Name: μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למד הדמיה פונקציונלית של תאי טעם בלשון חיה באמצעות מערכת µTongue מבוססת מיקרופלואידיקה. שיטה זו מאפשרת מחקר של תקשורת בין-תאית ותגובות לטעמים בתנאים פיזיולוגיים טבעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R015-D1), מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מס '2019M3A9E2061789), ועל ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) הממומן על ידי ממשלת קוריאה (מס '2019M3E5D2A01058329). אנו מודים לאונסו קים ויוג'ין לי על הסיוע הטכני שלהם.

כל ההליכים הכירורגיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סונגקיונקוואן והאוניברסיטה הלאומית של סיאול.
1. הכנת פתרונות: רוק מלאכותי וטרסמים
<ol><li>הכן רוק מלאכותי על ידי המסת 2 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 מ"מ CaCl2, 0.25 מ"מ MgCl2, 0.12 מ"מ K2HPO4, 0.12 מ"מ KH2PO4, ו 1.8 mM HCl במים מזוקקים (>1 L), ולהתאים את ה- pH של הפתרון ל 7 (ראה טבלת חומרים)12.</li>
	<li>הכן טעים, כגון חמוץ: 10 mM חומצת לימון; מלוח: 400 mM NaCl, אופציונלי עם 50 מיקרומטר אמילורי; מתוק: 40 מ"מ אצסולפאם K; מריר: תערובת של 5 mM כינין, 5 mM denatonium ו 20 μM cycloheximide, על ידי המסת כימי הטעימה ברוק מלאכותי מוכן בשלב 1.1.</li>
</ol>2. הכנת המערכת המיקרופלואידית
הערה: פריטים טעימים הועברו ללשון העכבר באמצעות מערכת משלוח נוזלית רב-ערוצית בלחץ (עיין באיור 1 ובטבלת החומרים).
<ol><li>מלאו את המאגרים של מערכת זלוף הזרימה בלחץ ברוק מלאכותי וטסמים.</li>
	<li>חבר את קו האוויר הדחוס לקלט הווסת והגדר את לחץ האוויר בין 30 ל -50 פסאיי במערכת האספקה הנוזלית.</li>
	<li>הגדר את לחץ הפלט של הרגולטור ל 0.4 פסאיי ולבדוק אם נוזל יוצא מהצינור תחת לחץ זה.</li>
	<li>חבר את הסעפת מהמאגרים ליציאת הקלט של μTongue.</li>
	<li>חבר את יציאת הפלט של μTongue למשאבת מזרק ולמשוך נוזל עם ~ 300 μL∙min-1 כדי לקבוע את מצב יציב. שימו לב לנפח הקבוע של טיפה תלויה מתחת ל-μTongue. התאם את הערך של פרמטר ההגדרה בהתאם לגובה הדוגמה.</li>
	<li>נתק את קו האוויר הדחוס והפסק את משאבת המזרק עד להשלמת שלב 3 של הפרוטוקול.</li>
</ol>3. הכנת עכבר להדמיית ויוו (איור 2).
הערה: כל ההכנות לבעלי חיים בוצעו בשעות היום בתנאים אספטיים על שולחן עבודה במעבדה.
<ol><li>הרדמה של עכבר<ol>
<li>הכן עכבר בן 7 שבועות או מבוגר משני המינים. השתמש בקו עכבר מהונדס גנטית המבטא חלבוני פלואורסצנטיות חישת סידן בתאי הטעם.</li>
		<li>העכבר מרוסן להרדמה. תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג קסילאצין מוזרק תוך-איפריטונית לעכבר13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TRITC-dextran (500 kDa) ב 2.5% W / V תמיסת מלח פוספט הוא administrated תוך ורידי לתוך העכבר דרך מסלול רטרו-מסלולית כדי לצפות במחזור הדם במהלך מפגש הדמיה.</li>
	<li>חבר מתקן ראש על גולגולת העכבר כדי למזער את חפצי התנועה.<ol>
<li>ראש העכבר מרוסס ב- 70% ETOH בזמן שהעכבר ממוקם במצב על-גוף. הרם את העור ראש קלות עם מלקחיים ולגזור כ 7 מ"מ2 עם מספריים.</li>
		<li>נקו את השיער סביב הקרקפת, הסירו את ה- periosteum מתחת לעור, החל דבק מיידי על הגולגולת וחיברו מתקן ראש מותאם אישית.</li>
		<li>לאחר הדבקה מיידית הוא התקשה, להחיל דבק דנטלי סביב מתקן הראש ולהאיר עם אור כחול כדי לחזק את הדבק הדנטלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את לשון העכבר על היחידה התחתונה של μTongue.<ol>
<li>חבר את השפה התחתונה של העכבר ליחידה התחתונה של μTongue עם דבק מיידי.</li>
		<li>הניחו את העכבר על הלוח (לוח הכנת העכבר באיור 1B) והכניסו את היחידה התחתונה של ה-μTongue לעמדות (עמדת אחיזה של μTongue באיור 1B). ודא כי החורים בקצה היחידה התחתונה מיושרים לעמדה.</li>
		<li>הדק את מתקן ראש העכבר למחזיק מתקן הראשים בלוח. לאחר מכן, התאם את המרחק בין ראש העכבר להתקן. סובב את ראש העכבר בצורה חלקה בערך 45° באמצעות מחזיק מתקן הראש. תהליך זה מונע מגע פיזי של אף העכבר עם מטרת מיקרוסקופ.</li>
		<li>צייר את לשון העכבר בעדינות באמצעות פינצטה מפלסטיק וחבר את הצד הגחון של הלשון לצד העליון של היחידה התחתונה של ה- μTongue. לאחר מכן, לנגב את פני השטח של לשון העכבר עם צמר גפן רטוב.</li>
		<li>השרו פיסת נייר ברוק המלאכותי ומניחים אותה על המשטח החשוף של לשון העכבר כדי לשמור על מצב רטוב.</li>
		<li>הנח את מכונות הכביסה המעוקלות על העמודים המכילים את שני קצות החלק התחתון של μTongue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הנח את הכנת העכבר על במת המיקרוסקופ. מקם את לשון העכבר החשופה מתחת למרכז המשוער של האזור האובייקטיבי של המיקרוסקופ. הקפד לא לסטות מהטווח הדינמי של הבמה. לאחר מכן, הדק את לוח העכבר על הבמה עם ברגים.</li>
	<li>מניחים את כרית החימום מתחת לגוף העכבר ולשמור על הטמפרטורה ב 36 °C (37 °F) °C (5 °F) נטר את טמפרטורת גוף העכבר באמצעות חיישן טמפרטורה ושלט בטמפרטורת כרית החימום באמצעות אות משוב מחיישן הטמפרטורה.</li>
	<li>לסובב פיסת נייר דקה ומניחים אותה בפתח העכבר כדי למנוע מהנוזל להיכנס קנה הנשימה של העכבר.</li>
	<li>הסר את הרקמה הרטובה מלשון העכבר והניח את μTongue מוכן על לשון העכבר. שים ערוץ microfluidic על הלשון ולהתאים את המיקום שלה כדי לצפות את פני השטח של הלשון דרך חלון ההדמיה.</li>
	<li>אבטחו את ה-μTongue על ידי הברגה עדינה בשני הקצוות בלחץ דחיסה מינימלי.</li>
</ol>4. רכישת הדמיה
<ol><li>הפעל את לייזר 920 ננומטר שני פוטון ואת המיקרוסקופ לפני השימוש.</li>
	<li>הר את המטרה טבילת מים (16x, NA 0.80 או 25x, NA 1.1) על המיקרוסקופ. זרוק את המים המזוקקים על חלון ההדמיה של μTongue ולטבול את המטרה.</li>
	<li>במצב מצלמה, הפעל את האור באמצעות מנורת כספית והאיר את פני הלשון.</li>
	<li>על-ידי התאמת ציר Z, חפשו באות ההפללה האוטומטית מהפיפילה הקליפורמית כדי למצוא את מישור המוקד המשוער. לאחר מכן, באמצעות ידית ההתאמה X ו- Y, אתר בלוטות טעם.</li>
	<li>עבור למצב מולטיפוט. הגדר את תנאי רכישת התמונה כדלקמן: אורך גל עירור: 920 ננומטר; סט מסנני פליטה: 447/60 ננומטר, 525/50 ננומטר ו- 607/70 ננומטר; מצב סריקת רסטר דו-כיווני, גודל מסגרת: 512 x 512.</li>
	<li>כווננו את מיקומי X ו- Y כדי למקם את בלוטות הטעם במרכז חלון התמונה.</li>
	<li>חפש בכלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם בערך בגובה של כשני שלישים של בלוטות הטעם. דמיינו את זרימת הדם על ידי הזרקת TRITC-dextran (500 kDa) מהפרוטוקול שלב 3.2. אם זרימת הדם קבקבים, לשחרר את ברגי תיקון מעט כדי לאפשר זרימת דם.</li>
	<li>התאם את ציר Z ומצא את מישור Z של בלוטות הטעם המכיל מספר מספיק של תאי טעם.</li>
	<li>המשך הדמיית סידן עם 2-6 הרץ עבור 80 s. ספק פתרון טעם של 20 s על ידי הפעלת המאגר של המערכת הנוזלית לאחר תחילת ההדמיה. לאחר 20 s של גירוי טעם, להעביר את המאגר בחזרה לרוק מלאכותי.</li>
	<li>לאחר סיום ההדמיה הריציפה, המתן כ-3-4 דקות מראש למפגש ההדמיה הבא. שמור את הרוק המלאכותי זורם ללשון העכבר כדי לשטוף את המעכב הטעים מפגישת ההדמיה הקודמת. בהתאם לעיצוב הניסוי, חזור על הפגישה כנדרש.</li>
	<li>כאשר הדמיית סידן ויו הושלמה, להרדים את העכבר על פי הליך IACUC. העכבר תחת הרדמה מוקרב בתא CO2. הערה: בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת בוהן. במהלך מפגש הדמיה, רוק מלאכותי מהמאגרים צריך להיות מסופק באופן עקבי. אם בועות מופיעות בחלון ההדמיה של μTongue, להסיר את הבועות על ידי דוחף אותם דרך הקלט או את הפלט של μTongue באמצעות לחץ נוזלי חזק.</li>
</ol>5. ניתוח תמונה (איור 3)
<ol><li>המרת תמונה<ol>
<li>פתח את קבצי התמונה הגולמיים באמצעות פיג'י14 או תוכנת ניתוח תמונה דומה.</li>
		<li>המר את קובץ התמונה לקובץ מחסנית RGB לשימוש בקוד מנתח באד NPL.<ol>
<li>תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים</li>
			<li>
תמונה > צבע > מיזוג ערוצים ובחר את התמונה מהשלב 5.2.1.</li>
			<li>תמונה > צבע > מחסנית ל- RGB</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>רישום תמונה הערה: השתמש בקוד הכתוב בהתאמה אישית לניתוח נתונים. אנא עיינו https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.<ol>
<li>הפעל את הקוד בשם Taste_GUI.m; חלון GUI בשם מנתח ניצני NPL יופיע. לחץ על לחצן ניתוח חדש בפינה השמאלית העליונה ולאחר מכן טען את התמונה המומרת בשלב 5.1. הגדר את קצב הפריימים מעל התמונה שנטענה.</li>
		<li>צייר את אזור העניין (ROI) מעל התמונה שנטענה לרישום. לחץ פעמיים על ההבחז הנבחר והרישום המחושב האוטומטי יתחיל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשיג את השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות היחסית (ΔF/F)<ol>
<li>חזור לחלון מנתח באד NPL כדי להציג את התמונה הרשומה מהשלב 5.2 באופן אוטומטי. אם למשתמש כבר יש קובץ reg, לחץ על לחצן טען נתונים ובחר את הקובץ _reg.tif.</li>
		<li>לחץ על כפתור המעגל או המצולע והצב את ה- ROI של תא הטעם מעל תמונת בלוטות הטעם.</li>
		<li>זה מציג את עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית ואת עקבות הסידן (ΔF/F) של תא הטעם שנבחר באופן אוטומטי מתחת לתמונת בלוטות הטעם.</li>
		<li>לחץ על שמור מעקב כדי להציג את עקבות הסידן (ΔF/F) בצד ימין של GUI, בעוד ROI מוצג על תמונת בלוטות הטעם. חזור על שלבים 5.3.2-5.3.4 עד לסיום בחירת החזר על החזר על ההחזרה. הערה: לחץ על לחצן מחק מעקב אם ה- ROI נבחר בטעות כדי למנוע את עקבות ה- ROI והסידן שנבחרו לאחרונה.</li>
		<li>לאחר סיום בחירת ROI, כתוב את שם הקובץ בפינה השמאלית התחתונה ולחץ על לחצן סיום כדי לייצא את מעקב הסידן ΔF/F כתבנית .xls, ואת תמונת ניצן הבורסה עם ROIs בתבנית .bmp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח עקבות הסידן<ol>
<li>לנתח את עקבות הסידן המתקבלים בשלב 5.3. קחו בחשבון שתאי הטעם הגיבו לטעים כאשר עוצמת הפלואורסצנטיות עולה ביותר משתי סטיות תקן של קו הבסיס לאחר מסירת הטעם4, וערכי pהם פחות מ- 0.01, באמצעות t-testsמזווגים או לא משולמים10.</li>
		<li>שקול את תא הטעם כתא מגיב, אם הוא מגיב לטעם מסוים יותר מפי שניים מתוך שלושה ניסויים (~ 60%)15.</li>
		<li>השג את עקבות הסידן הייצוגיות על ידי ממוצע עקבות סידן בודדות שנרכשו בשלב 5.4.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+microscopy%3A+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li>
<li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Ca2%2B+imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li>
<li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li>
<li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li>
<li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li>
<li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+recruits+aversive+taste+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li>
<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים: ג'יי האן ומ. צ'וי הם ממציאים של טכנולוגיית ה-μTongue המוגנת בפטנט המתוארת במאמר זה, ומערכת ה-μTongue זמינה מסחרית באמצעות SciTech Korea.

מתואר כאן פרוטוקול מפורט כדי להחיל μTongue על החקירה של פעילויות פונקציונליות של תאי טעם ב vivo. בפרוטוקול זה, מתבצעת ההדמיה התפקודית על תאי הטעם באמצעות אינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית. בנוסף לשימוש בעכברים מהונדסים, טעינה אלקטרופורטית של צבעי סידן (או צבעי חישת מתח) על תאי הטעם יכולה להיות אפשרות חלופית.
כל פתרונות הטעם פחות מ 1.336 של אינדקס שבירה שימשו בניסוי זה. למרות μTongue מספק משלוח נוזלי יציב ניתוח יחסמטרי ameliorates חפצים הדמיה, זה יהיה מאתגר עבור החוקרים להשתמש בריכוז גבו...

מיקרוסקופ פלואורסצנטיות תוך-וינטלית נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את הדינמיקה השופעת על רקמות חיות. חוקרים מפתחים במהירות חיישנים מקודדים גנטית המספקים טרנספורמציות ספציפיות ורגישות של התהליכים הביולוגיים לאותות פלואורסצנטיות - אשר ניתן להקליט בקלות באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב1,2. למרות שרוב האיברים הפנימיים במכרסמים נחקרו באמצעות המיקרוסקופ, היישום המוצלח שלה ללשון עדיין לא הצליח3.
מחקרים קודמים על הדמיית סידן של תאי טעם נערכו ex vivo על ידי חתך דק של רקמת לשון כדי לקבל בלוטות טעם להקיף4,5,6 או על ידי קילוף אפיתל הטעם כדי להשיגבלוטות טעםפטרייתיות7,8. הכנת דגימות אלה הייתה פולשנית באופן בלתי נמנע, ולכן המיקרו-סביבה הטבעית כגון פנימיות העצבים, מחסומי החן וזרימת הדם, היו מוטרדות במידה רבה. חלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי הראשון דווח בשנת 2015 על ידי Choi et al., אך הקלטה פונקציונלית אמינה לא הייתה ברת השגה בגלל התנועה וממצאים אופטיים הנגרמים על ידי גירויים טעימים נוזלים9.
לאחרונה, microfluidics-על-לשון (μTongue) הוצג10. התקן זה משלב מערכת מיקרופלואידית עם חלון הדמיה על לשון העכבר. על-ידי השגת זרימה מעין-יציבה-יציבה של גירויים טעימים לאורך כל תקופת ההדמיה, ניתן היה למזער חפצים מתנועה נוזלית (איור 1). יציאת הקלט ניזונה מסדרה של בקרי לחץ רב-ערוציים, בעוד שיציאת הפלט מחוברת למשאבת מזרק, השומרת על 0.3 מ"ל/דקה. בנוסף, ממצאים אופטיים שנגרמו על ידי ההבדל במדדים שבירה של פתרונות טעימים צומצמו על ידי ניתוח יחסי המציג אינדיקטור סידן חסר רגישות (tdTomato) כמו גם מחוון סידן (GCaMP6)11. עיצוב זה סיפק יציבות מיקרוסקופית של תאי טעם ב- vivo אפילו עם מעבר פתאומי בין ערוצים נוזליים. כתוצאה מכך, μTongue ליישם הקרנה פונקציונלית אמינה של tastants מרובים בלוטות הטעם של העכבר ב vivo.
בפרוטוקול זה, ההליכים הניסיוניים מוסברים בפירוט עבור הדמיית סידן של בלוטות הטעם פטריות העכבר ב vivo באמצעות μTongue. ראשית, הכנת רוק מלאכותי ופתרונות טעימים מתוארת. שנית, הקמת המערכת המיקרופלואידית להשגת זרימת מצב מעין-יציבה מוצגת. שלישית, ההליכים המשמשים להרכבה של לשון העכבר על μTongue כדי לאפשר רכישת תמונה הם מתויגים. לבסוף, כל שלב לניתוח תמונה, כולל תיקון של ממצאי תנועה לרוחב ויחס, מצוין. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לכל מעבדת מחקר עם מתקן עכבר ומיקרוסקופ שני פוטון או ציוד שווה ערך.

<table><tbody><tr><td>אצסולפאם K</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>04054-25G</td><td>רוק מלאכותי /</td></tr><tr><td>תמיסת סידן כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>21115-100 מ"ל</td><td>רוק מלאכותי / טסטנט</td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C0759-100G</td><td>רוק מלאכותי / טסטנט</td></tr><tr><td>ציקלוהקסימיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>01810-5G</td><td>רוק מלאכותי / טסטנט</td></tr><tr><td>דנטוניום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D5765-5G</td><td>רוק מלאכותי / טאסטנט</td></tr><tr><td>דבק שיניים</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>הכנת בעלי חיים</td></tr><tr><td>תמונה J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>ניתוח נתונים</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>רוק מלאכותי / טאסטנט</td></tr><tr><td>דבק מיידי</td><td>לוקטיט</td><td>לוקטיט 4161, הנקל</td><td>הכנת בעלי חיים</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>רוק מלאכותי / tastant</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>רוק מלאכותי / tastant</td></tr><tr><td>קטמין</td><td>יוהאן</td><td>קטמין 50</td><td>תכשיר בעלי חיים</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>רוק מלאכותי / tastant</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>מלאכותי רוק / tastant</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>ניתוח נתונים</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>רוק מלאכותי / tastant</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>רוק מלאכותי / tastant</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Mutiphoton</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp; ברגמו II</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>רוק מלאכותי / tastant</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>רוק מלאכותי / tastant</td></tr><tr><td>אובייקט</td><td>ניקון</td><td>N16XLWD-PF</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA מכשירים מדעיים</td><td>OCTAFLOW II</td><td>בקרה נוזלית</td></tr><tr><td>מחשב</td><td></td><td>LG Lg15N54</td> מד PH <td>בקרה נוזלית</td></tr><tr><td></td><td>Thermoscientific</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>רוק מלאכותי / טאסטנט</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>806562</td><td>רוק מלאכותי / כינין טסטנט</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Q1125-5G</td><td>רוק מלאכותי /</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td> טסטנט <td>מכשיר Havard</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>שליטה</td></tr> <tr><td>נוזליתTRITC-dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>הכנה לבעלי חיים</td></tr><tr><td>לייזר סיבים מהיר במיוחד</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>באייר קוריאה</td><td>Rompun</td><td>הכנת בעלי חיים</td></tr></tbody></table>

μtongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- vivo

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות תוך-וינטלית היא כלי המשמש באופן נרחב לחקר דינמיקה רב-תאית בחיה חיה. עם זאת, זה לא נעשה שימוש מוצלח באיבר החושי טעם. על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי, ה- μTongue מספק תמונות פונקציונליות אמינות של תאי טעם ב- vivo תחת חשיפה מבוקרת לטעמים מרובים. במאמר זה מוצג הליך מפורט שלב אחר שלב לשימוש במערכת μTongue. קיימות חמש סעיפים: הכנת פתרונות טעימים, הקמת מודול מיקרופלואידי, הרכבה לדוגמה, רכישת נתוני תמונה פונקציונליים וניתוח נתונים. כמה טיפים וטכניקות כדי לפתור את הבעיות המעשיות שעלולות להתעורר בעת שימוש μTongue מוצגים גם.

עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato שימש להשגת תמונת בלוטות טעם. פני השטח של לשון העכבר היו מכוסים בפפילה פילפורמית אוטופלואורסצנטית. בלוטות הטעם מפוזרות בדלילות על פני הלשון(איור 4A). התמונות של בלוטות הטעם והמבנה שלה נרכשו באמצעות שלושה גלאי מסננים שונים. באמצעות ערכת המסננים 607/70 ננומטר, אות tdTomato מתאי הטעם התקבל לניתוח רצומטרי (איור 4B). באמצעות ערכת המסננים 525/50 ננומטר, אות GCaMP מתאי הטעם וכלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם נרכשו(איור 4B).</...

המאמר מציג את מכשיר μTongue (microfluidics-on-a-tongue) להדמיית תאי טעם פונקציונליים ב- vivo על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיה תוך-וינטלי על הלשון.

μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

פרוטוקול זה מאפשר התבוננות בתפקודים של תאי טעם במיקרו-סביבה טבעית עם קשרים עצביים וזרימת הדם שנותרה ללא פגע. באמצעות טכניקה זו, תקשורת בין תאים יכולה להיחקר ב- vivo. ראשית, מלאו את המאגרים של מערכת זלוף הזרימה בלחץ ברוק מלאכותי ותירסים.חבר את קו האוויר הדחוס לקלט הווסת והגדר את לחץ האוויר במערכת האספקה הנוזלית ל -30 עד 50 פאונד לאינץ 'מרובע. הגדר את לחץ הפלט של הווסת ל 0.4 פאונד לאינץ 'מרובע ולבדוק אם נוזל מתחיל לזרום מהצינור. חבר את הסעפת מהמאגרים ליציאת הכניסה של הלשון הזעירה, ולאחר מכן חבר את יציאת היציאה של הלשון הזעירה למשאבת מזרק ומשוך נוזל בכ -300 מיקרוליטרים לדקה כדי לקבוע מצב יציב.אשר כי נפח הטיפה התלוי מתחת ללשון המיקרו נשאר קבוע ולהתאים את לחץ האוויר ואת קצב הזרימה כדי לקבל את גובה המדגם הרצוי. לאחר שהמערכת המיקרופלואידית הוקמה, נתק את קו האוויר הדחוס וכבה את משאבת המזרק עד שהעכבר הוכן להדמיית ויוו. לאחר מתן הרדמה לעכבר, תוך ורידי להזריק TRITC-dextran דרך מסלול רטרו-מסלולית כדי לצפות במחזור הדם במהלך הדמיה.עם העכבר ממוקם בתנוחת עלון, לרסס 70% אתנול על ראשו. השתמש במלקחיים כדי להרים את עור הראש בקלילות, ולאחר מכן להשתמש במספריים כדי ללגום כשבעה מילימטרים רבועים של העור. לאחר ניקוי השיער סביב הקרקפת, להסיר את periosteum מתחת לעור ולהחיל דבק מיידי על הגולגולת.לאחר מכן צרף את מתקן הראש המותאם אישית. לאחר הדבקה מיידית הוא התקשה, להחיל דבק דנטלי סביב מתקן הראש ולבסס אותו על ידי תאורה עם אור כחול. באמצעות דבק מיידי כדי להדביק את השפה התחתונה של העכבר ליחידה התחתונה של הלשון הזעירה, ואז הניח את העכבר על לוח ההכנה לעכבר ואבטח את היחידה התחתונה בלשון המיקרו לעמודי האחיזה על ידי יישור החורים בקצה הלשון הזעירה עם העמודים.הדק את מתקן ראש העכבר למחזיק מתקן הראש בלוח והתאם את המרחק בין ראש העכבר להתקן. לאחר מכן, באמצעות מחזיק מתקן הראש, סובב את ראש העכבר בצורה חלקה בכ- 45 מעלות. לאחר אבטחת העכבר ללוח, השתמש פינצטה מפלסטיק כדי לצייר את לשונו בעדינות.לאחר מכן, באמצעות דבק מיידי, חבר את הצד הגחון של הלשון לצד העליון של היחידה התחתונה של הלשון הזעירה. כדי לשמור על הלשון לחה, לנגב את פני השטח עם צמר גפן רטוב, ולאחר מכן מניחים חתיכת רקמה ספוגה ברוק מלאכותי על פני השטח החשופים של הלשון. הנח את מכונות הכביסה המעוקלות על העמודים, החזקת החלק התחתון של הלשון הזעירים, ולאחר מכן הזז את הכנת העכבר לשלב המיקרוסקופ.מקם את הלשון החשופה של העכבר מתחת למרכז המשוער של אזור המטרה של המיקרוסקופ, הקפד לא לסטות מהטווח הדינמי של הבמה, ולאחר מכן הדק את הברגים כדי לחבר בחוזקה את לוח העכבר על הבמה. מניח כרית חימום מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה בין 36.5 ל 37.5 מעלות צלזיוס. כדי למנוע מנוזל להיכנס קנה הנשימה של העכבר, הנח פיסת נייר מעוותת דקה בתוך פיו של העכבר, ולאחר מכן הסר את הרקמה הרטובה המונחת על פני הלשון והנח את לשון המיקרו המוכנה על לשון העכבר, כך שפני השטח של הלשון נראים דרך חלון ההדמיה.אבטחו את הלשון הזעירה על ידי עדין של שני הקצוות בלחץ דחיסה מינימלי. כדי להתחיל לרכוש תמונות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ ולאחר מכן הפעל את לייזר 920 ננומטר שני פוטון. הר את המטרה טבילת מים על המיקרוסקופ, ולאחר מכן להוריד את המטרה על חלון ההדמיה של לשון מיקרו ולטבול את המטרה.במצב מצלמה, האר את פני השטח של הלשון על ידי הפעלת האור הכחול מנורת כספית. כדי למצוא את מישור המוקד המשוער, התאם את ציר Z וחפש אות פלואורסצנטיות אוטומטית מהפאפילה הפיליבפורמית. לאחר מכן, בעזרת ידית ההתאמה X ו-Y, אתר בלוטות טעם.עבור למצב ריבוי פוטונים ולאחר מכן הגדר את אורך הגל של העירור, ערכת מסנני הפליטה, מצב הסריקה וגודל המסגרת לרכישת תמונה. כאשר בלוטות הטעם במרכז חלון ההדמיה, אתר את כלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם כשני שלישים מגובה בלוטות הטעם ודמיין את זרימת הדם. אם זרימת הדם סתומה, שחררו מעט את הברגים לתיקון כדי לחדש את זרימת הדם.התאימו את ציר Z כדי למצוא את מישור Z של בלוטות טעם המכילות מספר מספיק של תאי טעם, ולאחר מכן המשיכו עם הדמיית סידן בשתיים עד שש הרץ למשך 80 שניות. לאחר תחילת ההדמיה, יש להפעיל את המאגר של המערכת הנוזלית כדי לספק פתרון טעם למשך 20 שניות. לאחר 20 שניות של גירוי טעם, להעביר את המאגר בחזרה לרוק מלאכותי.במהלך ההדמיה, המתינו כשלוש עד ארבע דקות בין מפגשים המספקים בעקביות רוק מלאכותי כדי לשמור על הלשון לחה ולשטוף את הטעים שנותרו מהפגישה הקודמת. משטח הלשון של עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato מכוסה בפפילה פילפורמית פלואורסצנטית ומופצת בדלילות בלוטות טעם. הפפילה filiform בצהוב נתפסים באמצעות גלאי צילום ב 500 עד 550 ננומטר וניתן לראות מפני השטח של הלשון עד כ 25 מיקרומטר לעומק.אותות GCaMP בירוק שזוהו על ידי מסנן 500 עד 550 ננומטר ואותות tdTomato באדום, שזוהו על ידי מסנן 607 עד 670 ננומטר, מייצגים את תאי הטעם. אות tdTomato מתקבל לניתוח מטרי יחס. כלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם נרכשים באמצעות מסנן 500 עד 550 ננומטר שנקבע ברקמת חיבור הקולגן, התומכת מבחינה מבנית בבלוטות הטעם, נרכש באמצעות ערכת המסננים 447 עד 460 ננומטר.בדוגמה מייצגת זו של הקרנת טעם in-vivo באמצעות הדמיית סידן, כל תא טעם הוא תוחם על ידי קווים מקווקווים. במשפט זה, תא 2 הגיב הן לתמיסות מתוקות והן לתמיסות אומאמי. ותא 3 הגיב לתהלי מלח נמוכים וגבוהים כאחד.אף אחד מהתאים בבלוטות הטעם הזו לא הגיב לטעמים חמוצים. מכיוון שמטרת ניסוי זה היא להתבונן בתפקוד התאים הטעמים בסביבה הטבעית, חשוב להעביר את הפלואורסצנטים לכלי הדם בשלב ההכנה ולאשר את זרימת הדם במהלך הניסוי.

tongue-microfluidics-based-functional-imaging-platform-for-tongue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סקירה מקיפה של טכניקות מעורב ביצירת מודל עכברי של סרטן הפה ניטור כמותי של הפלישה הגידול בתוך הלשון באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון של תאים שכותרתו מוצג. מערכת זו יכולה לשמש פלטפורמה שימושי להערכת יעילות התרופה מולקולרית של תרכובות אנטי פולשנית.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Lensfree טומוגרפיה אופטית היא טכניקה תלת מימדי מיקרוסקופיה המציע רזולוציה מרחבית של &lt;1 מיקרומטר × &lt;1 מיקרומטר × &lt;3 מיקרומטר ב X, Y ו-Z ממדים, בהתאמה, מעל נפח הדמיה גדול של 15-100...

Lensfree על שבב טומוגרפית מיקרוסקופית העסקת רב זווית תאורה פיקסל סופר רזולוציה

אנו מספקים כאן תיאור מפורט של פרוטוקול הניסוי להדמיה עם מערכת אופטואקוסטית (פוטו-אקוסטית) שפותחה לאחרונה להדמיה פונקציונלית ומולקולרית תלת מימדית בזמן אמת. הביצועים העוצמתיים והרבגוניות המוכחים עשויים להגדיר תחומי יישום חדשים של הטכנולוגיה האופטואקוסטית במחקר פרה-קליני ובפרקטיקה הקלינית.

יוניברסל כף היד תלת ממדי Optoacoustic הדמיה בדיקה לרקמות עמוקות אנגיוגרפיה אדם ופונקציונליים פרה-קליניים מחקרים בזמן אמת

מחקר זה התאים בהצלחה שיטות מחקר בליעה וידאופלואורוסקופיות אנושיות (VFSS) לשימוש עם מודלים של מחלות עכברים במטרה להקל על מחקר דיספגיה תרגומית.

התאמת שיטות סנונית Videofluoroscopic אדם מחקר כדי לזהות ולאפיין בליעה במודלי Murine מחלות

ניתן להשתמש בהדמיית אולטרסאונד כדי להציג את הצורה והתנועות של הלשון בזמן אמת במהלך הדיבור. ניתן להשתמש בתמונות כדי לקבוע את אופי שגיאות צליל הדיבור. ניתן להשתמש במשוב חזותי של הלשון כדי להקל על שיפורים בהפקת צליל דיבור באוכלוסיות קליניות.

תמונות אולטרסאונד של הלשון: הדרכה עבור הערכה וטיפול של שגיאות סאונד הדיבור

הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

אנו מתארים הליך כירורגי במודל עכברוש הרדים לקביעת טונוס השרירים ותכונות הלכלוך של הלשון. ההליך כרוך גירוי ספציפי של עצבים hypoglossal ויישום של כוח פסיבי Lissajous / עיוות עיוות לשריר.

בשנת Vivo הערכה של תכונות מכניות ו Viscoelastic של לשון עכברוש

פיתחנו פרוטוקול כללי כדי לנתק כמות גדולה של תאים בודדים באיכות גבוהה מן האפיתל ו mesenchyme / רקמת חיבור של לשונות עכבר עובריות ובוגרות.

ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

איזון יריעת פני השטח של התליון המיושם עם החלפה מרובת תת-פאזות, המכונה OCTOPUS, מאפשר לחקות את תנאי העיכול על ידי החלפת תת-פאזה רציפה של התמיסה המקורית בתפזורת עם נוזלים מדומים במערכת העיכול. העיכול המדומה במבחנה מנוטר על ידי רישום באתרו של המתח הבין-פאזי של השכבה הבין-מרחבית המעוכלת.

במבחנה עיכול תחליבים בטיפה אחת באמצעות החלפה רב-פאזית של נוזלי מערכת העיכול המדומים

מטרת הפרוטוקול היא לספק גישה סטנדרטית להערכה כמותית של שלמות מחסום האפיתל החניכיים בעכברים על ידי יישום מקומי של דקסטרנים מסומנים בפלואורסצנציה בגדלים מולקולריים משתנים על פני החניכיים ב-vivo, ואחריהם הדמיה אקס-ביבו באמצעות מערכת מיקרוסקופיה של פוטון יחיד.

הערכה פונקציונלית של מחסום אפיתל חניכיים בעכברים באמצעות מעקבים פלואורסצנטיים

למד הדמיה פונקציונלית של תאי טעם בלשון חיה באמצעות מערכת µTongue מבוססת מיקרופלואידיקה. שיטה זו מאפשרת מחקר של תקשורת בין-תאית ותגובות לטעמים בתנאים פיזיולוגיים טבעיים.

μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo

גלה סרטונים נוספים