יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

זהו פרוטוקול חדשני, נטול ליטוגרפיה למידול עור על שבב תלת-ממדי באמצעות שכבות ויניל מיקרו-מכונות, דבק ומתודולוגיית זרימה מקבילה ליצירת תא עור. ויניל micromachined מספק יותר פשטות בתהליך הייצור ורבגוניות בפריסה של המכשיר, להתגבר על כמה מגבלות של PDMS וגישות ליטוגרפיה מסורתית. זה עור על שבב רב שכבתי יכול לשמש עבור גישות בדיקות סמים וקוסמטיקה, שכן הוא מאפשר הקרנה תפוקה גבוהה בעלויות נמוכות יותר והוא יכול לשמש מודל מספר מחלות.

התחל על ידי עיצוב שבב microfluidic באמצעות תוכנת אח Canvas Workspace. צור סביבת עבודה בגודל 30 על 30 ס"מ ומלא אותה בתבניות העיצוב של השכבות השונות של השבב לפני אחסונו בקובץ svg. חותכים את יריעות ויניל 30 על 30 ס"מ.

תקעו אותו במחצלת דבק נמוכה וסלקו את כל בועות האוויר, לפי הצורך. באמצעות כונן USB, העלה את קובץ ה- svg לתווית הקצה, והגדר את פרמטרי החיתוך כלחץ חיתוך ברמה אפס, חיתוך להב ברמה שלוש ורמה אחת למהירות החיתוך. כאשר הפרמטרים מוגדרים, מניחים את מחצלת הדבק עם הוויניל לתוך התווין ולהתחיל את התהליך של חיתוך דפוסי הערוץ על ויניל בעובי 95 מיקרומטר.

הרכב את ההתקן כולו באמצעות קשת יישור לערוצי התאמה מתאימים, פרצונים ושקעים. נערמים עבור שכבות ויניל עם עיצוב מיקרו-מאצ'ין מתאים להרכבת הערוץ התחתון, תוך שמירה על סרט הכיסוי של השכבה התחתונה כדי למנוע הידבקות ליישר היישור. חותכים ומניחים את הקרום הנקבובי פוליקרבונט על גבי הערוץ התחתון מבלי לכסות את המפרצונים.

הוסיפו 10 שכבות ויניל בעיצוב התא העליון והדביקו שכבה סופית דו-צדדית של סרט הדבקה למעלה. הסר את השבב מיישר היישור כדי להדביק אותו על שקופית הזכוכית. הניחו גיליון PDMS בעובי שני מילימטר על גבי שכבת הוויניל הדו-צדדית.

כדי להבטיח שהשבב אטום למים לחלוטין, השאר משקל על גבי השבב למשך הלילה. למחרת, לחטא את השבב על ידי שטיפה אותו עם 70% אתנול במשך חמש דקות, ואחריו לשטוף עם מים מזוקקים. חבר משאבה אחת ולשאוב שניים למפרצון החדר העליון אחד ואת מפרצון התא העליון שני, בהתאמה.

חברו את המשאבה השלישית לפרצון התא התחתון, ולאחר מכן חברו את התא העליון ואת שקעי התא התחתון לאמבט פסולת. חבר את המזרקים לכל מפרצון באמצעות צינורות PTFE ומחברי נירוסטה 18-מד. משאבת PBS עם משאבה שלוש דרך מפרצון התא התחתון ב 50 microliters לדקה, ועם משאבה שתיים דרך מפרצון התא העליון שתיים ב 100 microliters לדקה.

לאחר מכן, לטעון את המזרק עם פיברינוגן מראש ג'ל, מיד למקם אותו לתוך משאבה אחת, ולהפעיל אותו ב 200 microliters לדקה. ברגע שהג'ל יוצא מהשקע העליון, עצור משאבות אחת ושתיים, ואז, מבלי להסיר את הצינורות, להשאיר את השבב כדי לאפשר גלציה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר גלציה, לחסום את החדר העליון מפרצון אחד עם כובע, ולשאוב את המדיום התרבותי דרך מפרצון החדר העליון שתיים עם משאבה שלוש ב 50 microliters לשעה לילה.

24 שעות לאחר הדור של התא העורי, לבדוק כי תאים פיברובלסט ראשוני אנושי מפוזרים בהרכבה, ולאחר מכן להציג חמש פעמים 10 ל 6 HKCs למיליליטר דרך הכניסה התעלה העליונה שתיים ב 40 microliters לדקה במשך דקה אחת. לחיבור לתאים, הניחו את השבב למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רווי לחות. התחל שאיבה של מדיום תרבות טרי עם משאבה שלוש רק דרך הכניסה לתא התחתון ב 50 microliters לדקה.

בניתוח הייצוגי מוצג גובה ההידרוג'ל לאורך התא העליון של ההרכבה. גובה ממוצע של 550 מיקרומטר היה אופטימלי לתפקוד הג'ל בקצבי הזרימה של 100 ו -200 מיקרוליטרים לדקה עבור PBS ההקרבה ואת pre-gel, בהתאמה. כישלון לשטוף PBS דרך הערוץ התחתון הוביל לפערים בין הגובה התיאורטי של הג'ל לבין זה שנמדד, עם הבדל של 40%לאחר 24 שעות מתחילת פרוטוקול זרימה מקבילה, הפיברובלסטים העיקריים האנושיים נמצאו מופצים בהצלחה בג'ל פיברין בתא העליון של ההרכבה, לאחר מכן, HKCs חלבון פלורסנט ירוק ביטוי יכול להיות זרע ביעילות על גבי הידרוג'ל.

הסרת צינורות מבלי לשמור על המערכת סגורה למשך הלילה כדי לאפשר HKCS משקעים הביא מונו-שכבתית לא אחידה, מתנשאת של תאים. ניתוח קונפדוקלי תלת-ממדי של דגם העור הלא מופרע בשבב המיקרופלואידי הראה בבירור את פני השטח של ההידרוג'ל המפריד בין HKCs בחלק העליון מהפיברובלסט המוטמע בתחתית. העור שנוצר יכול להיחשף לממשק האוויר / נוזל כדי לקבל אפידרמיס בוגר ומובחן, ועוד יותר להיות מאופיין באמצעות מספר סמנים עוריים ואפידרמיס.

טכניקה זו מאפשרת ייצור מכשיר מהיר וזול יותר, ויצירת עור רב שכבתי באמצעות מיקרופלואידיקה, ומספקת גישה מציאותית יותר לבדיקות תרופות וקוסמטיקה.