Name: הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למדו הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של Saccharomyces cerevisiae עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מבנים תוך-תאיים ברזולוציה גבוהה בביולוגיה מבנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה Instruct-Ultra (גרנט 731005), iNEXT-Discovery (מענק 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית, ותשתית המחקר CIISB, מרכז Instruct-ERIC (LM2018127). אנו מכירים בתמיכה שהתקבלה מתרמו פישר סיינטיפיק ברנו.

<ol><li>McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+optimal+performance+at+300keV+of+three+direct+electron+detectors+for+use+in+low+dose+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Dubochet, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+pure+water+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Vitrification of pure water for electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).</li>
<li>Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+windows+into+the+cell%3A+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li>
<li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li>
<li>Schur, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-resolution+in+situ+structural+biology+with+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).</li>
<li>O'Reilly, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+architecture+of+an+actively+transcribing-translating+expressome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome.</a> Science. 369, 554-557 (2020).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).</li>
<li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).</li>
<li>Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+artefacts+and+cutting+process+in+vitreous+sections+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).</li>
<li>Pierson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+%26%2334%3Bread%26%2334%3B+a+vitreous+section%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How to &#34;read&#34; a vitreous section.</a> Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).</li>
<li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-focused+Ion+Beam+Sample+Preparation+for+Imaging+Vitreous+Cells+by+Cryo-electron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography.</a> Bio-protocol. 5, (2015).</li>
<li>Wagner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+samples+from+whole+cells+using+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).</li>
<li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488(2020).</li>
<li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-eletron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography.</a> eLife. e52286, (2020).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li>
<li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).</li>
<li>Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amira%3A+A+highly+interactive+system+for+visual+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Visualization+Handbook%22%5BJournal%5D)">Amira: A highly interactive system for visual data analysis.</a> The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).</li>
<li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3A+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208, 107389(2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכנת הדגימות הסלולריות עבור cryo-ET היא זרימת עבודה מורכבת הדורשת ניצול של מספר מכשירים מתקדמים. איכות המדגם יכולה להיות בסכנה במהלך כל שלב הכנה המשפיע על התפוקה של הפרוטוקול כולו. בנוסף, הצורך של העברת המדגם בין מכשירים בודדים מהווה סיכון נוסף של זיהום מדגם או devitrification. לכן, אופטימיזציה של שלבים בודדים בזרימת העבודה של הכנת המדגם היא בעלת חשיבות גבוהה כדי להגדיל את התפוקה ואת השחזור של זרימת העבודה להכנת lamella. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההכנה הממוטבת של Saccharomyces cerevisiae לאפיון מבני של מתחמי מקרומולקולרים במקום על ידי cryo-ET.
הפרוטוקול מתאר את הכנת שני סוגים של דגימות שמרים הנבדלות בעיקר בריכוז התאים ברשת TEM. שתי דגימות שמרים הניבו lamellae באיכות גבוהה עבור cryo-ET ובחירה של סוג הדגימה ניתן לעשות בהתאם למטרות המחקר המסוים. השמרים יוצרים אשכולות מבודדים של תאים מעטים הפזורים באופן אקראי על פני הרשת במקרה הראשון, בעוד מונו-שכבתית רציפה של תאים קיים על משטח רשת TEM עבור סוג המדגם השני. הראשון מתאים להכנת lamella מהירה הודות לנפח הקטן של החומר שיש לטחון משם. lamella הסופי הוא קצר למדי, ולכן, מכיל רק 2-4 חתך סלולרי. האזורים המתאימים להכנת מדגם מופצים באופן אקראי על פני הרשת כולל ריבועי הרשת, אשר עשויים להגביל חלקית את האוטומציה של זרימת העבודה להכנת lamella. הסוג האחרון של הדגימה דורש ניצול של זרמים גדולים יותר במהלך שלב הטחינה הראשוני כדי לשמור על זמן הטחינה הכולל. בנוסף, סוג זה של מדגם נוטה יותר חפצים הנובעים כרסום לא אחיד (וילונות). לכן, GIS הוא מקרטעת על משטח המדגם לתקופה ארוכה ב -50% מאשר במקרה של המדגם עם אשכולות סלולריים קטנים כדי ליצור שכבת הגנה עבה יותר. לאחר מכן, המדגם הוא מקרטעת עם שכבה נוספת של אירידיום (לחלופין פלטינה או זהב) כדי לרפא את שכבת GIS, להפוך אותו נוקשה יותר, ולהגדיל את מוליכות פני השטח מדגם. FIBM של אזורים נוספים בכל צד של lamella (~ 2-5 מיקרומטר מקצה lamella) במהלך הצעד הראשון של כרסום lamella מחוספס נמצא מועיל כדי להפחית את מספר lamellae שבור ככל הנראה בשל מתח ירד בחתך האחרון23. המלה הסופי ארוך ומכיל ~ 10 חתך סלולרי, אשר מגדיל את מספר האזורים המתאימים cryo-ET. ניתן להחריף בקלות את ההחייאה הלא נכונה של המדיום או החיץ בין התאים על ידי הוספת מגן הקריו לפתרון החיץ (5% גליצל המשמש במחקר זה). מכיוון שרוב הריבועים מתאימים להכנת lamella, המדגם עם תאים המאורגנים לתוך monolayer רציף מתאים היטב להכנת lamella ללא פיקוח.
היבט חשוב נוסף בתהליך הכנת lamella הוא העברה למיקרוסקופ אלקטרונים השידור ומיצוב נכון של lamella לציר הטיית שלב המיקרוסקופ. באופן אופטימלי, הציר הראשי למלה מאונך לציר ההטיה של המיקרוסקופ המאפשר מעקב והתמקדות בגובה האזור המבומם ומונע מהקצוות המלה להגן על שדה הראייה בזוויות הטיה גבוהות. בעת איסוף נתוני cryo-ET באמצעות ערכת המינון-סימטרי,18 המדגם צריך להיות סובב בתחילה במיקרוסקופ כדי לפצות על הטיה של lamella ביחס למישור הרשת.

ההתפתחויות הטכנולוגיות והתוכנה האחרונות הפכו את אלקטרון קריו-מיקרוסקופיה (cryo-EM) של דגימות ביולוגיות מלוטשת לאחת הטכניקות המרכזיות במחקר ביולוגיה מבנית בעשור האחרון1,2. הכנת דגימה עבור cryo-EM בדרך כלל מורכב יישום של חלבון מטוהר או קומפלקס של חלבון עם חומצת גרעין על נושא המדגם (רשת TEM), ואחריו הסרת רוב הנוזל עם נייר מסנן, וצלילה הקפאה של הרשת עם שכבה דקה שיורית של מדגם לתוך אתאן נוזלי או פרופן3 . המדגם קבוע לפיכך בשכבה דקה (בדרך כלל <80 ננומטר) של חוצץ אמורפי במצב של לחות מלאה, בתנאים כמעט מקומיים, וללא צורך בשום קיבעון כימי או מתכת כבדה מנוגדת. הדמיה של הדגימה ההומוגנית מבחינה מבנית במיקרוסקופ אלקטרוני השידור גורמת לנתונים שניתן להשתמש בהם לקביעת המבנה התלת מימדי של המאקרו-קול ברזולוציה כמעט אטומית באמצעות פרוטוקול ניתוח חלקיקים יחיד2. מבנה במבחנה כזו מתאים לייצוג של המקרומולקול בתנאים ובטיפול המשמשים במהלך הכנת המדגם. למרות המבנים שנקבעו בתנאי במבחנה בדרך כלל תואמים את המצב התפקודי המלא של macromolecule, היכולת לדמיין יחסים מרחביים בין מקרומולקולקולים שונים בתוך התא יספק הקשר פונקציונלי נוסף לנתונים המבניים.
טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryo-ET) משמשת לשחזור כרכים תלת-ממדיים של עצמים pleomorphic או מתחמים מקרומולקולריים במקום4,5. היתרון של cryo-ET הוא שהמידע התלת מימדי מתקבל על ידי הדמיה של ישות אחת. עם זאת, הרזולוציה שבה נצפים מתחמים מקרומולקולריים בודדים או אברונים מוגבלת מאוד. לכן, ממוצע של macromolecules (תת טומוגרפיה ממוצעת, STA) עם אותו מבנה ממספר גדול יותר של טומוגרמה יש צורך להגיע 4-8 מודלים ברזולוציה Å מנתוני cryo-ET6,7. לאחרונה הוכח כי cryo-ET ו STA ניתן להחיל גם כדי לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של מכונות macromolecular כגון ריבוזומים בהקשר של הסביבה התאית7. עם זאת, ניצול מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור מוגבל על ידי עובי הדגימה. באופן כללי, זה לא בעיה עבור קריו-EM חלקיק יחיד שבו אופטימיזציה של תנאי vitrification יכול בסופו של דבר לגרום להטמעה של המדגם בשכבה דקה של קרח. מצד שני, רוב התאים אינם למעשה שקופים אלקטרונים עבור קרן האלקטרונים 300 keV. הנתיב החופשי הממוצע הבלתי-אלסטי בדגימות הביולוגיות המשובצות עבור 300 האלקטרונים של KEV הוא כ-395 ננומטר8, מה שאומר שמחקרי קריו-ET מוגבלים לפריפריה התאית עבור רוב התאים.
טכניקות שונות פותחו כדי לדלל את המדגם עד לעובי מספיק עבור cryo-ET. קריו-אולטרה-מיקרוטומיה משתמשת בצילום מכני של המדגם עם סכין יהלום בטמפרטורת החנקן הנוזלי (-196 °C)-C) כדי לספק קטעים בעובי 60-80 ננומטר המתאימים להקפאה-ET9,10,11. ניתן להכין מקטעים מרובים מתא בודד וניתוח הנתונים יכול בסופו של דבר להפיק מידע מבני תלת-ממדי עבור החלק הגדול יותר של התא. עם זאת, חיתוך מכני יכול לגרום למספר חפצים כגון קטעים מעוקלים, סדקים או דחיסת מדגם, אשר עשוי להשפיע על המבנה המתקבל ולהטיה את נתוני cryo-ET10,11,12. מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו (cryo-FIBM) מייצגות גישה חלופית שבה מקטע תאי דק מוכן על ידי אבלציה הדרגתית של הדגימה באמצעות קרן ממוקדת של יונים Ga + (FIB) בתהליך רב שלבי, אשר יכול לגרום 80-300 ננומטר חתך סלולרי בעובי (lamella)13,14,15 . בניגוד להקפאה-אולטרה-מיקרוטומיה, רק לאמלה אחת מוכנה מתא בודד, המייצג כ-0.3%-3% מהנפח שלו, ומיקרומכינינג של תאים מרובים נחוץ בדרך כלל כדי למצוא אזור מעניין בחתך הטחון. בנוסף, התפוקה של זרימת העבודה כולה היא עדיין נמוכה למדי, לעתים קרובות מוגבלת 6-8 lamellae באיכות גבוהה מהפעלה של 8 שעות cryo-FIBM. מצד שני, חתך ה-cryo-FIBM נטול כל ממצאי דחיסה ומספקים קלט מתאים להקפאה-ET ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, העברת lamella למנשא מדגם עבור cryo-ET אינו הכרחי כמו המדגם נשמר על רשת TEM במהלך כל תהליך הכנת lamella ואת אותה רשת ניתן להעביר לאחר מכן TEM. אנו מצפים כי התפוקה של cryo-FIBM ישתפר באופן משמעותי בקרוב, בעיקר מתוך זמינות של תוכנה עבור כרסום lamella ללאפיקוח 16,17 וניצול של FIBs הפועלים על העיקרון של תשלום-זוג פלזמה, אשר יאפשר אבלציה חומר מהר יותר.
Saccharomyces cerevisiae (שמרים) הם תאים אאוקריוטים בעלי צורה כדורית וקוטר של ~ 2-5 מיקרומטר. הודות לגודלו, נגישותו, גנטיקה, זמן הדור והמניפולציה הפשוטה, השמרים נחקרים בהרחבה כאורגניזם מודל אאוקריוטי במחקר ביולוגיה תאית ומולקולרית בדומה לאשריצ'יה קולי, הנחקר היטב כאורגניזם מודל פרוקריוטי בבקטריולוגיה. שמרים ניתן לתאם בקלות השעיה כמות גבוהה של תאים נוצר בתוך זמן קצר (הכפלת זמן 1 – 2 שעות). חשוב מכך, שמרים חולקים מבנה תאי פנימי מורכב עם תאים בעלי חיים וצמחים תוך שמירה על גנום קטן המורכב מתוכן נמוך של דנ"א שאינו קידוד. אפיון מבני של פרוטאום השמרים מהרזולוציה הגבוהה בנתוני ה- situ יכול אפוא לסייע לספק תיאור מכני לכמות הנרחבת של נתונים פונקציונליים הזמינים בספרות.
להלן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף לרכישת נתוני in situ cryo-ET על דגימת השמרים, המכסה את כל השלבים מהטיפוח לדוגמה ועד להכנת cryo-FIBM lamella, והעברת הדגימה ל- TEM לרכישת נתוני cryo-ET.

<table><tbody><tr><td>אגר</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>אתאן</td><td>מסר</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td></td><td>זן 201388 BY4741</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חד פעמי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניירות ספיגה</td><td>טד פלה</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C-clip</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>טבעת</td> <td>קליפ CThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>מקלות פיזור</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>לולאות חיסון סטריליות</td><td>BRAND</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי פלסטיק סטריליות</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>רשתות TEM</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חיטוי</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td>מאזנים</td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Cryo-FIB/SEM מיקרוסקופ</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-TEM</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>קופסת זרימה למינרית</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV/VIS</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>רובוט ויטריפיקציה</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-fib של סרביסיה saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

כיום, טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryo-ET) היא הטכניקה היחידה שיכולה לספק נתונים מבניים ברזולוציה כמעט אטומית על מתחמי מאקרומולקולריים במקום. בשל האינטראקציה החזקה של אלקטרון עם החומר, מחקרי cryo-ET ברזולוציה גבוהה מוגבלים לדגימות בעובי של פחות מ -200 ננומטר, מה שמגביל את תחולת ה- cryo-ET רק לאזורים ההיקפיים של תא. תהליך עבודה מורכב הכולל הכנת חתך תאי דק על ידי מיקרוכינינג קרן יונים ממוקד קריו (cryo-FIBM) הוצג במהלך העשור האחרון כדי לאפשר רכישה של נתוני cryo-ET מהפנים של תאים גדולים יותר. אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamellae הסלולר מדגם vitrified על ידי הקפאת צלילה ניצול Saccharomyces cerevisiae כדוגמה טיפוסית של תא אאוקריוטי עם ניצול רחב במחקר ביולוגיה תאית ומולקולרית. אנו מתארים פרוטוקולים לvitrification של S. cerevisiae לתוך טלאים מבודדים של כמה תאים או monolayer רציף של התאים על רשת TEM ולספק פרוטוקול להכנת lamella על ידי cryo-FIB עבור שתי דגימות אלה.

תרבות הסרביזיה של סכרומיצס נקצרה באמצע שלב הצמיחה המעריכי. הכנו שני סוגים של דגימות שבהם התאים חולקו כאשכולות קטנים של מספר תאים על פני השטח של רשת TEM (איור 1A,C)או יצרנו מונו-שכבתית רציפה מעל ריבועי רשת בודדים של רשת TEM (איור 1B,D). הגורם המפלה להכנת המדגם עם איוני תאים נפרדים או המונו-שכבתית התאית הוא ריכוז תרבית התא המוחלת על רשת TEM. תרבית התא שנקטפו התרכזה ב- OD600 = 1.0 עבור המקרה הקודם, או ל- OD600 = 30 עד 60 במקרה האחרון, בהתאמה. המדגם להכנת monolayer הסלולר היה נוסף עם 5% v / v גליצריל לפני vitrification. הגליצרל הוא קריטי עבור vitrification של פתרון המאגר, אשר ממלא את הרווח בין התאים (איור 2) כמו השתקפויות מן המאגר הגבישי יכול להיות מזיק למעקב מיקום הנכון ומיקוד במהלך איסוף נתונים cryo-ET.
בנוסף, תרבות השעיית השמרים נמחקה כנגד החומר שאינו סופג כגון משטח הכתם של PTFE או הפנקס המודפס בתלת-ממד המותאם אישית העשוי מחומר FlexFill 98A. נייר הכתמים הוצב רק בחלק האחורי של הרשת ביחס ליישום לדוגמה (כתם אחורי). אסטרטגיית הכתם האחורית מומלצת להקפאת תרבות ההשעיה, שכן חבטה בנייר המסנן משני הצדדים גורמת להידבקות התאים בנייר הכתמים (איור 1E).
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש ברשתות TEM החתכות במחסנית הרשת, היוצרת תמיכה יציבה ברשת ומאפשרת טיפול לדוגמה של המדגם לאחר ה- vitrification. פעולה זו אוכפת הכרח כי מחזיקי מדגם אחרים ומעבורות במיקרוסקופ FIB / SEM ו- TEM יכולים לקבל מחסנית רשת כזו.
עם העברת המדגם למיקרוסקופ FIB/SEM, הדגימה הייתה מצופה לראשונה בשכבה של 0.3-1.0 מיקרומטר של מתילציקלופנטיניל פלטינה באמצעות מערכת הזרקת גז המיקרוסקופ (GIS). שכבה נוספת של האירידיום האנאורגני התנדנדה על משטח המדגם כדי להקשיח את שכבת GIS ולהפוך את פני השטח מוליכים. הלמלה נטחנו במספר שלבים (איור 3) שם (I) זרם הטחינה, (II) רוחב המלה, ו- (III) המרחק של אזור הטחינה מעל ומתחת לדגימות הופחת באופן צעד. שלב הטחינה האחרון ("ליטוש") בוצע בזרם נמוך (10-30 pA) רק מהצד העליון של lamella ועם המדגם נוטה על ידי 1° נוסף לכיוון קרן Ga + . ניצול הפרוטוקול המתואר הביא בממוצע 8-10 lamellae מוכן על שתי רשתות TEM בתוך הפעלה אחת 6-8 שעות.
רשתות TEM עם lamellae הועברו לאחר מכן לתוך מיקרוסקופ אלקטרוני שידור. המלה הוקרנו לראשונה ורק אלה שהראו וילונות מינימליים (חפצים הנובעים מטחינה לא אחידה על פני השטח של lamella), רמת זיהום פני שטח נמוכה וניגודיות תאית טובה (שבדרך כלל נצפתה עבור lamellae עם עובי של &lt;200 ננומטר) נבחרו לרכישת נתוני cryo-ET. בנוסף, lamellae המכיל סדקים לאורך כל הדרך נמחקו מאיסוף נתונים. באופן כללי, כ-50% מה-lamellae שהועברו ל-TEM היו מתאימים לרכישת נתונים. סדרת הטיה נאספו בגלאי האלקטרונים הישירים K2 לאחר GIF עם חריץ בחירת אנרגיה מוגדר ל-20 eV. איסוף הנתונים בוצע בתוכנת SerialEM18 וסדרת ההטיה נאספו באמצעות ערכה סימטרית מינון19 עם טווח הטיה של ±60° וההפרש של 3°. הנתונים נרכשו בהגדלה המתאימה לגודל הפיקסלים של 3.47 A/px. המינון הכולל של 65 e /Å2 הופץ באופן אחיד על פני תת מסגרות בודדות. תמונות ההטיה נאספו כסט של שלוש פריימים, אשר תוקנו לאחר מכן לנזק התנועה והקרינה במהלך רכישת נתונים באמצעות תוכנית MotionCor220. פרמטרים של פונקציית העברת הניגודיות הוערכו באמצעות Ctffind421. סדרת הטיה עובדה eTomo18. שגרת המעקב אחר התיקונים שימשה ליישר את התמונות. טומוגרמה שוחזרה באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורי משוקלל לאחר 2x binning של התמונות, ולאחר מכן מסונן באמצעות מסנן דמוי SIRT (מוגדר 8 איטרציות) ב- IMOD18. פילוח טומוגרמה בוצע באופן ידני בתוכנת אמירה22. טומוגרמה משוחזרת מספקת ייצוג ברזולוציה גבוהה של פנים תאי השמרים ומאפשרת לנו להתבונן אברונים כגון vacuoles או מיטוכונדריה ברמה גבוהה של פירוט או ללמוד מתחמים מקרומולקולריים כגון microtubules, או מתחמי נקבוביות גרעיניות במקום ובתנאים כמעט מקומיים(איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg"> איור 1: תמונות FIB ו- SEM של סרביסיה מנומרת תמונות FIB (A) ו- SEM (C) של אשכולות השמרים הקטנים המתומחים ברשת TEM. תמונות FIB (B) ו- SEM (D) של השמרים היוצרות מונו-שכבתית רציפה על משטח הרשת. המדגם היה מצופה בשכבת GIS ו- Irridium לפני ההדמיה. סרגלי קנה המידה בחלוניות A-B תואמים ל- 10 מיקרומטר. דגימת השמרים נמחקת כנגד חומר שאינו סופג כגון PTFE או FlexFill 98A (ירוק) ועם נייר סופג ממוקם מהחלק האחורי של הרשת (לבן, E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg"> איור 2: ס. סרביסיה למלה תמונת TEM של micromachined lamella מהדגימה עם שמרי monolayer מתמשכים על פני הרשת. ההשתקפויות שנצפו בין התאים הכילו בינוני/חיץ לא מנוטרל כראוי (A, מודגש עם עיגולים אדומים). תמונת TEM של lamella שנוצר על השמרים vitrified לתוך monolayer רציף עם תוספת של 5% גליצריל לתוך בינוני / חוצץ (B). סרגל קנה המידה מתאים ל- 2 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg"> איור 3: זרימת עבודה של קריו-FIBM תיאור סכמטי של תהליך כרסום lamella. שלבי הטחינה הגסים הראשוניים מבוצעים בזרמי FIB גבוהים משני צידי תנוחת lamella מהוססת (מודגש בירוק) ואילו שלב הליטוש הסופי מתבצע רק מהצד העליון ובזרם FIB נמוך (מודגש בכתום, ראה וידאו נלווה בשעה 6:33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg"> איור 4: אברוני שמרים ומתחמים מקרומולקולריים המתוארים על ידי cryo-ET פרוסות טומוגמות משוחזרות המתארות vacuole (A, סרגל קנה מידה: 200 ננומטר), ריבוזומים (B, סרגל קנה מידה: 200 ננומטר), ליבה פרדריסטלינית של פרוקסיום(C,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר), microtubule (חץ לבן) בסמיכות של מבנה סיבי לא מזוהה (חץ שחור, D,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר), פרטים של microtubules מרובים (E,סרגל קנה מידה: 50 ננומטר), קרום גרעיני עם נקבוביות המצוינות על ידי חצים (F, סרגל קנה מידה 200nm), מיטוכונדריון(G,H,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר, החצים מצביעים על קריסטה בודדת), חבילה של מבנים חוטיים לא מזוהים(I,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר). לוחות B, C, D, E, G מכילים קטע של טומוגרמה שהוכנה מאשכולות קטנים של תאים ואילו מקטעי טומוגרמה שנאספו על lamellae מ monolayer של התאים מוצגים לוחות A, F, H, I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

וידאו זה יתמקד בהכנת סלמונלה שמרים לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית נעבור על זרימת עבודה מטיפוח תאים לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית Saccharomyces cerevisiae מעובדים להכנת דגימת יונים בהשעיה מומלץ לעבוד בתנאים סטריליים בתוך תיבת זרימת למינאר עשרה מיליליטר של שמרים סטריליים המופקים לבינוני לגידול תאים מתווספים לחיטוי בקבוקון טיפוח אחד מיליליטר של סטרילי עשרים אחוז גלוקוז מתווסף בקבוקון עם גידול בינוני מושבת שמרים אחת נקטפת בקפידה מצלחת הטיפוח שלנו ומועברת למדיום הצמיחה המוכן בטיפוח בקבוקון גידול מכוסה לאחר מכן בנייר כסף ומעורבב היטב לפיזור תרבית התאים ממוקמת באינקובטור ומטופחת בשלושים מעלות עם תסיסה מתמדת עד שהשלב המעריכי מגיע לתרבות תאי השמרים גדלה לשלב מעריכי וצפיפות הפיזיות של התא נמדדת על ידי החזקת מד נגד מדיום נקי כתרבית תאים לדוגמה ייחוס מרוכזת OD1 או OD30 בנוסף לחמישה אחוזים של גלצל לפני מקפיא בלאנש רשתות אלקטרו-מיקרוסקופיות פני השטח מנוקה ומופעל ליישום של השעיית תאים על ידי רשתות פלזמה ממוקמים בתא זוהר משחרר מול צד פחמן כלפי מעלה והליך ניקוי פלזמה מוגדר שלושים עד ארבעים וחמש שניות רשתות EM יש עכשיו והם מוכנים לתא יישום מדגם Vitrification של השעיית תא שמרים על רשתות EM נעשה על ידי קיפאון בלאנש לתוך האתאן הנוזלי באמצעות מכונת Vitrobot הכנת אתאן נוזלי מתרחשת על ידי נוזלי גז אתאן בכוס מתכת מקורר עם רשת EM חנקן נוזלי עם השעיית תא נמחק על ידי נייר מסנן מהצד האחורי ועל ידי פלסטיק לא דבק כפוף מהצד הפחמן הקדמי הטמפרטורה בתוך תא Vitrobot מוגדר 18 מעלות ולחות עד מאה אחוז זמן המתנה, זמן כתם וכוח כתם מוגדרים על מסך Vitrobot כמו גם רשת הפרשות הזוהרת נבחרה על ידי פינצטה Vitrobot ומורכבת למכשיר שלוש נקודה חמש מיקרוליטרים של השעיית Cerevisiae Saccharomyces מוחלת על צד הפחמן של הרשת בתוך תא האקלים Vitrobot מתלה צריך להיות מעורבב כראוי לפני כל יישום של הרשת הוא blanche קפוא לתוך רשתות אלקטרו-מיקרוסקופיה אתאן נוזלי עם תאים מנוטרלים מאוחסנים בתנאי חנקן נוזלי או מותקנים לתוך מחסנית הרשת לטעינה לתוך רשת מיקרוסקופ SEM קריו עם תאים מנוטרלים מאובטחת לאחר מכן לתוך מחסנית הרשת המתאימה לטעינה הן SEM והן TEM מיקרוסקופים C-clip טבעת רכובה על כלי גזירת העיתון מקורר ברשת חנקן נוזלי ממוקם על מחסנית רשת פחמן פונה כלפי מטה עם דגימת טבעת C-קליפ ממוקמת בתיבת הרשת המיוחדת דגימה להכנת למילה נטענת למיקרוסקופ FIB/ SEM של קרן כפולה ומתאימה לסיר טעינת תא ההכנה של שלב הקריו מקורר כראוי ומלא במחזיק דגימת חנקן נוזלי הנקראת מעבורת ממוקמת ומתקררת גם תיבת רשת עם דגימה מועברת מהערת האחסון לסיר והרשתות ממוקמות לשני חריצים שאטל צד פחמן עם תאים מול למעלה במקרה של שימוש מחסניות רשת FIB לחתוך את מחסנית הרשת צריך להיות מיושר בזהירות ל12: 00 ברשתות המעבורת הידוק על ידי הבורג ואת המעבורת הוא התהפך עד עמדת טעינה סיר ממוקם בתחנת העברה מכוסה מכסה תא העברה עם סיר טעינה ממוקם על החלק העליון של המכסה נשאב דרך שאטל ואקום נמוך עם רשתות מהודק על המוט וסגור בתוך תאי תא ההעברה הקטנים הנאספים לתא ההכנה נשאבים והמעבורת מוכנסת על בימת הקריו בשלב תא SEM ואקום גבוה מוטה לארבעים וחמישה מעלות ומוזז ארבעה מילימטרים על המיקום המרכזי של הרשת החדרת המחט של מערכת הזרקת גז יוצרת שכבת הגנה של אורגני על דגימה ביולוגית מפני נזקי קרינה במהלך התמקדות רשתות כרסום קרן יון יון לאחר מכן sputter מצופה רעלה דקה של מתכת אנאורגנית כדי ליצור שכבה מוליך על חומר ביולוגי ממוקד קרן יון טחינה של lamella באשכול התא או monolayer נעשה בשלב כמה צעדים מועבר לאזור זווית כרסום של עניין נמצא דפוסי כרסום העליון והתחתון נוצרים lamella מחוספס הוא טחון עם ירידה הדרגתית של זרם FIB ועובי lamella הליטוש הסופי של lamella הוא מבוצע רק עם דפוס עליון וזרם FIB נמוך כדי למנוע נזק בקצה הקדמי ואפקט וילון על קרן אלקטרונים משטח lamella מראה את ההתקדמות במהלך תהליך הטחינה כאן אנו יכולים לראות את lamella המלוטש הסופי העובי הסופי של lamella צריך להיות פחות ממאתיים וחמישים ננומטר כדי להיות שקוף להעברת קרן אלקטרונים האיור של lamella כרסום באשכול תאים ו monolayer עם יתרונות וחסרונות של שתי רשתות הסוגים לדוגמה עם לאמלי מועברות בעדינות רבה דרך תא ההכנה בחזרה לסיר ההעמסה מקורר ומלא בחנקן נוזלי טרי ונקי כדי למנוע זיהום קרח של רשתות לאמלי טחונות מוסרות מהמעבורת ומוחזרות חזרה לדגימה של תיבת הרשת עם לאמלי טחון מועברת סוף סוף לרשת מיקרוסקופ קריו אלקטרונים של תיבת ההילוכים צריכה להיות 90 מעלות מסתובבת לפני הכניסה לקלטת הטעינה האוטומטית של TEM כדי להבטיח אוריינטציה נכונה של lamella ביחס לגישה להטיית TEM Lamili נבדקים ואזור עניין לרכישת נתונים טומוגרפיים קריו-אלקטרונים הוא מקומי הציר הראשי Lamella הוא מאונך לציר ההטיה של המיקרוסקופ כדי לראות את שדה הראייה הנכון בזוויות הטיה גבוהות השיטה הדוזימטרית משמשת לאיסוף נתוני טומוגרפיה של אלקטרונים קריו שנאספו טומוגרמה מעובדת לאחר מכן בתוכנת אטומו ומונולאייר מחולקת באמירה תוכנה בפרוטוקול זה הראינו לך כיצד להכין ביעילות דגימת תא שמרים עבור מכונת מיקרו lamella באמצעות כרסום קרן יונים ממוקד קריו וכיצד להכין ולעבד נתוני טומוגרפיה אלקטרונים ותא lamali

preparation-cryo-fib-micromachining-saccharomyces-cerevisiae-for-cryo

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

מאמר זה מתאר את מתודולוגיית המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית, המשמשת להשגת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה של מקרומולקולות במצבן הכמעט טבעי. השיטה מניבה תמונות המתאימות לעיבוד ממוחשב נוסף בגישת החלקיק הבודד, שתוכננה ליצירת שחזור תלת מימדי של מקרומולקולה.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

הביקוש הגובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים דורש שגרת רכישת תמונות בתפוקה גבוהה. מתואר כאן פרוטוקול המיישם את ההתפתחויות האחרונות של אסטרטגיות רכישה מתקדמות שמטרתן למקסם את יעילות הזמן והתפוקה של איסוף נתונים טומוגרפיים.

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

מטרת פרוטוקול זה היא לכוון הידבקות תאים וצמיחה לאזורים ממוקדים של רשתות למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. זה מושג על ידי החלת שכבה נגד עכירות כי הוא ablated בדפוסים שצוינו על ידי המשתמש ואחריו תצהיר של חלבוני מטריצה חוץ תאית באזורים בדוגמת לפני זריעת התא.

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

שבב מיקרו-תבניתי שפותח לאחרונה עם חלונות תחמוצת גרפן מיוצר על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית, המאפשרות הדמיה יעילה ובעלת תפוקה גבוהה של מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה של ביומולקולות וננו-חומרים שונים.

ייצור שבב מיקרו-תבניתי בעובי מבוקר למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה

שיטה זו מספקת פרוטוקול נגיש וגמיש להכנת רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) עבור קריוטומוגרפיה תאית באתרה ומיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM).

הכנת דגימה לקריוטומוגרפיה באתרו של תאי יונקים

למדו הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של Saccharomyces cerevisiae עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מבנים תוך-תאיים ברזולוציה גבוהה בביולוגיה מבנית.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

גלה סרטונים נוספים