניתן לעקוב אחר הפרוטוקול כמדריך כללי להכנת קריו-למלה ברשת למיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryoEM) וטומוגרפיית קריו-אלקטרונים (cryoET). רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים התומכות בתאים צוללות-מוקפאות לתוך אתאן נוזלי מקורר חנקן באמצעות מקפיא צלילה ידני או אוטומטי, ולאחר מכן מוקרנות במיקרוסקופ אור המצויד בשלב הקפאה. רשתות קפואות מועברות למיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהקפאה המצויד באלומת יונים ממוקדת (cryoFIB-SEM). הרשתות מצופות באופן שגרתי לפני הכרסום, מה שמסייע לפיזור הצטברות המטען במהלך הכרסום. לחלופין, ניתן להשתמש בציפוי סיבובי של קרן אלקטרונית כדי להחיל שכבה של פחמן-פלטינה על הרשתות, שעובייה המדויק ניתן לשלוט בצורה מדויקת יותר. ברגע שנמצא בתוך ה- cryoFIB-SEM ציפוי נוסף של תרכובת אורגנופלטינום מוחל על פני השטח של הרשת באמצעות מערכת הזרקת גז (GIS). שכבה זו מגנה על הקצה הקדמי של הלמלה בזמן הטחינה, ששלמותה קריטית להשגת למלה דקה באופן אחיד. אזורי עניין מזוהים באמצעות SEM והכרסום מתבצע בצורה הדרגתית, הפחתת הזרם של קרן היונים כאשר הלמלה מגיעה לשקיפות אלקטרונים, על מנת למנוע יצירת חום מוגזם. רשת עם למליות מרובות מועברת לאחר מכן למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) בתנאים קריוגניים לרכישת סדרות הטיה. זרימת עבודה חזקה ונטולת זיהום להכנת lamella היא צעד חיוני עבור טכניקות במורד הזרם, כולל cryoEM תאי, cryoET, וממוצע sub-tomogram. פיתוח טכניקות אלה, במיוחד עבור הרמה וכרסום של דגימות קפואות בלחץ גבוה, הוא בעדיפות גבוהה בתחום.

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

פרוטוקול זה מתאר את הכנת הזגוגית lamellae של פלסמודיום-falciparum-נגוע תאי דם אדומים עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים. זה מאפשר התבוננות ישירה במידע מבני מפורט על האופן שבו הטפיל גורם למלריה. טומוגרפיה Cryo-electron רשומות מידע ברזולוציה גבוהה על החלק הפנימי של תאים.הוא חזק מספיק כדי לצפות בקומפלקסים של חלבונים בודדים באתרם, שניתן לחלץ אותם באופן חישובי וממוצע כדי לחשוף מידע מבני תלת-ממדי על חלבונים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות עבור סוגי תאים שונים והוא יכול להיות נקודת התחלה עבור מישהו חדש לייצר lamellae זגוגית עבור טומוגרפיה אלקטרונים קריו. זוהי אלחנדרה קרבחאל, שתבצע את הפרוטוקול היום.כדי להתחיל, מסך את רשתות הנחושת הקפואות באמצעות CryoStage עבור מיקרוסקופ אור עם תשומת לב מיוחדת לשיפוע הקרח על פני הרשת. בדוק אם יש כיסוי תאים בריבועי רשת בודדים באזורים הדקים יותר של קרח. השתמש בטוש שחור בלתי ניתן למחיקה כדי לסמן את הצד הקדמי והנגדי של חישוקי Autogrid ספציפיים ל- Cryo-FIB-SEM.טען את הרשת החתוכה למעבורת Cryo-FIB-SEM עם צד הפחמן כלפי מעלה, והחל ציפוי סיבובי של קרן אלקטרונית בעובי ארבעה ננומטר של פחמן או פלטינה על פני השטח של התאים. טען את המעבורת לתוך Cryo-FIB-SEM והערך את התפלגות התאים בכל רשת על ידי SEM בחמישה קילו-וולט. קבל סקירה כללית של הגדלה נמוכה בעוצמה של 100 כדי להסתכל על מעברי קרח ברחבי הרשת.לאחר מכן צלם תמונות בהגדלה גבוהה יותר בעוצמה של 5, 000 כדי להסתכל על ריבועי רשת בודדים. יש למרוח שכבת אורגנופלטינום בגודל שני מיקרומטר על פני השטח של כל רשת על ידי החדרת מחט מערכת הזרקת הגז לתא שמעל הרשת וחימום מקור האורגנופלטינום לטמפרטורה קבועה למשך זמן מוגדר כדי לייצר זרימה של אדים. כדי לצפות בדגימה, הטו את הדגימה כך שמישור הרשת יהיה במרחק של כ-10 מעלות מזווית ההיארעות של קרן היונים, והזיזו את המרכז של ריבוע רשת מתאים שניתן לראות הן בתמונות SEM והן בתמונות FIB.באמצעות קרן היונים בזרם נמוך, סקור את הרשת בהגדלה גבוהה כדי להציג באופן חזותי את התאים במרכז ריבוע רשת. סמן שתי תבניות מלבניות לטחינה, אחת מעל ואחת מתחת לאזור מוגן בעובי שלושה מיקרומטר. לאחר מכן בחר את הגדרות הקרן ותקן אסטיגמציה על ידי התאמת הבהירות והניגודיות.לאחר השלמת ההתקנה, התחל לכרסם בזרם של 300 פיקואמפר תוך ניטור ההתקדמות החיה בתצוגת קרן היונים ולסירוגין על ידי SEM. הדגימה נבדקת בתצוגת SEM, ולאחר הכרסום הראשון, אם קרן היונים לא פרצה את הדגימה מעל ומתחת לאזור המוגן, יש להסיר חומר נוסף על ידי הגדלת גובה התבניות המלבניות. יש להפסיק את הכרסום כאשר המשטח שמעל ומתחת ללמלה חלק לחלוטין בתצוגת קרן היונים.חזור על תהליך הכרסום בשלבים, תוך הפחתת זרם קרן היונים בכל פעם עד שמגיעים לעובי של 300 ננומטר. רשום את מיקום X Y Z של כל למלה. כדי ללטש את הלמלה בסוף הניסוי, השתמש בסקירת SEM בהגדלה נמוכה כדי לבחור קבוצת למלה לליטוש ולסמן את שורש הליטוש.לאחר סימון שורש הליטוש, צמצמו את המרווח בין שתי התבניות המלבניות ל-100 עד 200 ננומטר והתחילו את הליטוש בזרם קרן יונים של 30 פיקואמפר. עקוב אחר ההתקדמות באמצעות SEM בשניים עד שלושה קילו-וולט. הפסק ללטש כאשר הניגודיות בלמלה אובדת על ידי SEM או כאשר ציפוי האורגנופלטינום או הלמלה עצמה מתחילים לאבד שלמות.רכוש ושמור תמונות SEM בהגדלה נמוכה של כל למלה. לאחר השלמת הניסוי, הסר את המעבורת מהמיקרוסקופ. מוציאים את הרשתות עם lamellae ולאחסן אותם תחת חנקן נוזלי.טפל ברשתות בזהירות. כדי לחקור את המורפולוגיה, הסכיזונטים נעצרו בשלבים שונים של יציאה באמצעות תרכובת שתיים במעכבי E-64. בנוכחות תרכובת שתיים, הגבול בין הקרומים הטפיליטופורים לבין ההמוגלובין שמסביב בתא הדם האדום המארח הוגדר היטב.הוואקול הטפילי השלם, או PVs, היה ארוז במרוזואיטים באשכול יחיד של גבישי המוזואין. כאשר שני סכיזונטים מסונכרנים נשטפו לתוך E-64, קרום PV נקרע והמרוזואיטים התפשטו בתוך RBC. דוגמה טיפוסית לפיזור תאים טוב על רשת נחושת מראה תאי דם אדומים גדולים עם פריפריה מוגדרת היטב וקרום חלל שלם.בתוך תא דם אדום מארח שהתמוטט חלקית, המרוזואיטים הבודדים הוצגו כצבירי תאים קטנים. לכל סכיזונט היה כתם שחור במרכזו המציין את מיקומם של גבישי ההמוזואין. לאחר הכרסום, הרשתות הועמסו לתוך TEM כדי לזהות את המיקומים של lamellae ולמצוא אזורים מתאימים למטרה על ידי טומוגרפיה.במיקרוגרף הדגימה ניתן לראות RBC שאליו פלש לאחרונה מרוזואיט. את המרוזואיט המוקף בקרום שמקורו בתא המארח ניתן היה לראות בתוך גבולות ה-RBC. בקצה האפי של המרוזויט נראו בבירור שני הקרומים המקיפים את התא וארבעה קרומים שנערמו בקודקוד המרוזואיט הקשור לתכונה צפופה בצורת פטרייה צפופה אלקטרונים.בתוך הציטופלסמה של המרוזויט זוהה אירוע איחוי בין קרום הפלזמה המרוזואיטית לבין שלפוחית רב-שכבתית. בניתוח TEM נוסף של למלה בעובי 230 ננומטר, נצפתה המורפולוגיה האופיינית של מרוזואיט בוגר שטופל ב- E-64. בתוך קרום תאי הדם האדומים, ניתן לראות את קרום הפלזמה של המרוזואיטים עם אברונים כמו קומפלקס הממברנה הפנימית, טבעות קוטביות, מיקרונמים, ראופטריות ומעטפת הגרעין.החלק החשוב ביותר בטכניקה זו הוא אופטימיזציה של הרשתות כדי לאפשר ייצור יעיל ושניתן לשכפל של למלה דקה. פיתוח נוסף של טכניקה זו יאפשר לחוקרים לדמיין מולקולות חלבון יחיד בתוך טפילי מלריה ולקבוע את תפקידן ביציאת המלריה.

preparing-lamellae-from-vitreous-biological-samples-using-dual-beam

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

דוח זה מתאר פרוטוקול הכנת דגימה ותנאי הדמיה ספציפיים לביצוע טומוגרפיה אלקטרונית של שידור סריקה של דגימות ביולוגיות עבות.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

הביקוש הגובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים דורש שגרת רכישת תמונות בתפוקה גבוהה. מתואר כאן פרוטוקול המיישם את ההתפתחויות האחרונות של אסטרטגיות רכישה מתקדמות שמטרתן למקסם את יעילות הזמן והתפוקה של איסוף נתונים טומוגרפיים.

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

פרוטוקול זה מתקן את טומוגרפיית הקריו-אלקטרון (קריו-ET) לרקמות עבות על ידי שילוב הקפאה בלחץ גבוה (HPF) עם שיטת הוופל, הרמת קרן יוני מוקד קריוגנית (crio-FIB), ורכישה מקבילה סימטרית במינון, מה שמניב למלות דקות ודגימות מזגוגות לניתוח שכפול בשטח בהיפוקמפוס העכבר.

תהליך עבודה של טומוגרפיית קריו-אלקטרון לרקמות עבות שהודגם בהיפוקמפוס של עכבר

למד הכנת למלות זכוכית מדגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני ברזולוציה גבוהה של Plasmodium falciparum בתאי דם אדומים.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים