μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo

פרוטוקול זה מאפשר התבוננות בתפקודים של תאי טעם במיקרו-סביבה טבעית עם קשרים עצביים וזרימת הדם שנותרה ללא פגע. באמצעות טכניקה זו, תקשורת בין תאים יכולה להיחקר ב- vivo. ראשית, מלאו את המאגרים של מערכת זלוף הזרימה בלחץ ברוק מלאכותי ותירסים.

חבר את קו האוויר הדחוס לקלט הווסת והגדר את לחץ האוויר במערכת האספקה הנוזלית ל -30 עד 50 פאונד לאינץ 'מרובע. הגדר את לחץ הפלט של הווסת ל 0.4 פאונד לאינץ 'מרובע ולבדוק אם נוזל מתחיל לזרום מהצינור. חבר את הסעפת מהמאגרים ליציאת הכניסה של הלשון הזעירה, ולאחר מכן חבר את יציאת היציאה של הלשון הזעירה למשאבת מזרק ומשוך נוזל בכ -300 מיקרוליטרים לדקה כדי לקבוע מצב יציב.

אשר כי נפח הטיפה התלוי מתחת ללשון המיקרו נשאר קבוע ולהתאים את לחץ האוויר ואת קצב הזרימה כדי לקבל את גובה המדגם הרצוי. לאחר שהמערכת המיקרופלואידית הוקמה, נתק את קו האוויר הדחוס וכבה את משאבת המזרק עד שהעכבר הוכן להדמיית ויוו. לאחר מתן הרדמה לעכבר, תוך ורידי להזריק TRITC-dextran דרך מסלול רטרו-מסלולית כדי לצפות במחזור הדם במהלך הדמיה.

עם העכבר ממוקם בתנוחת עלון, לרסס 70% אתנול על ראשו. השתמש במלקחיים כדי להרים את עור הראש בקלילות, ולאחר מכן להשתמש במספריים כדי ללגום כשבעה מילימטרים רבועים של העור. לאחר ניקוי השיער סביב הקרקפת, להסיר את periosteum מתחת לעור ולהחיל דבק מיידי על הגולגולת.

לאחר מכן צרף את מתקן הראש המותאם אישית. לאחר הדבקה מיידית הוא התקשה, להחיל דבק דנטלי סביב מתקן הראש ולבסס אותו על ידי תאורה עם אור כחול. באמצעות דבק מיידי כדי להדביק את השפה התחתונה של העכבר ליחידה התחתונה של הלשון הזעירה, ואז הניח את העכבר על לוח ההכנה לעכבר ואבטח את היחידה התחתונה בלשון המיקרו לעמודי האחיזה על ידי יישור החורים בקצה הלשון הזעירה עם העמודים.

הדק את מתקן ראש העכבר למחזיק מתקן הראש בלוח והתאם את המרחק בין ראש העכבר להתקן. לאחר מכן, באמצעות מחזיק מתקן הראש, סובב את ראש העכבר בצורה חלקה בכ- 45 מעלות. לאחר אבטחת העכבר ללוח, השתמש פינצטה מפלסטיק כדי לצייר את לשונו בעדינות.

לאחר מכן, באמצעות דבק מיידי, חבר את הצד הגחון של הלשון לצד העליון של היחידה התחתונה של הלשון הזעירה. כדי לשמור על הלשון לחה, לנגב את פני השטח עם צמר גפן רטוב, ולאחר מכן מניחים חתיכת רקמה ספוגה ברוק מלאכותי על פני השטח החשופים של הלשון. הנח את מכונות הכביסה המעוקלות על העמודים, החזקת החלק התחתון של הלשון הזעירים, ולאחר מכן הזז את הכנת העכבר לשלב המיקרוסקופ.

מקם את הלשון החשופה של העכבר מתחת למרכז המשוער של אזור המטרה של המיקרוסקופ, הקפד לא לסטות מהטווח הדינמי של הבמה, ולאחר מכן הדק את הברגים כדי לחבר בחוזקה את לוח העכבר על הבמה. מניח כרית חימום מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה בין 36.5 ל 37.5 מעלות צלזיוס. כדי למנוע מנוזל להיכנס קנה הנשימה של העכבר, הנח פיסת נייר מעוותת דקה בתוך פיו של העכבר, ולאחר מכן הסר את הרקמה הרטובה המונחת על פני הלשון והנח את לשון המיקרו המוכנה על לשון העכבר, כך שפני השטח של הלשון נראים דרך חלון ההדמיה.

אבטחו את הלשון הזעירה על ידי עדין של שני הקצוות בלחץ דחיסה מינימלי. כדי להתחיל לרכוש תמונות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ ולאחר מכן הפעל את לייזר 920 ננומטר שני פוטון. הר את המטרה טבילת מים על המיקרוסקופ, ולאחר מכן להוריד את המטרה על חלון ההדמיה של לשון מיקרו ולטבול את המטרה.

במצב מצלמה, האר את פני השטח של הלשון על ידי הפעלת האור הכחול מנורת כספית. כדי למצוא את מישור המוקד המשוער, התאם את ציר Z וחפש אות פלואורסצנטיות אוטומטית מהפאפילה הפיליבפורמית. לאחר מכן, בעזרת ידית ההתאמה X ו-Y, אתר בלוטות טעם.

עבור למצב ריבוי פוטונים ולאחר מכן הגדר את אורך הגל של העירור, ערכת מסנני הפליטה, מצב הסריקה וגודל המסגרת לרכישת תמונה. כאשר בלוטות הטעם במרכז חלון ההדמיה, אתר את כלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם כשני שלישים מגובה בלוטות הטעם ודמיין את זרימת הדם. אם זרימת הדם סתומה, שחררו מעט את הברגים לתיקון כדי לחדש את זרימת הדם.

התאימו את ציר Z כדי למצוא את מישור Z של בלוטות טעם המכילות מספר מספיק של תאי טעם, ולאחר מכן המשיכו עם הדמיית סידן בשתיים עד שש הרץ למשך 80 שניות. לאחר תחילת ההדמיה, יש להפעיל את המאגר של המערכת הנוזלית כדי לספק פתרון טעם למשך 20 שניות. לאחר 20 שניות של גירוי טעם, להעביר את המאגר בחזרה לרוק מלאכותי.

במהלך ההדמיה, המתינו כשלוש עד ארבע דקות בין מפגשים המספקים בעקביות רוק מלאכותי כדי לשמור על הלשון לחה ולשטוף את הטעים שנותרו מהפגישה הקודמת. משטח הלשון של עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato מכוסה בפפילה פילפורמית פלואורסצנטית ומופצת בדלילות בלוטות טעם. הפפילה filiform בצהוב נתפסים באמצעות גלאי צילום ב 500 עד 550 ננומטר וניתן לראות מפני השטח של הלשון עד כ 25 מיקרומטר לעומק.

אותות GCaMP בירוק שזוהו על ידי מסנן 500 עד 550 ננומטר ואותות tdTomato באדום, שזוהו על ידי מסנן 607 עד 670 ננומטר, מייצגים את תאי הטעם. אות tdTomato מתקבל לניתוח מטרי יחס. כלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם נרכשים באמצעות מסנן 500 עד 550 ננומטר שנקבע ברקמת חיבור הקולגן, התומכת מבחינה מבנית בבלוטות הטעם, נרכש באמצעות ערכת המסננים 447 עד 460 ננומטר.

בדוגמה מייצגת זו של הקרנת טעם in-vivo באמצעות הדמיית סידן, כל תא טעם הוא תוחם על ידי קווים מקווקווים. במשפט זה, תא 2 הגיב הן לתמיסות מתוקות והן לתמיסות אומאמי. ותא 3 הגיב לתהלי מלח נמוכים וגבוהים כאחד.

אף אחד מהתאים בבלוטות הטעם הזו לא הגיב לטעמים חמוצים. מכיוון שמטרת ניסוי זה היא להתבונן בתפקוד התאים הטעמים בסביבה הטבעית, חשוב להעביר את הפלואורסצנטים לכלי הדם בשלב ההכנה ולאשר את זרימת הדם במהלך הניסוי.