Name: יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: חקור שיטת ייצור מיקרופלואידית ללא ליתוגרפיה לדגם עור תלת-ממדי על שבב באמצעות שכבות ויניל ממוכנות וזרימה מקבילית. הפלטפורמה מאפשרת בדיקות תרופות וקוסמטיקה ביעילות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מקרב לב לד"ר חוויאר רודריגז, ד"ר מריה לואיזה לופז, קרלוס מטלן וחואן פרנסיסקו רודריגז על הצעות מועילות מאוד, דיונים ו / או נתונים ראשוניים. אנו מודים בחביבות גם על תרומתם של סרג'יו פרננדז, פדרו הררוס ולארה סטולזנבורג לפרויקט זה. תודה מיוחדת ללכת ד"ר מרתה גרסיה עבור GFP-תווית hFBs ו hKCs. לבסוף, אנו מזהים את הסיוע הטכני המצוין של גיירמו ויזקאינו ואנג'ליקה קוראל. עבודה זו נתמכה על ידי "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. עבודה זו נתמכה גם על ידי "Programa de excelencia", פרויקט EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. עיצוב שבבים ומיקרו-מכונות פרמטרים
<ol><li>עצב את שכבות השבב המיקרופלואידיות באמצעות תוכנת עיצוב קוד פתוח של FreeCAD; עיין בטבלה 1 עבור ממדי הערוצים. כלול ארבעה חורים בקוטר 2.54 מ"מ בעיצוב לשימוש ביישר יישור מותאם אישית עבור שכבת-על נכונה.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>אורך (מיקרומטר)</td>
			<td>רוחב (מיקרומטר)</td>
		</tr>
<tr>
<td>תא תחתון</td>
			<td>28,400</td>
			<td>800</td>
		</tr>
<tr>
<td>תא עליון</td>
			<td>31,000</td>
			<td>800</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מידות הערוצים העליונים והתחתונים של ההתקן.
<ol start="2"><li>חותכים 95 מיקרומטר עבה, דבק, יריעות ויניל שקופות לתוך 30 ס"מ x 30 ס"מ ריבועים כדי להתאים את התווין כראוי.</li>
	<li>השתמש בתוכנת Brother CanvasWorkspace כדי ליצור סביבת עבודה של 30 ס"מ על 30 ס"מ, ולמלא אותה בתבניות המעוצבות לשכבות השונות של השבב(איור 1A). אחסן אותו בקובץ .svg.</li>
	<li>חותכים את יריעות ויניל בגודל 30 ס"מ על 30 ס"מ עם נתח הקצה(איור 1B-D).<ol>
<li>יש לתקוע את יריעת הוויניל על מחצלת דבק נמוכה, ולחסל את כל בועות האוויר במידת הצורך.</li>
		<li>העלה את קובץ .svg לתוויה, והגדר את פרמטרי החיתוך: להב חיתוך: רמה 3; חיתוך לחץ: רמה 0; מהירות חיתוך: רמה 1. מניחים את מחצלת הדבק עם הוויניל לתוך הקושר, ומתחילים את תהליך החיתוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>גזור את תבנית הערוץ העליון על ויניל סרט דו-צדדי בעובי 12 מיקרומטר על-ידי ביצוע השלבים הקודמים.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig1v2.jpg"> איור 1: עיצוב שבב ותהליך מיקרו-מכונות. (A)פריסת תוכנה המציגה את מרחב העבודה המלא בתבניות העליונות והתחתון המיועדות לשבב. (B)קושר קצה במהלך תהליך חיתוך; להב חיתוך, יריעת ויניל שלמה ומחצלת דבק מוצגים. (ג)ויניל בדוגמת ניתוק מגיליון החיתוך. (D)דגימה של שכבת ויניל דבק בדוגמת עיצוב הערוץ העליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. ייצור שכבת PDMS
<ol><li>מערבבים את ה-PDMS ואת סוכן הריפוי ביחס של 10:1 (v/v), ומניחים את התערובת תחת ואקום למשך 15 דקות להסרת בועות אוויר. יוצקים 55 מ"ל מהתערובת לצלחת תרבות של 55 ס"מ2 ריבועית כדי לקבל שכבה בעובי 2 מ"מ. הסר בועות עם מחט.</li>
	<li>לרפא את התערובת (שלב 2.1) בתנור במשך 1 שעה ב 80 °C (80 °F). תפרקו את ה-PDMS וחתכו אותו למלבנים עם מידות השבב. לעשות חורים עבור צינורות עם מחט מזרק 18 G.</li>
</ol>3. הרכבת שבב
הערה: להבנה טובה יותר, ראו איור 2.
<ol><li>הרכב את ההתקן כולו באמצעות קשת יישור להתאמת ערוצים, פרצונים ושקעים כראוי. עורמים ארבע שכבות ויניל (עם המיקרו-פלטרן התחתון המתאים) להרכבת הערוץ התחתון, תוך שמירה על סרט הכיסוי של השכבה התחתונה כדי להימנע מהדבקה ליישר היישור.</li>
	<li>לחתוך ולהניח את הקרום פוליקרבונט (PC) נקבובי על גבי הערוץ התחתון כדי להפריד אותו מן העליון. היזהר לא לכסות את המפרצונים של הערוץ התחתון.</li>
	<li>הוסף עשר שכבות ויניל עם עיצוב התא העליון. תקע שכבת ויניל דו-צדדית עם תבנית הערוץ העליון למעלה. הסר את השבב מיישר היישור ותדביק אותו על שקופית הזכוכית.</li>
	<li>הניחו גיליון PDMS בעובי 2 מ"מ על גבי שכבת ויניל סרט דו-צדדית כדי לספק עיגון מתאים לצינורות ולהימנע מדליפה. השאר משקל על גבי השבב לילה כדי להבטיח את השבב הוא אטום לחלוטין. לחטא את השבב על ידי שטיפה 70% v / v אתנול במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מזוקק H2O.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig02.jpg"> איור 2: הרכבה של שבב מיקרופלואידי. (א)ערכה כללית של הרכבת ההתקן. התאים התחתונים והעליונים מורכבים מארבעה ואחד עשר יריעות ויניל על גבי, בהתאמה. (B)נופים עליונים ו לרוחב של השבב המיקרופלואידי. הערוצים העליונים והתחתונים מיוצגים בוורוד וכחול, בהתאמה. (C)תמונה של הרכבת השבב באמצעות קשת יישור מותאמת אישית. (D)תמונת שבב לאחר הרכבה מלאה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. חיבורי משאבה
הערה: הייצוג הגרפי של חיבורי המשאבות מוצג באיור 3.
<ol><li>חבר את משאבה 1 למפרצון העליון 1 (UCi1).</li>
	<li>חבר משאבה 2 למפרצון התא העליון 2 (UCi2).</li>
	<li>חברו את משאבה 3 למפרצון התא התחתון (LCi).</li>
	<li>חבר שקע תא עליון (UCo) ושקע תא תחתון (LCo) לצינור פסולת.</li>
	<li>חבר את המזרקים לכל מפרצון באמצעות צינורות פוליטרפלואורואתילן (PTFE) ומחברי נירוסטה 18 G.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig03.jpg"> איור 3: חיבורי משאבה ומיקום מכניסות/שקעים. (A)דיאגרמה המציגה את החיבור של שלוש המשאבות השונות למפרצונים המתאימים להן. שקעים מתחברים למיכל פסולת. (B)תמונת שבב עם מפרצונים ושקעים מסומנים. קיצורים: LCi = מפרצון התא התחתון; LCo = שקע תא תחתון; UCi1 = מפרצון התא העליון 1; UCi2 = מפרצון החדר העליון 2; UCo = שקע תא עליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
5. תרבות התא
הערה: לקו התא של ה-HaCaT מקור מסחרי. פיברובלסטים ראשוניים אנושיים מגיעים מתורמים בריאים והושגו מאוסף של דגימות ביולוגיות ממוצא אנושי הרשומות ב"Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".
<ol><li>לעבוד בשכונת תרבית תאים, בעבר מעוקר תחת אור אולטרה סגול וניגב עם אתנול.</li>
	<li>הפשרת תאי H2B-GFP-HaCaT (קרטינוציטים מונצחים אנושיים בעור, hKCs) ופיברובלסטים ראשיים GFP-אנושיים (hFBs) ב 37 °C (57 °C), להוסיף 2 מ"ל של בינוני תרבות, וצנטריפוגה במשך 7 דקות ב 20 °C (50 °F) ב 250 × גרם. הערה: תאי H2B-GFP-HaCaT הם קרטינוציטים מונצחים אנושיים המותאמים כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי הירידי H2B-ירוק (GFP), המספק את הגרעינים שלהם עם פלואורסצנטיות ירוקה. GFP-hFBs הם פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהשתנו עם pLZRS-IRES-EGFP וקטור כדי לבטא פלואורסצנטיות ירוקה ציטופלסמית. תאים אלה שונו בעקבות פרוטוקולים שפורסמו בעבר30,31
</li>
	<li>תרבית הן hKCs והן hFBs ב- 1x DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% ו-1% מהפתרון האנטיביוטי/אנטי-ממיקוטי. מחממים מראש את המדיום התרבותי ב 37 °C (50 °F) לפני השימוש.</li>
	<li>לנתק את התאים על ידי שטיפת אותם עם 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), הוספת 2 מ"ל של טריפסין / אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) ודגורת אותם במשך 10 דקות ב 37 °C (50 °F).</li>
	<li>טריפסין לא מומת הוספת 4 מ"ל של מדיום תרבות. respend התאים, ולהעביר אותם לצינור 15 מ"ל. הסר 10 μL לספור תאים על תא Neubauer ולקבוע את הריכוז המתאים.</li>
	<li>צנטריפוגה צינור 15 מ"ל במשך 7 דקות ב 20 °C (50 °F) ב 250 × גרם. הסר את supernatant, ו resuspend הכדורים בריכוז הרצוי: hFBs ב 50,000 תאים / mL ו hKCs ב 5·× 106 תאים / מ"ל.</li>
</ol>6. הכנת פיברינוגן לפני ג'ל
<ol><li>הפעל תרומבין על ידי הוספת 1mL של CaCl2 (1% w/v ב- NaCl) לבקביון.</li>
	<li>הוסף את הרכיבים הבאים כדי להשיג 1 מ"ל של הידרוג'ל פיברין בריכוז הסופי של פיברין של 3.5 מ"ג / מ"ל: 59 μL של תרומבין מופעל (10 יחידות NIH / מ"ל), 59 μL של חומצה טרנקסמית (טבלת חומרים, 100 מ"ג / מ"ל), 764 μL של בינוני תרבות המכיל 50,000 hFBs / mL, 118 μL של פיברינוגן (20 מ"ג / מ"ל ב NaCl (0.9% w / v)). הערה: פיברינוגן חייב להתווסף ברגע האחרון.</li>
</ol>7. פרוטוקול זרימה מקבילית
<ol><li>משאבה 1x PBS עם משאבה 3 דרך LCi ב 50 μL / min במהלך כל התהליך.</li>
	<li>משאבת נוזל הקרבה (1x PBS) עם משאבה 2 דרך UCi2 ב 100 μL / min.</li>
	<li>טענו את המזרק עם הג'ל שלפני, הניחו אותו במהירות במשאבה 1, והפעילו אותו במהירות של 200 μL/min(איור 4A).</li>
	<li>עצור משאבות 1 ו -2 ברגע שהג'ל מראש יוצא UCo.</li>
	<li>השאירו את השבב מבלי להסיר את הצינורות ב 37 °C (50 °F) לפחות 10 דקות כדי לאפשר gelation.</li>
	<li>משאבת תרבות בינונית ב 50 μL / שעה עם משאבה 3 עד UCi2 לילה.</li>
	<li>חסום את UCi1 עם מכסה.</li>
</ol>8. זריעת מונו-שכבתית hKCs
<ol><li>בדוק מתחת למיקרוסקופ כי hFBs מפוזרים 24 שעות לאחר הדור של התא העורי.</li>
	<li>הציגו את ה-hKCs עם משאבה 2 עד UCi2 ב-5 ×·106 תאים/מ"ל ב-40 μL/min למשך דקה אחת(איור 4B).</li>
	<li>השאירו את השבב למשך הלילה ב 37 °C בקו חממה רווית לחות עבור חיבור לתא.</li>
	<li>משאבת תרבות טרייה בינונית עם משאבה 3 רק דרך LCi ב 50 μL / min (איור 4C).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig04.jpg"> איור 4: פרוטוקול מיקרופלואידי ליצירת המבנה הדרמו-אפידרמלי. (A)חתך רוחבי המציג את תהליך הזרימה המקביל ליצירת התא העורי. (B)קרטינוציט מונו-שכבתית זורעת 24 שעות לאחר יצירת תא עורי. (C)תחזוקת תרבית התא בתוך המכשיר המיקרופלואידי. (ד)בילוי חתך של העור בתוך השבב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
9. תוואי התא
הערה: ערכה חיה/מתה מכתימה תאים עם פלואורסצנטיות ירוקה או אדומה בהתאם למצבם החי או המת. לבידול כדאיות, בשלב זה יש להשתמש ב- hKCs ו- hFBs שאינם פלואורסצנטיים. כל השלבים בהליך מתבצעים באמצעות UCi2 עם משאבה 2.
<ol><li>לשטוף את הערוץ העליון עם 1x PBS במשך 5 דקות ב 50 μL / min כדי להסיר בינוני תרבות.</li>
	<li>לשאוב אוויר כדי להסיר את 1x PBS ב 50 μL / min.</li>
	<li>הכן Calcein AM / אתידיום הומודימר-1 ערכת (חי/ מת) פתרון על ידי ביצוע הוראות היצרן.</li>
	<li>משאבה חי / מת פתרון ב 50 μL / דקה במשך 2 דקות.</li>
	<li>דגירה 30 דקות ב 37 °C (50 °F) בחושך.</li>
	<li>לשטוף את הערוץ העליון על ידי שאיבת 1x PBS ב 50 μL / min במשך 2 דקות כדי להסיר כל ריאגנט הנותרים.</li>
	<li>שים לב לדגימה מתחת למיקרוסקופ הקונפוקלי. השתמש אורך גל עירור של 495/590 ננומטר ואורך גל פליטה של 519/617 ננומטר עבור תאים חיים ומתים, בהתאמה.</li>
</ol>

<ol><li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics%3A+Eye+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li>
<li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+skin+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The use of skin models in drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).</li>
<li>Abd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+the+testing+of+transdermal+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology%3A+Advances+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Skin models for the testing of transdermal drugs.</a> Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).</li>
<li>Flaten, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+skin+models+as+a+tool+in+optimization+of+drug+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).</li>
<li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).</li>
<li>Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronko+et+al.+Reply%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pronko et al. Reply.</a> Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387(2001).</li>
<li>H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858">https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858</a> (2016).</li>
<li>Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html">https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html</a> (2018).</li>
<li>Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered human skin equivalents.</a> Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).</li>
<li>OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guideline for Testing of Chemicals</a>. , (2019).</li>
<li>Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+in+vitro+models+for+safety+and+toxicity+assessment+of+cosmetic+ingredients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients.</a> International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).</li>
<li>vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+future+Prospectives+in+Skin-on-Chip+Development+with+Emphasis+on+the+use+of+Different+Cell+Types+and+Technical+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).</li>
<li>Ataç, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+on-a-chip%3A+In+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li>
<li>Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pumpless+microfluidic+platform+for+drug+testing+on+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents.</a> Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).</li>
<li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-thickness+human+skin-on-chip+with+enhanced+epidermal+morphogenesis+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function.</a> Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multi-organ+chip+-+a+microfluidic+platform+for+long-term+multi-tissue+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526(2015).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+of+a+full-thickness+skin+equivalent+in+a+96-well+insert+format+for+substance+permeation+studies+and+organ-on-a-chip+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications.</a> Bioengineering. 5 (2), 43(2018).</li>
<li>Alberti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-chamber+microfluidic+platform+for+high-precision+skin+permeation+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing.</a> Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+BIotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).</li>
<li>Wufuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-on-a-chip+model+simulating+inflammation%2C+edema+and+drug-based+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment.</a> Scientific Reports. 6, 37471(2016).</li>
<li>Ramadana, Q., Ting, F. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micro-physiological+immune-competent+model+of+the+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin.</a> Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).</li>
<li>Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+effectiveness+of+Curcuma+longa+leaf+extract+on+a+skin+equivalent+using+a+pumpless+skin-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898(2020).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+disease+model+of+drug+toxicity+-+induced+pulmonary+edema+in+a+lung-on-a-chip+microdevice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice.</a> Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).</li>
<li>Beckwitt, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+%27+organ+on+a+chip+%27%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Liver ' organ on a chip '.</a> Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).</li>
<li>Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-gut-microbiome+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Human-gut-microbiome on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li>
<li>Escámez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+optimal+virus-mediated+growth+factor+gene+delivery+for+human+cutaneous+wound+healing+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).</li>
<li>Llames, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+plasma+as+a+dermal+scaffold+for+the+generation+of+a+completely+autologous+bioengineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin.</a> Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).</li>
<li>Llames, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+results+of+an+autologous+engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Clinical results of an autologous engineered skin.</a> Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).</li>
<li>Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+functional+human+skin%3A+production+and+in+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis.</a> Biofabrication. 9 (1), 015006(2016).</li>
<li>Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+integrated+with+perfusable+vascular+channels+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip.</a> Biomaterials. 116, 48-56 (2017).</li>
<li>Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535(2016).</li>
<li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-a-chip%27+developments%3A+A+translational+cuttingedge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).</li>
<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li>
<li>Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+human+corneal+epithelium-on-a-chip+for+eye+drops+mass+transport+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation.</a> Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microfluidic+human+epidermal+keratinocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture.</a> Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).</li>
<li>Ren, K., Chen, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+materials+for+microfluidics+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">New materials for microfluidics in biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המוטיבציה לפתח שיטה זו הייתה הרצון לדגמן מחלות עור וללמוד את ההשפעות של טיפולים חדשים וחדשניים בפלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה. עד כה, מעבדה זו מייצרת את המקבילות הדרמו-אפידרמיס האלה על ידי יציקה - באופן ידני או בעזרת טכנולוגיית הביו-הדפסה התלת-ממדית - ג'ל הפיברין עם פיברובלסטים לתוך צלחת הכנסת צלחת של תרבית התא וזריעת הקרטינוציטים מעליה. ברגע הקרטינוציטים מגיעים למפגש, התרבות 3D נחשפת לממשק נוזלי אוויר, אשר מעורר בידול keratinocyte, יצירת אפידרמיס רבוד וכתוצאה מכך, עור אנושי בין-מפונקארי מפותח32,...

לאחרונה, חלה התקדמות לקראת פיתוח וייצור של מודלים מעור אנושי במבחנה לניתוח הרעילות של מוצרי קוסמטיקה ותרופות1. חוקרים בתעשיות התרופות וטיפוח העור משתמשים בבעלי חיים, עכברים הם הנפוצים ביותר, כדי לבדוק את המוצרים שלהם2,3,4,5. עם זאת, בדיקת מוצרים על בעלי חיים אינה תמיד מנבאת את התגובה בבני אדם, אשר מוביל לעתים קרובות לכשל תרופתי או תופעות לוואי בבני אדם וכתוצאה מכך להפסדים כלכליים5,6. בריטניה הייתה המדינה הראשונה שאסרה על שימוש בבעלי חיים לבדיקות קוסמטיות בשנת 1998. מאוחר יותר, בשנת 2013, האיחוד האירופי אסר על בדיקה והרחקה של מוצרי קוסמטיקה בבעלי חיים (תקנה קוסמטיקה של האיחוד האירופי מס '1223/2009)7.
איסור זה נשקלת גם על ידי מדינות אחרות כגון "חוק הקוסמטיקה ההומנית" בארה"ב8. בנוסף לחששות אתיים, ההבדלים האנטומיים בין עור בעלי חיים לבני אדם הופכים את הניסויים בבעלי חיים לגוזלי זמן רב, יקרים ולעתים קרובות לא יעילים. יתר על כן, גודל השוק העולמי לבדיקות רעלים במבחנה צפוי להגיע ל -26.98 מיליארד דולר עד 20259. מסיבות אלה, יש צורך לפתח שיטות וחלופות חדשות עבור אלה במחקרי מבחנה, כגון מודלים של עור אנושי ביו-הנדסה, המאפשרים בדיקות לבטיחות והשפעות רעילות של קוסמטיקה ותרופות ללא שימוש בבעלי חיים.
ישנם שני סוגים שונים של מודלים מסחריים זמינים, במבחנה, עור אנושי. הסוג הראשון מורכב משכבות אפידרמיס המקבילות שכבות מרובות של קרטינוציטים הבחנה כי הם זרעים על חומרים שונים. חלקם אושרו על ידי הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי (OECD) ואומתו על ידי (המרכז האירופי לאימות שיטות חלופיות (ECVAM) לבדיקות קורוזיה וגירוי בעור, כגון EpiDerm או SkinEthic10,11,12. הסוג השני הוא שווה ערך לעור מלא עם שכבה של קרטינוציטים אנושיים מובחנים המושרשים על פיגום תלת מימדי (3D) המכיל פיברובלסטים, כגון T-Skin ו- EpiDerm-FT. עם זאת, מודלים אלה הם תרבותיים בתנאים סטטיים, מה שהופך אותם לא מסוגל לייצג במדויק תנאים פיזיולוגיים אנושיים.
העניין האחרון התמקד ביצירת מודלים של עור במבחנה תלת-ממדית בפורמטים של הוספת תרבית תאים (CCI) עם זלוף דינמי13,14,15,16,17,18,19. עם זאת, מערכות אלה לא יכולות להיחשב קפדניות sensu כמו עור על שבבים microfluidic לפי ההגדרה הקלאסית שלהם בתחום. ההגדרה של אינגר לאיברים על שבב קובעת כי האיבר חייב להיות ממוקם בתוך הערוצים microfluidic, שהוא מצב כי רק כמה מכשירים למלא20,21. עור על שבבים יש עד כה מודל בעיקר אפיתליה פשוטה כמו שכבות תא יחיד ו / או שכבות תא עור מופרדות על ידי קרום נקבובי22,23. למרות שהיו כמה התקדמות מידול העור במערכות microfluidic16,24, אין כרגע ספרות המציגה מערכת איבר על שבב שמתאימה להגדרה של אינגר, מסוגל לייצר עור רב שכבתי במקום וכולל הן רכיבים אפיתל סטרומיים.
בעבודה זו מוצגת פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה, חסכונית, חזקה ומבוססת ויניל עבור יישומי עור על שבב. פלטפורמה זו הופקה על ידי עיבוד מיקרו, המספק פשטות רבה יותר בתהליך הייצור, כמו גם גמישות מוגברת ורב-תכליתיות בפריסת המכשיר, תוך התגברות על חלק מהמגבלות של PDMS25. כמו כן תוכננה דרך להציג מבנה עור פשוט באמצעות זרימה מקבילה הנשלטת באמצעות משאבות מזרק. זרימה מקבילה מאפשרת שני נוזלים עם צמיגות שונה מאוד (חיץ ופיברין pre-gel במקרה זה) להיות perfused דרך ערוץ מבלי לערבב אחד עם השני. כהוכחה לרעיון, הוכנס למכשיר מבנה דרמו-אפידרמיס המכיל פיברובלסטים המוטבעים במטריצת פיברין המחקה את הדרמיס, ומעליו נטען מונולייר של קרטינוציטים כדי לחקות את האפידרמיס הגלי. ניתן לאפנן את גובה התא העורי על-ידי שינוי קצבי הזרימה. החידוש העיקרי של עבודה זו, בהשוואה לדגמים שתוארו בעבר22,26,27,28,29, הוא פיתוח של מבנה תלת מימדי בתוך microchamber באמצעות מיקרופלואידיקה. למרות מאמר זה מציג עור פשוט לא מובחן, המטרה לטווח ארוך היא ליצור ולאפיין מבנה עור מובחן לחלוטין כדי להדגים את הכדאיות שלה ואת הפונקציונליות למטרות בדיקה סמים וקוסמטיים.

<table><tbody><tr><td>Amchafibrin</td><td>Rottafarm</td><td></td><td>חומצה טרנקסמית</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה/אנטי-פטריית</td><td>תרמו מדעי HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית</td><td>פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרט דו צדדי vynil</td><td>מערכות דבק ATP</td><td></td><td>GM 107CC, 12 ומיקרו; m עבה</td></tr><tr><td>פלוטר קצה</td><td>Brother</td><td></td><td>Scanncut CM900</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>מופק משקופית זכוכית פלזמה אנושית</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-פיברובלסטים עוריים אנושיים-ראשוני</td><td></td><td></td><td>. מתנה מד"ר מרתה גרק&יאקוטה; </td></tr><tr><td>קו תאים H2B-GFP-HaCaT</td><td>ATCC</td><td></td><td>קרטינוציטים אימורטליים. מתנה מד"ר מרתה גרק&יאקוטה; </td></tr><tr><td>ערכה חיה/מתה</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממברנת פוליקרבונט</td><td>Merk TM</td><td></td><td>5 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>פולידימתילסילוקסן</td><td>דאו קורנינג</td><td></td><td>סילגארד 184</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>טרומו</td><td></td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>תרומבין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>10 NIH / בקבוקון</td></tr><tr><td>ויניל דבק שקוף</td><td>Mactac</td><td></td><td>JT 8500 CG-RT, 95 ומיקרו; עבה m</td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>IDEX</td><td></td><td>טפלון, 1/16 אינץ' OD, 0.020 אינץ' מזהה</td></tr></tbody></table>

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

עבודה זו מציגה פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה, חסכונית ואמינה עם פוטנציאל ליצור רקמות מרובות שכבות מורכבות. כהוכחה לרעיון, עור אנושי פשוט ובלתי מובחן המכיל תא עורי (סטרומי) ותא אפיתל (אפיתל). לשם כך פותח מכשיר רב-תכליתי וחזק המבוסס על ויניל המחולק לשני תאים, המתגבר על חלק מהחסרונות הקיימים במכשירים מיקרופלואידיים המבוססים על פולידימתילסילוקסן (PDMS) ליישומים ביו-רפואיים, כגון שימוש בציוד יקר ומיוחל או ספיגת מולקולות וחלבונים קטנים והידרופוביים. יתר על כן, פותחה שיטה חדשה המבוססת על זרימה מקבילה, המאפשרת תצהיר במקום של תאי העור והאפידרמיס. מבנה העור מורכב מטריצת פיברין המכילה פיברובלסטים ראשוניים אנושיים ומונו-שכבתית של קרטינוציטים מונצחים המושרשת למעלה, אשר נשמרת לאחר מכן בתנאי תרבות דינמיים. פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה זו פותחת את האפשרות לדגמן מחלות עור אנושיות ולהסיק את השיטה ליצירת רקמות מורכבות אחרות.

השבב המעוצב מורכב משני תאים נוזליים המופרדים על ידי קרום מחשב בגודל 5 מיקרומטר המאפשר את צמיחת התא על ידי מתן אפשרות למעבר של מולקולות מקדמות צמיחה מהתא התחתון. התא העליון מחזיק את מבנה הרקמה, במקרה זה, monolayer של hKCs על הידרוג'ל פיברין המכיל hFBs.
גובה הערוצים נקבע לפי מספר גליונות הדבקה שנוספו לכל ערוץ. התא התחתון מורכב מ-4 שכבות (380 מיקרומטר) והתא העליונה של 10 שכבות סרט חד-צדדיות ואחת דו-צדדית (962 מיקרומטר). מידות השבב הן 4 ס"מ על 2 ס"מ, מה שמגביר את המניפולציה שלו. יריעות ויניל דבק ל...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל עור תלת מימדי פשוט ובלתי מופרע באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות. גישת זרימה מקבילה מאפשרת תצהיר במקום של תא עורי לזרוע של תאי אפיתל על גבי, כל נשלט על ידי משאבות מזרק.

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

זהו פרוטוקול חדשני, נטול ליטוגרפיה למידול עור על שבב תלת-ממדי באמצעות שכבות ויניל מיקרו-מכונות, דבק ומתודולוגיית זרימה מקבילה ליצירת תא עור. ויניל micromachined מספק יותר פשטות בתהליך הייצור ורבגוניות בפריסה של המכשיר, להתגבר על כמה מגבלות של PDMS וגישות ליטוגרפיה מסורתית. זה עור על שבב רב שכבתי יכול לשמש עבור גישות בדיקות סמים וקוסמטיקה, שכן הוא מאפשר הקרנה תפוקה גבוהה בעלויות נמוכות יותר והוא יכול לשמש מודל מספר מחלות.התחל על ידי עיצוב שבב microfluidic באמצעות תוכנת אח Canvas Workspace. צור סביבת עבודה בגודל 30 על 30 ס"מ ומלא אותה בתבניות העיצוב של השכבות השונות של השבב לפני אחסונו בקובץ svg. חותכים את יריעות ויניל 30 על 30 ס"מ.תקעו אותו במחצלת דבק נמוכה וסלקו את כל בועות האוויר, לפי הצורך. באמצעות כונן USB, העלה את קובץ ה- svg לתווית הקצה, והגדר את פרמטרי החיתוך כלחץ חיתוך ברמה אפס, חיתוך להב ברמה שלוש ורמה אחת למהירות החיתוך. כאשר הפרמטרים מוגדרים, מניחים את מחצלת הדבק עם הוויניל לתוך התווין ולהתחיל את התהליך של חיתוך דפוסי הערוץ על ויניל בעובי 95 מיקרומטר.הרכב את ההתקן כולו באמצעות קשת יישור לערוצי התאמה מתאימים, פרצונים ושקעים. נערמים עבור שכבות ויניל עם עיצוב מיקרו-מאצ'ין מתאים להרכבת הערוץ התחתון, תוך שמירה על סרט הכיסוי של השכבה התחתונה כדי למנוע הידבקות ליישר היישור. חותכים ומניחים את הקרום הנקבובי פוליקרבונט על גבי הערוץ התחתון מבלי לכסות את המפרצונים.הוסיפו 10 שכבות ויניל בעיצוב התא העליון והדביקו שכבה סופית דו-צדדית של סרט הדבקה למעלה. הסר את השבב מיישר היישור כדי להדביק אותו על שקופית הזכוכית. הניחו גיליון PDMS בעובי שני מילימטר על גבי שכבת הוויניל הדו-צדדית.כדי להבטיח שהשבב אטום למים לחלוטין, השאר משקל על גבי השבב למשך הלילה. למחרת, לחטא את השבב על ידי שטיפה אותו עם 70% אתנול במשך חמש דקות, ואחריו לשטוף עם מים מזוקקים. חבר משאבה אחת ולשאוב שניים למפרצון החדר העליון אחד ואת מפרצון התא העליון שני, בהתאמה.חברו את המשאבה השלישית לפרצון התא התחתון, ולאחר מכן חברו את התא העליון ואת שקעי התא התחתון לאמבט פסולת. חבר את המזרקים לכל מפרצון באמצעות צינורות PTFE ומחברי נירוסטה 18-מד. משאבת PBS עם משאבה שלוש דרך מפרצון התא התחתון ב 50 microliters לדקה, ועם משאבה שתיים דרך מפרצון התא העליון שתיים ב 100 microliters לדקה.לאחר מכן, לטעון את המזרק עם פיברינוגן מראש ג'ל, מיד למקם אותו לתוך משאבה אחת, ולהפעיל אותו ב 200 microliters לדקה. ברגע שהג'ל יוצא מהשקע העליון, עצור משאבות אחת ושתיים, ואז, מבלי להסיר את הצינורות, להשאיר את השבב כדי לאפשר גלציה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר גלציה, לחסום את החדר העליון מפרצון אחד עם כובע, ולשאוב את המדיום התרבותי דרך מפרצון החדר העליון שתיים עם משאבה שלוש ב 50 microliters לשעה לילה.24 שעות לאחר הדור של התא העורי, לבדוק כי תאים פיברובלסט ראשוני אנושי מפוזרים בהרכבה, ולאחר מכן להציג חמש פעמים 10 ל 6 HKCs למיליליטר דרך הכניסה התעלה העליונה שתיים ב 40 microliters לדקה במשך דקה אחת. לחיבור לתאים, הניחו את השבב למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רווי לחות. התחל שאיבה של מדיום תרבות טרי עם משאבה שלוש רק דרך הכניסה לתא התחתון ב 50 microliters לדקה.בניתוח הייצוגי מוצג גובה ההידרוג'ל לאורך התא העליון של ההרכבה. גובה ממוצע של 550 מיקרומטר היה אופטימלי לתפקוד הג'ל בקצבי הזרימה של 100 ו -200 מיקרוליטרים לדקה עבור PBS ההקרבה ואת pre-gel, בהתאמה. כישלון לשטוף PBS דרך הערוץ התחתון הוביל לפערים בין הגובה התיאורטי של הג'ל לבין זה שנמדד, עם הבדל של 40%לאחר 24 שעות מתחילת פרוטוקול זרימה מקבילה, הפיברובלסטים העיקריים האנושיים נמצאו מופצים בהצלחה בג'ל פיברין בתא העליון של ההרכבה, לאחר מכן, HKCs חלבון פלורסנט ירוק ביטוי יכול להיות זרע ביעילות על גבי הידרוג'ל.הסרת צינורות מבלי לשמור על המערכת סגורה למשך הלילה כדי לאפשר HKCS משקעים הביא מונו-שכבתית לא אחידה, מתנשאת של תאים. ניתוח קונפדוקלי תלת-ממדי של דגם העור הלא מופרע בשבב המיקרופלואידי הראה בבירור את פני השטח של ההידרוג'ל המפריד בין HKCs בחלק העליון מהפיברובלסט המוטמע בתחתית. העור שנוצר יכול להיחשף לממשק האוויר / נוזל כדי לקבל אפידרמיס בוגר ומובחן, ועוד יותר להיות מאופיין באמצעות מספר סמנים עוריים ואפידרמיס.טכניקה זו מאפשרת ייצור מכשיר מהיר וזול יותר, ויצירת עור רב שכבתי באמצעות מיקרופלואידיקה, ומספקת גישה מציאותית יותר לבדיקות תרופות וקוסמטיקה.

generation-simplified-three-dimensional-skin-on-chip-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים מיקרו bioreactors. אחת שבב יכול בית עד 10 Mio. תאים שיכולים להיות מעובדים בתנאים מוגדרים במדויק לגבי זרימת נוזלים, מתח וכו 'חמצן בלולאה, סטרילי במחזור סגור.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול המפורט ליצירת שחזורי עור אורגנוטיפיים תלת-ממדיים במבחנה לחקר התקדמות המלנומה. מודל עור זה מחקה הן את הארכיטקטורה והן את המורכבות הרב-תאית של איברים in vivo.

יצירת שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים: הליך לביסוס מודל עור תלת ממדי באמצעות דגימות עור אנושיות

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

אנו מציגים פרוטוקול להשיג מטריצות תאים שמקורם עשירות בחלבונים תאים מטריקס, באמצעות crowders macromolecular (MMC). בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אשר משלב MMC בדור העור 3D organotypic שיתוף התרבות, אשר מקטין את זמן תרבות תוך שמירה לפדיון של מבנה.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ייצור של הערוץ מתיחה, כפול, איברים שבב microfluidic תא תרבות מכשירי recapitulating איברים ברמת פונקציונליות בתוך חוץ גופית.

ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים

אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לטיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי מחדש באופן ניתן לשחזור וחזק. בנוסף, הוא מאפיין את הקשר המבני-פונקציה של מודל מחסום האפידרמיס. התגובות הביולוגיות של האפידרמיס האנושי המחודש על גירויים proinflammatory מוצגים גם.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היכולות ואת אופני התרבית החיוניים של שבב האיברים הפתוח להקמה והבשלה מוצלחת של תרביות איבר-על-שבב בעובי מלא של רקמות ראשוניות (עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי), ומספק הזדמנות לחקור היבטים תפקודיים שונים של ממשק נישה אפיתל/מזנכימלי וכלי דם אנושי במבחנה.

שחזור ציטוארכיטקטורה ותפקוד של רקמות אפיתל אנושיות על שבב-איבר פתוח

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת איבר-על-שבב (OOC) שנועדה לחקות כריתת ריאות. מערכת זו חוקרת את המתאם הפוטנציאלי בין פגיעה בגליקוקליקס לסיבוכים לאחר כריתת ריאות.

מידול הגליקוקליקס האנדותל לאחר כריתת ריאות בשבב נוזלי תלת מימדי - גישה לייצור מערכת איבר-על-שבב מבוססת כלי דם

חקור שיטת ייצור מיקרופלואידית ללא ליתוגרפיה לדגם עור תלת-ממדי על שבב באמצעות שכבות ויניל ממוכנות וזרימה מקבילית. הפלטפורמה מאפשרת בדיקות תרופות וקוסמטיקה ביעילות ובעלות נמוכה.

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

גלה סרטונים נוספים