Name: הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: למדו שיטה לחימום מבוקר של ממברנות דו-שכבתיות ממשק טיפה (DIB) לחקר תלות בטמפרטורה. הפרוטוקול מאפשר אפיון חשמלי ואופטי של מעברי פאזה בליפידים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה כספית ניתנה על ידי הקרן הלאומית למדע גרנט CBET-1752197 ומשרד חיל האוויר של מענק מחקר מדעי FA9550-19-1-0213.

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

הפרוטוקול המתואר בזאת מספק הוראות להרכבה ותפעול של מערכת ניסיונית לשליטה בטמפרטורת השמן והטיפות המשמשות ליצירת DIBs. זה מועיל במיוחד עבור הפעלת היווצרות DIB באמצעות שומנים כי יש טמפרטורות נמס מעל RT. יתר על כן, על ידי שינוי מדויק של הטמפרטורה של מאגר הנפט, טמפרטורת bilayer ניתן לתפעל כדי ללמוד את ההשפעות של טמפרטורות גבוהות על תכונות ממברנה שונות ומאפיינים, כולל קיבוליות, אזור, עובי, שינויים תרמוטרופיים המושרה שלב, קינטיקה של מינים פעילים קרום, ואת האנרגטיקה של הידבקות של ממשק bilayer37,</sup...

ממברנות הסלולר הן מחסומים חדירים באופן סלקטיבי המורכבים מאלפי סוגי שומנים1, חלבונים, פחמימות וטרולים העוטפים ומחלקים את כל התאים החיים. הבנת האופן שבו הרכביהם משפיעים על תפקודיהם וחושפים כיצד מולקולות טבעיות וסינתטיות מתקשרות, דבקות, משבשות ומשתנות קרום תאי, ולכן תחומי מחקר חשובים בעלי השלכות רחבות היקף בביולוגיה, רפואה, כימיה, פיזיקה והנדסת חומרים.
מטרות אלה לגילוי נהנות ישירות מטכניקות מוכחות להרכבה, מניפולציה ולימוד של ממברנות מודל – כולל ביליאריות שומנים המורכבות משומנים סינתטיים או טבעיים – המחקות את ההרכב, המבנה ותכונות ההובלה של מקביליהם התאיים. בשנים האחרונות, ממשק טיפה bilayer (DIB) שיטה2,3,4 לבניית bilayer השומנים מישורי בין טיפות מים מצופות שומנים בשמן קיבל תשומת לב משמעותית 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, והפגין יתרונות מעשיים על פני גישות אחרות עבור היווצרות קרום מודל: שיטת DIB היא פשוטה לביצוע, לא דורש ייצור או הכנה מתוחכמים (למשל, "ציור") של מצע לתמיכה בקרום, מניב באופן עקבי ממברנות עם מעולה אריכות ימים, מאפשר מדידות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות, ומפשט את היווצרותם של קרום מודל עם קומפוזיציות עלון אסימטרי3. מכיוון שהדו-שכבה נוצרת באופן ספונטני בין טיפות וכל טיפה יכולה להיות מותאמת במיקום ובאיפור, טכניקת DIB משכה גם עניין רב בפיתוח מערכות חומר בהשראת תאים המתבססות על שימוש בקרומים מגיביםלגירויים 18,24,25,26,27,28,29,מידור מאוזן והובלה14,30,31, וחומרים דמויירקמות 17,23,32,33,34,35,36.
רוב הניסויים שפורסמו על קרום המודל, כולל אלה עם DIBs, בוצעו בטמפרטורת החדר (RT, ~ 20-25 מעלות צלזיוס) ועם קומץ שומנים סינתטיים (למשל, DOPC, DPhPC, וכו '). תרגול זה מגביל את היקף השאלות הביופיזיות שניתן ללמוד בקרומי מודל, ובהתבסס על התבוננות, הוא יכול גם להגביל את סוגי השומנים שניתן להשתמש בהם להרכבת DIBs. לדוגמה, שומנים סינתטיים כגון DPPC, אשר יש טמפרטורת התכה של 42 °C (69 °F), אינו להרכיב monolayers ארוז היטב או טופס DIBs ב RT37. היווצרות DIB בטמפרטורת החדר הוכיחה גם קשה עבור תמציות טבעיות, כגון אלה מיונקים (למשל, תמצית השומנים הכוללת במוח, BTLE)38 או חיידקים (למשל, תמצית השומנים הכוללת Escherichia coli, ETLE)37, אשר מכילים סוגים רבים ושונים של שומנים ומקורם תאים המתגוררים בטמפרטורות גבוהות (37 °C (37 °F). מתן אפשרות ללמוד קומפוזיציות מגוונות ובכך מספק הזדמנויות להבנת תהליכים בתיווך ממברנה בתנאים רלוונטיים ביולוגית.
העלאת הטמפרטורה של השמן יכולה לשרת שתי מטרות: זה מגביר את הקינטיקה של הרכבה monolayer וזה יכול לגרום שומנים לעבור מעבר נמס להגיע לשלב מופרע נוזלי. שתי ההשלכות מסייעות בהרכבה חד שכבתית39, דרישה מוקדמת עבור DIB. בנוסף לחימום להיווצרות bilayer, קירור הממברנה לאחר היווצרות יכול לשמש כדי לזהות מעברים תרמוטרופיים bilayers השומנים יחיד38, כולל אלה תערובות השומנים הטבעיות (למשל, BTLE) זה יכול להיות קשה לזהות באמצעות קלורימטריה. מלבד הערכת מעברים תרמוטרופיים של שומנים, דווקא שינוי הטמפרטורה של DIB יכול לשמש כדי לחקור שינויים הנגרמים על ידי טמפרטורה במבנה קרום38 ולבחון כיצד הרכב השומנים ונזילות להשפיע על קינטיקה של מינים פעילים קרום (למשל, פפטידים יוצרי נקבוביות וחלבונים transmembrane37), כולל קרום מודל יונקים וחיידקים בטמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס).
להלן, תיאור של כיצד להרכיב מאגר שמן DIB שונה ולהפעיל בקר משוב טמפרטורה כדי לאפשר הרכבה monolayer היווצרות bilayer בטמפרטורות גבוהות יותר RT יוסבר. בהבדיל מפרוטוקול40הקודם , נכלל פרט מפורש לגבי שילוב המכשור הדרוש למדידה ובקרה של הטמפרטורה במקביל להרכבה ואפיון של ה- DIB במאגר הנפט. ההליך יאפשר למשתמש ליישם שיטה זו לגיבוש ולימוד DIBs על פני מגוון טמפרטורות במגוון הקשרים מדעיים. יתר על כן, התוצאות הייצוגיות מספקות דוגמאות ספציפיות לסוגי השינויים הניתנים מדידה הן במבנה הממברנה והן בהובלת היונים שיכולים להתרחש מכיוון שהטמפרטורה מגוונת. טכניקות אלה הן תוספות חשובות למחקרים הביופיזיים הרבים שניתן לתכנן ולבצע ביעילות ב- DIBs, כולל לימוד הקינטיקה של מינים פעילים בקרום בהרכבי קרום שונים.

<table><tbody><tr><td>25 מ"מ x 40 מ"מ x 1 מ"מ גומי מבודד (x2)</td> <td>כל</td><td></td><td>מבודד את החלק התחתון של מתקן האלומיניום משלב המיקרוסקופ</td></tr><tr><td>25 מ"מ x 40 מ"מ x 6 מ"מ גומי מבודד (x2)</td> <td>כל</td><td></td><td>מגן על גופי החימום מפני נזק על ידי מהדקי שלב המיקרוסקופ ומבודד את החלק העליון של גופי החימום.</td></tr><tr><td>3-(N-מורפולינו) חומצה פרופנסולפונית&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3183</td><td>חומר חציצה לתמיסת שומנים</td></tr><tr><td>מצע אקרילי</td><td>מיוצר בבית</td><td>HTD_STG_2</td> <td>~ 1000 uL באר אקרילית עם פרופיל חיצוני poka-yoke לתיקון כיוון</td></tr><tr><td>מתקן אלומיניום</td><td>מיוצר בבית</td><td>HTD_STG_1</td><td>מתקן בסיס עם באר שמן המחזיקה את המתקן האצילי וכולל שתי רפידות שטוחות הצמודות לבאר הנפט לגופי החימום&nbsp;</td></tr><tr><td>תמצית שומנים כוללת למוח</td><td>Avanti</td><td>131101C-100 מ"ג</td><td>25 מ"ג/מ"ל תמצית שומנים חזיריים&nbsp;</td></tr><tr><td>מארז DAQ קומפקטי (cDAQ)</td><td>מכשירים לאומיים&nbsp;</td><td>cDAQ-9174&nbsp;</td><td>מארז המכיל סוגים מרובים של מודולי מדידת חיישנים או פלט</td></tr><tr><td>מערכת איסוף נתונים (DAQ)</td><td>התקנים מולקולריים&nbsp;</td><td>דיגידאטה 1440A&nbsp;</td><td>ממיר אנלוגי לדיגיטלי ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>מגבר/ספק כוח</td><td>Hewlitt Packard</td><td>HP 6826A</td><td>מגביר את פלט מתח DC ממודול פלט המתח</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>Slip Corning</td><td>CLS284525</td><td>אוטם את תחתית בסיס האלומיניום ומאפשר אפיון אופטי של גוף החימום הדו-שכבתי</td></tr><tr><td>(x2)</td><td>Omega</td><td>KHLV-101/5</td><td>25 מ"מ x 25 מ"מ סרט פולימיד גוף חימום קפטון עם מגבלת הספק של 5 וואט.&nbsp;</td></tr><tr><td>בורג נירוסטה M3</td><td>McMaster Carr</td><td>90116A150</td><td>מאבטח צמד תרמי למתקן אלומיניום</td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>התקנים מולקולריים&nbsp;</td><td>AxoPatch 200B&nbsp;</td><td>מודד זרם ויציאות מתח לראש הבמה</td></tr><tr><td>מחשב אישי</td><td>כל</td><td></td><td>מחשב עם יציאות USB מרובות במהירות גבוהה ומינימום של 6 ג'יגה-בייט של זיכרון RAM</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3911</td><td>תמיסת אלקטרוליטים של יונים מנותקים</td></tr><tr><td>מודול קלט טמפרטורה מכשירים</td><td>לאומיים&nbsp;</td><td>NI 9211</td><td>מאפשר מדידות צמד תרמי צומת פתוח וקר עבור שלדת cDAQ</td></tr><tr><td>צמד תרמי</td><td>אומגה</td><td>JMTSS-020U-6&nbsp;</td><td>צמד תרמי מסוג U בקוטר 0.02 אינץ' ואורך 6 אינץ'</td></tr><tr><td>דבק הניתן לריפוי UV</td><td>Loctite</td><td>19739</td><td>מאבטח את כיסוי הזכוכית למתקן בסיס אלומיניום</td></tr><tr><td>מודול פלט מתח</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>NI 9263</td><td>מודול פלט מתח אנלוגי לשימוש עם שלדת cDAQ</td></tr><tr><td>מחולל צורות גל</td><td>Agilent</td><td>33210A&nbsp;</td><td>משמש ליציאת צורת-גל סינוסואידית של 10 mV 10 הרץ</td></tr></tbody></table>

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של bilayer ממשק טיפה

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

שיטת bilayer ממשק טיפה (DIB) להרכבת bilayers השומנים (כלומר, DIBs) בין טיפות מימיות מצופות שומנים בשמן מציע יתרונות מרכזיים לעומת שיטות אחרות: DIBs הם יציבים ולעתים קרובות לאורך זמן, אזור bilayer ניתן לכוונן באופן הפיך, אסימטריה עלון נשלטת בקלות באמצעות קומפוזיציות טיפה, רשתות כמו רקמות של bilayers ניתן להשיג על ידי הסמוך טיפות רבות. יצירת DIBs דורש הרכבה ספונטנית של שומנים לתוך monolayers השומנים בצפיפות גבוהה על פני השטח של טיפות. בעוד זה קורה בקלות בטמפרטורת החדר עבור שומנים סינתטיים נפוצים, monolayer מספיק או bilayer יציב אינו מצליח להיווצר בתנאים דומים עבור שומנים עם נקודות התכה מעל טמפרטורת החדר, כולל כמה תמציות שומנים הסלולר. התנהגות זו הגבילה ככל הנראה את ההרכבים – ואולי גם את הרלוונטיות הביולוגית – של DIBs במחקרי קרום מודל. כדי לטפל בבעיה זו, פרוטוקול ניסיוני מוצג כדי לחמם בזהירות את מאגר הנפט המארח טיפות DIB ולאפיין את ההשפעות של הטמפרטורה על קרום השומנים. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש גוף אלומיניום מוליך תרמית ואלמנטים חימום התנגדותי נשלט על ידי לולאת משוב לרשום טמפרטורות גבוהות, אשר משפר הרכבה monolayer היווצרות bilayer עבור קבוצה רחבה יותר של סוגי שומנים. מאפיינים מבניים של הממברנה, כמו גם את המעברים שלב תרמוטרופי של השומנים המרכיבים את bilayer, הם מכמתים על ידי מדידת השינויים קיבוליות חשמלית של DIB. יחד, הליך זה יכול לסייע בהערכת תופעות ביופיזיות בקרומי מודל על פני טמפרטורות שונות, כולל קביעת טמפרטורת התכה יעילה (TM) עבור תערובות שומנים רב רכיבים. יכולת זו תאפשר כך שכפול קרוב יותר של מעברי פאזה טבעיים בקרומי מודל ותעודד היווצרות ושימוש בקרומי מודל ממגוון רחב יותר של מרכיבי קרום, כולל אלה הלוכדים טוב יותר את ההטרוגניות של עמיתיהם התאיים.

איור 1 מראה כיצד גוף האלומיניום ומאגר הנפט האקרילי מוכנים על במת המיקרוסקופ להיווצרות DIB. שלבי ההרכבה 1.2-1.4 משמשים לבידוד תרמי של המתקן מהבמה לחימום יעיל יותר. שלבים 1.5-1.7 מראים כיצד לחבר כראוי את התרמופול למתקן ולמקם את מאגר הנפט, וצעדים 1.8-1.9 מראים מיקומים מומלצים לחלוקת שמן לחתיכות אלה.
איור 2 מתאר את הרכיבים המשמשים ליצירת בקרת טמפרטורת משוב ולביצוע מדידות חשמליות ב- DIB: מחשב, מגבר כוח להגברה קבועה, מגבר מהדק תיקון ומערכת ...

פרוטוקול זה מפרט את השימוש במערכת חימום מבוקרת טמפרטורת משוב כדי לקדם הרכבה מונולאייר השומנים ואת היווצרות bilayer ממשק טיפה עבור שומנים עם טמפרטורות התכה גבוהות, ומדידות קיבוליות לאפיון שינויים מונחי טמפרטורה בקרום.

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחמם במדויק bilayer ממשק טיפה, או DIB, קרום מודל, המאפשר לחקור מגוון רחב של השפעות הקשורות לטמפרטורה המתרחשות בסביבות הסלולר. יתרון הליבה נובע מהיכולת למדוד ולשלוט באופן מקומי בטמפרטורת האמבטיה במאגר בנפח נמוך מבלי לחסום את הגישה לאפיונים החשמליים או האופטיים של ה- DIB. היכולת לחמם במדויק את אמבט הנוזלים פותחת את האפשרות לחקור את תכונות ההובלה והאיתות ב- DIBs שנוצרו ממגוון רחב בהרבה של מרכיבי קרום, כולל תמציות תאיות טבעיות.זהו פרוטוקול רב-שלבי הממנף ציוד מרובה שיש לעקוב אחריו מקרוב כדי להשיג דיוק ניסיוני מספיק, ולכן ניתן להבהיר כל עמימות בתהליך הכתוב באמצעות הדגמה חזותית. כדי להתחיל לאסוף שתי חתיכות של גומי בידוד עבה מילימטר אחד גזוז ל 25 על ידי 40 מילימטרים אורך, שתי חתיכות של גומי עבה שישה מילימטר כי הם גם 25 על ידי 40 מילימטרים, מכלול מתקן בסיס אלומיניום מוכן, מאגר שמן אקרילי שמתאים לחלון הצפייה של גוף בסיס אלומיניום. מניחים את חתיכות הגומי הדקות יותר על במת המיקרוסקופ כך שהקצה הארוך של כל חתיכה משיק לפתיחת הבמה.מקם את גוף בסיס האלומיניום על גבי רפידות הבידוד עם חלון הצפייה של המתקן ממורכז מעל העדשה האובייקטיבית. מניחים חתיכת גומי עבה יותר על גבי כל גוף חימום התנגדותי, ולאחר מכן להשתמש קליפ שלב מיקרוסקופ להחזיק אותו במקום כדי להגן על אלמנטים חימום מפני נזק שנגרם על ידי מהדקי הבמה כדי לבודד מפני קצר חשמלי מקרי. בזהירות לכופף את קצה המדידה של thermocouple כדי להשיג זווית של 90 מעלות ב כארבעה מילימטרים מהסוף.הכנס את הקצה הכפוף של התרמופול לפינה השמאלית התחתונה של גוף האלומיניום ואבטח אותו בעדינות באמצעות בורג נעילה. מניחים את המאגר האקרילי בבאר של מתקן האלומיניום לפני הוספת שמן הקסדקאן לבאר של גוף האלומיניום כדי למזער את הסיכון של לכידת בועות אוויר בין חלון הצפייה לתחתית המאגר האקרילי. לוותר על 1, 000 microliters של שמן הקסדקאן לתוך הבאר של מתקן אלומיניום כדי לספק שטח פנים מקסימלי להעברת חום להתרחש תוך מתן שמן לשפוך על הקצוות של המתקן על שלב מיקרוסקופ או עדשה אובייקטיבית.מחלקים כ-1,000 מיקרוליטרים של שמן הקסדקאן לתוך המאגר האקרילי מבלי למלא אותו יתר על הערך. למדוד את הקיבוליות הנומינלית של הממברנה תוך הורדת הטמפרטורה של אמבט השמן מנקודת סט המאפשר היווצרות bilayer לזהות מעברי שלב תרמוטרופי של השומנים בקרום. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על גרף הטמפרטורה ב- GUI ונקה את נתוני התצוגה כדי להבטיח ששטח מספיק במאגר יהיה זמין להקלטות הבאות.באמצעות מחולל צורת הגל המחובר למגבר מהדק התיקון, החל צורת גל מתח משולש על פני bilayer ממשק טיפה, או DIB, אלקטרודות ולתעד את התגובה הנוכחית המושרה דרך bilayer. מצננים את הדו-שכבתית על ידי הפחתת טמפרטורת הנקודות במרווחים של חמש מעלות, וממתינים לפחות חמש דקות בטמפרטורת המצב היציב החדשה בין שינויי הטמפרטורה עד להשגת הטמפרטורה הרצויה. לאחר אמבט השמן וקירור הדו-שכבתי לטמפרטורת המינימום הרצויה, לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני על גרף הטמפרטורה ב- GUI וייצא את נתוני הטמפרטורה לעומת הזמן לתוכנת גיליון אלקטרוני.הפסק את ההקלטה הנוכחית. מהזרם הנמדד, חשב את התפקוד הנומינלי של התגובה הנוכחית של הגל המרובע לעומת הזמן במהלך תקופת הקירור. עלילה קיבוליות נומינלית לעומת טמפרטורה כדי לבחון כיצד קיבוליות קרום השתנה, ולאחר מכן לאתר שינויים שאינם מונוטוניים קיבוליות לעומת טמפרטורה כדי לזהות טמפרטורת התכה.באופן דומה, להעריך את קיבוליות סטטית ספציפית מעין של bilayer בטמפרטורות קבועות על ידי הגדלה רצופה של הטמפרטורה של אמבט השמן ואת אזור bilayer. שנה את טמפרטורת הנקודה במרווחים של 10 מעלות צלזיוס באמצעות ממשק המשתמש הגרפי ואפשר למערכת להשתוות לטמפרטורה החדשה. בצע שלבים שתוארו קודם לכן כדי ליזום מדידה של זרם והקלטה קיבוליים.שנה את אזור הדו-שכבתי על-ידי כוונון קפדני של מיקומי האלקטרודות באמצעות המניפולטורים הזעירים. אפשר לזרם הגל המרובע להגיע משרעת מצב יציב ולאסוף תמונות של DIB כדי לאפשר חישוב של אזור קרום לעומת זמן. השתמש במצלמה המותקנת על המיקרוסקופ כדי לדמות את הדו-שכבתי כפי שניתן לראות מהצמצם.הוסף בו-זמנית תגית דיגיטלית לתוכנת ההקלטה הנוכחית כדי לסמן את נקודת הזמן המתאימה לאיסוף תמונות. השג בסך הכל חמש תמונות DIB ואזורים במצב יציב של זרם דו-שכבתי, ולאחר מכן אפס את הטמפרטורה וחזור על ההדמיה. נתח את ההקלטות הנוכחיות ואת תמונות DIB בנקודות הזמן המתויגות המתאימות לאזורי bilayer במצב יציב, חילוץ קיבוליות bilayer ואזור עבור כל טמפרטורה.תכנן קיבוליות לעומת אזור עבור כל טמפרטורה וחישב את השיפוע של רגרסיה מסדר ראשון, המייצג את היבול הספציפי של הדו-שכבתי בכל טמפרטורה. ואז להתוות ערכים של קיבוליות ספציפית לעומת הטמפרטורות המתאימות שלהם. בדוק את ההיבול הספציפי לעומת נתוני טמפרטורה עבור וריאציות לא מונוטוניות לזיהוי טמפרטורות נמסות.להעריך את הדינמיקה של היווצרות ערוץ יון תלוי מתח על ידי יצירת קלט שלב מתח DC על פני bilayer. הגדר מתח התחלתי לערך הצעד הרצוי במילי-וולט ולמתח הסופי ולגודל הצעד לערך גבוה יותר מהשלב הרצוי. הגדר משך זמן רצוי עבור קלט השלב בשניות ולאחר מכן בחר את הקוטביות הרצויה עבור קלט השלב.החלף את מגבר מלחצי התיקון כדי לשלוח את מתח הפקודה שמקורו בתצוגת מעבדה או מודול יציאת מתח לשלב הראש, הפעל את המתח והקלט את תגובת הזרם המושרה, שאמורה לעכב תגובה בצורת S למתח קריטי. השג בנפרד קשרי מתח זרם דינמיים עבור קרום בטמפרטורות הרצויות כדי לחשוף קשרים תלויי מתח כגון התנהגויות ערוץ היון. החלף את מגבר המהדק של התיקון כדי לשלוח את מתח הפקודה שמקורו במחולל צורת הגל לשלב הראש וליזום הקלטות זרם.במחולל צורת הגל, פלט צורת גל סינוסואידית רציפה עם משרעת, היסט ותדירות רצויים. רשום את התגובה הנוכחית המושרה על-פני מחזור אחד או יותר וחזור על הפעולה הרצויה עבור משרעת, תדרים וטמפרטורות שונות של גלי סינוס. מערכת בקרת הטמפרטורה שימשה כדי להציג את התלות בטמפרטורה של DIB שנוצר תמצית השומנים הכולל במוח, או BTLE, שומנים.מדידות של זרם קיבולי וטמפרטורה לעומת זמן מוצגות במהלך מחזור חימום מטמפרטורת החדר לכ-60 מעלות צלזיוס. תועדו שינויים בקיבוליות הנומינלית לעומת הטמפרטורה במחזור קירור/חימום שלם אחד, לאחר היווצרות דו-שכבתית ראשונית בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. מדידות מעין סטטיות של קיבוליות ספציפית בטמפרטורות שונות יכולות לשמש לזיהוי טמפרטורת המסת שומנים.קיבוליות התוויית קוטלת לעומת אזור דו-שכבתי מאפשרת רגרסיה ליניארית, כאשר השיפוע מייצג את הערך של קיבוליות ספציפית. תמונת DIB מראה כי כאשר הטמפרטורה היא מתחת לטמפרטורת ההיתוך, הממברנה מאמצת מצב דבק מאוד, אפילו תחת מתח מטיפות מתוחות הנגרמות על ידי אלקטרודות מופרדות היטב. עקבות הזרם לעומת המתח שהוצגו התקבלו על ידי החלת מתחי קרום סינוסואידיים, מדידת הזרם המושרה בשתי טמפרטורות שונות.החצים והמספרים הבאים מסייעים בהדמיה של רבעים רצופים של המתח הסינוסואידי ביחס לזמן. צפיפות הזרם הנמדדת לקרום BTLE מסומם monazomycin באותה רמת מתח ושתי טמפרטורות שונות מוצג כאן. זה חיוני כדי לוותר על שמן הקסדקאן לתוך הבאר של מתקן אלומיניום כראוי.אם זה נעשה מתוך רצף או לא בזהירות, בועות אוויר ייווצרו תחת באר אקריליק, אשר יחסום את התצוגה מלמטה למעלה של DIB. המשתמש חייב גם לזכור לנקות את מאגר הנתונים בתוכנת בקרת הטמפרטורה לפני כל מדידה כדי להבטיח הקלטה מלאה. הליך זה מאפשר אפיון ממברנות ביומימטיות על פני מגוון של טמפרטורות, אשר יש צורך ללמוד תלות בטמפרטורה של מבנה קרום ותחבורה.בנוסף, יכולת זו יכולה לשמש כדי לחשוף השפעות ננומטריות של מינים פעילים קרום אחרים, כגון תעלות יון ביולוגי ננו מהונדסים.

temperature-controlled-assembly-characterization-droplet-interface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

ההרכבה והמיקום של הציר המיטוטי תלויים בכוחות המשולבים הנוצרים על ידי דינמיקת מיקרו-צינורות, חלבונים מוטוריים ומקשרים צולבים. כאן אנו מציגים את השיטות שפותחו לאחרונה בהן הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה כדוריות משמשת לבנייה מחדש מלמטה למעלה של צירים מיטוטיים בסיסיים.

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

כאן, אנו מציגים עבור היווצרות ליפיד bilayers באמצעות שיטת bilayer בועה קשר פרוטוקול. בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני, לפיה טפט נוצר ב הממשק מים-שמן. פיפטות שני יפגעו כדי לעגן את הבועות כדי ליצור bilayer.

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא להכין מעל 1,000,000 הורה, אחיד, יציב, ותואם ביולוגי טיפות של ליטר על 1 ס מ2 מצע מישורי שניתן להשתמש בו עבור סינתזה של חלבון תא ללא.

מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד

אנו מדווחים על פרוטוקול לייצור קרום שומנים היברידי בממשק המים/אוויר על ידי סימום ביטל השימנים עם נחושת (II) 2,9,16,23-טטרה-אטרה-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) מולקולות. קרום שומנים היברידית וכתוצאה מכך יש מבנה כריך שומנים/CuPc/שומנים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על היווצרות של ננו-חומרים פונקציונליים אחרים.

הרכבה עצמית של קרום שומנים היברידי מסוממים עם מולקולות אורגניות הידרופוביות בממשק מים/אוויר

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

הייצור של התקן דו-שכבתי מבוסס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) לייצור ספריות קומבינטוריות בתחליבים של מים בשמן (תקעים) מוצג כאן. החומרה והתוכנה הדרושים לאוטומציה של ייצור תקעים מפורטים בפרוטוקול, ומודגם גם ייצור ספרייה כמותית של תקעים פלואורסצנטיים.

התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי לייצור תקע קומבינטורי

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

למדו שיטה לחימום מבוקר של ממברנות דו-שכבתיות ממשק טיפה (DIB) לחקר תלות בטמפרטורה. הפרוטוקול מאפשר אפיון חשמלי ואופטי של מעברי פאזה בליפידים ביולוגיים.

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה

גלה סרטונים נוספים