Name: פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למד פרוטוקול להכנת קריסטלים מקרומולקולריים בטמפרטורה קריוגנית והעברתם לסביבת ואקום לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בקו קרן I23 במקור אור יהלום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאדם טיילור, אדם פרסקוט, קן ג'ונס, ארווינדר פלאהה וקווין וילקינסון על תמיכתם בפיתוח מערכת העברת הדגמים הקריוגנית (CTS). עבודה זו מומנה על ידי iNEXT-Discovery (גרנט 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.

1. קצירת קריסטל
הערה: השתמש בציוד מגן אישי מתאים: משקפי מגן וכפפות, במידת האפשר.
<ol><li>לאחר שה-SHs מגיעים למעבדת המשתמשים ב-combipucks (איור 3C), מפרידים את המכסה מבסיס המסרק כך שה-SHs יישארו מחוברים לבסיס, ובקבוקונים יישמרו במכסה.</li>
	<li>יש לטבול את המכסה בבקבוקונים בחנקן נוזלי. חברו מתאם SH + (איור 3B, מימין) לשרביט מגנטי, וקצור גבישים כרגיל.</li>
	<li>קירור פלאש כל מדגם ישירות לתוך combipuck, מה שהופך את ההערות של מיקום המדגם. כדי לסגור את הדיסקית, השתמש בשרביט דיסקית כדי לחבר את הבסיס למכסה.</li>
	<li>מעבירים את המסרק מחנקן נוזלי לשולח היבש או לאחסון חנקן נוזלי. שלח את השולח היבש אל דיאמונד (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. העברה מדגמית לוואקום
<ol><li>טעינת SH מ- combipuck לבלוק ההעברה<ol>
<li>הניחו את בסיס דיסקית הבלוק (איור 3H) שכבר מאוכלסת בבלוקי העברה ריקים (איור 3D) על בסיס התמיכה שלה בתוך החנקן הנוזלי במיכל קצף (איור 3J-b). הערה: הכיוון של בלוקי ההעברה חשוב לדיוק של העברת מדגם בתוך כלי הוואקום. ככזה, יש למקם את הבלוקים על בסיס דיסקית הבלוק ולוודא שהסיכה המסומנת בחץ באיור 3D נמצאת בצד שמאל של הבלוק.</li>
		<li>מניחים את דיסקית הבקבוקון במיכל הקצף המלא בחנקן נוזלי, ומוודאים שבסיס הדיסקית מאובטח למחזיק המגנטי בתוך מיכל הקצף (איור 3J-a).</li>
		<li>מצננים מראש את כל הכלים הדרושים בחנקן נוזלי. השתמשו בכלי מפריד הדיסקיות המוצג באיור 3G בהגדרה הגבוהה H כדי להפריד את המכסה מהבסיס, כך שהבסיס יישאר מחובר למחזיק המגנטי וה-SHs ייחשפו בתוך החנקן הנוזלי.</li>
		<li>כדי להסיר כל SH מהמתאם שלו, השתמשו בשרביט המפריד (איור 3F) כדי לאסוף את ה-SH מבסיס המסרק, והמקמו במיקום המתאים של בלוק ההעברה במיקום האופקי של הקרוסלה באיור 3J-b.<ol>
<li>הנח את שרביט המפריד מעל מתאם SH + ככל שהוא יכול ללכת למטה, לוודא את השרביט הוא אנכי, כדי למנוע נגיעה במדגם.</li>
			<li>הזז את הידית הקטנה על שרביט המפריד כלפי מטה עם האגודל עד שהוא לוחץ, כדי לאבטח את SH בפנים ולמשוך את SH מן המתאם.</li>
			<li>הורידו את המפריד מעל תנוחת הבלוק הרצויה, וודאו שאחת משלוש השיניים מתאימה לחור המרכזי של הבלוק.</li>
			<li>שחרר את ה- SH על-ידי הזזת הידית למעלה. חזור על שלבים אלה עבור כל SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לטעינת דוגמאות לבלוק הדגימה הבא, השתמשו בכלי מקש הקרוסלה (איור 3E) כדי לסובב בלוק ריק למיקום האופקי.</li>
		<li>חברו את הכלי מפריד הדיסקית המוצג באיור 3G באמצעות ההגדרה הנמוכה L למכסה דיסקית הבלוק על ידי הברגה בכיוון השעון.</li>
		<li>לאחר העברת כל ה-SHs, כדי לסגור את דיסקית הבלוק, הניחו את המכסה בחנקן נוזלי והמתינו שהטמפרטורה תשתווה, ואז התאימו את המכסה מעל הבסיס כמו באיור 3I. כאשר כלי ההפרדה מחובר, הרימו בעדינות כדי לשחרר מהקרוסלה.</li>
		<li>בשלב זה, ניתן להעביר את דיסקית הבלוק ל-CTS (איור 4B) או לאחסון חנקן נוזלי.</li>
	</ol></li>
	<li>טעינת בלוקי העברה לתוך כלי הוואקום<ol><li>ודא שהמעבורת מחוברת בבטחה לתחנה. פתח את גז החנקן ושסתומי האוויר, וודא שהגזים זורמים. תדליק את הסי.טי.טי.</li>
		<li>אם לא ניכרות הודעות אזהרה בתצוגה, המשיכו בקירור האמבטיה והמעבורת עם חנקן נוזלי. מניחים את המשפך שסופק ביציאת המילוי על המעבורת, ויוצקים לאט לאט חנקן נוזלי לתוך המשפך תוך ניטור הרמה על המסך. עצור כאשר המחוון הופך מאדום לכחול. הערה: המעבורת מוכנה לשימוש כאשר טמפרטורת המושב הקר המוצגת במסך המגע היא מתחת ל- 100 K. ניתן למלא את אמבט התחנה לדוגמה בו זמנית באמצעות המשפך הנכון לרמה המסומנת על קיר האמבטיה או 100% בתצוגת רמת החנקן הנוזלי. רמות החנקן הנוזלי וחיישני הטמפרטורה צריכים להיות מנוטרים כל הזמן לאורך כל הפעולה; יידרשו מספר שכיבות סמיכה.</li>
		<li>ברגע שטמפרטורת המושב הקרה של המעבורת נמוכה מ-100 אלף ורמות החנקן הנוזליות במעבורת ובאמבטיה מתייצבות, העבירו דיסקית בלוק מחנקן נוזלי לאמבטיית CTS באמצעות כלי הפרדת הדיסקוס המצורף. הסר את המכסה של דיסקית הבלוק, ולסגור את המכסה של אמבט CTS.</li>
		<li>כדי להציג בלוק לתוך המעבורת, לפתוח את שסתום CTS, אם לא כבר פתוח, על ידי לחיצה על כפתור שסתום הסעות פתוח בתצוגה. פתחו את ידית המעבורת על ידי סיבוב של 90° בכיוון השעון, וקידום אותה לכיוון האמבטיה כך שהמסלול המודרך על הידית יאכוף את הנתיב הנכון של הנסיעה לכיוון האמבטיה. ברגע שכיסוי הבלוק נראה בתוך האמבטיה, אפשר לכיסוי להתקרר. לאחר מבעבע של חנקן נוזלי סביב הכיסוי נעצר, להתקדם לבלוק ההעברה.</li>
		<li>כדי לנעול את בלוק ההעברה על המעבורת, סובב את הידית 180° בכיוון השעון.</li>
		<li>משוך את נקודת האחיזה למיקום האחורי המקורי ולאחר מכן 'נעל' אותה במקומה על-ידי סיבוב של 90° נגד כיוון השעון.</li>
		<li>לחץ על סגור שסתום הסעות & משאבה במסך התצוגה כדי להתחיל בפינוי המעבורת.</li>
		<li>לאחר שהמסר ש-Shuttle מוכן להתנתק מוצג במסך המגע, לחץ על הידית שמתחת למעבורת והרם אותה בזהירות באמצעות הידית בחלק העליון.</li>
		<li>סעו את המעבורת למנעל האוויר בתחנת הקצה של הוואקום בתנוחה זקופה.</li>
		<li>חבר את המעבורת למנעל האוויר בתחנת הקצה של הוואקום. הערה: לאחר ההצמדה המאובטחת, מסך המגע בתחנת הקצה יאשר את מצב המעבורת ואת ההשתלבות.</li>
		<li>בחר מיקום בלוק ריק בתוך כלי השיט על ידי לחיצה על הכפתור המתאים במסך המגע והעברת המלון לדוגמה לעמדת הטעינה הנכונה.</li>
		<li>ברגע שהמלון לדוגמה נמצא במיקום, כפתור הפתיחה יהפוך לפעיל. לחץ על לחצן זה כדי לאתחל את רצף שילובי ואקום. הערה: המשאבה תופעל וההתקדמות תוצג בצג. פעולה זו עשויה להימשך עד שתי דקות.</li>
		<li>לאחר השלמת הרצף, המצב ישתנה ל - Airlock פתוח, העברה מתבצעת. סובב את הידית 90° בכיוון השעון כדי לפתוח את המוט, ולדחוף בעדינות את המוט לתוך כלי השיט כך שהמסלול המודרך שוב יאכוף את הנתיב הנכון של הנסיעה לכיוון מיקום המלון לדוגמה. באמצעות הזנת הווידאו המוצגת על המסך לקבלת הדרכה, הכנס באיטיות את הבלוק למלון, והבטיח שנורית מיקום החסימה בתצוגת המגע תופעל. לאחר ההפעלה, לסובב את הידית 180 ° נגד כיוון השעון כדי לשחרר את הבלוק, ולמשוך את המוט מתוך הכלי. לאחר משיכה מלאה, לסובב את הידית 90 ° נגד כיוון השעון כדי לנעול את המוט.</li>
		<li>לאחר נעילת המוט, לחצן סגור יהפוך לפעיל. לחץ על זה כדי לסגור את שסתום ואקום תחנת הקצה, ולפרוק את הרווח בין המעבורת ואת כלי השיט ללחץ אטמוספרי, מחכה עד 20 שניות להשלמה.</li>
		<li>המתן עד שהתצוגה תציג את אישור המצב כדי להסיר את המעבורת לאחר השלמת הרצף. בשלב זה, הסר את המעבורת וחזור ל- CTS כדי לחזור על התהליך עבור הבלוק הבא.</li>
		<li>כדי להכין את הבלוק הבא להעברה, סובב את דיסקית הבלוק בתוך האמבטיה. דחפו את מקש הסיבוב המובנה בחלק העליון של מכסה האקריליק כלפי מטה אל תוך המנעול במרכז דיסקית הבלוק. תוך כדי החזקתו, סובב את המפתח למיקום הבלוק הרצוי בתנוחת האיסוף.</li>
		<li>לאחר שכל הבלוקים הועברו, ודאו ששסתום המעבורת פתוח בזמן שהוא מותקן על ה- CTS. לחצו על כפתור האפייה במסך המגע, ובחרו גם אמבטיה וגם הסעות, ואז לחצו על Bake. הערה: זה מחמם הן את המעבורת והן את האמבטיה כדי להרתיח את החנקן הנוזלי ולאחר מכן להתאדות כל קרח / עיבוי שנצבר לפני השימוש הבא. לאחר שהאפייה התחילה, ניתן לכבות את הגז והאוויר.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+haemoglobin+-+IV.+Sign+determination+by+the+isomorphous+replacement+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+A.+Mathematical+and+Physical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287(1954).</li>
<li>Hendrickson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffraction+in+crystallographic+phase+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).</li>
<li>Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+heavy-atom+derivatization+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).</li>
<li>Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenomethionyl+proteins+produced+for+analysis+by+multiwavelength+anomalous+diffraction+%28MAD%29%3A+A+vehicle+for+direct+determination+of+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure.</a> The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).</li>
<li>Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Q+%22Protein+Crystallography.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology</a>. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).</li>
<li>Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+SAD+is+maturing%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Native SAD is maturing.</a> IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).</li>
<li>Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+potassium+ions+for+ribosome+structure+and+function+revealed+by+long-wavelength+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction.</a> Nature Communications. 10 (1), 2519(2019).</li>
<li>Rocchio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+dynamic%2C+partially+occupied+residues+using+anomalous+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).</li>
<li>Langan, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+X-ray+diffraction+studies+of+ion+transport+in+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4540(2018).</li>
<li>Lolicato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K2p+channel+C-type+gating+involves+asymmetric+selectivity+filter+order-disorder+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions.</a> Science Advances. 6 (44), (2020).</li>
<li>Thorn, A., Sheldrick, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANODE%3A+anomalous+and+heavy-atom+density+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation.</a> Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).</li>
<li>Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+metal-binding+sites+in+proteins+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).</li>
<li>Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+amino+acid+transport+by+the+CAT+family+of+SLC7+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters.</a> Nature Communications. 9 (1), 550(2018).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vacuum+long-wavelength+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).</li>
<li>Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+in-vacuum+PILATUS+1M+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+tomographic+reconstruction+of+macromolecular+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples.</a> Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).</li>
<li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+membrane+protein+crystal+using+ultraviolet+laser+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).</li>
<li>Mykhaylyk, V., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+long-wavelength+protein+crystallography%3A+Keeping+a+protein+crystal+frozen+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum.</a> Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010(2013).</li>
<li>Snell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+sample+mounting+and+alignment+system+for+biological+crystallography+at+a+synchrotron+source%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source.</a> Structure. 12 (4), 537-545 (2004).</li>
<li>The universal container project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/">https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/</a> (2020).</li>
<li>Teng, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+freestanding+thin-film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).</li>
<li>Esposito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+glycosyltransferase+activity+of+the+salmonella+effector+SseK3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).</li>
<li>O'Donnell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+EMC+reveals+a+path+for+membrane+protein+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion.</a> eLife. 9, 57887(2020).</li>
<li>Mishra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+characterization+of+crimean-congo+hemorrhagic+fever+virus+GP38%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38.</a> Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).</li>
<li>Rudolf, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+inhibits+its+receptor+patched+by+a+pincer+grasp+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism.</a> Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).</li>
<li>El Omari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+sulfur+sad+phasing%3A+De+novo+structure+solution+of+the+n-terminal+domain+of+the+ectodomain+of+hcv+e1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIA2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
<li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Buccaneer+software+for+automated+model+building.+1.+Tracing+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).</li>
<li>Skubak, P., Pannu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+protein+structure+solution+from+weak+X-ray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automatic protein structure solution from weak X-ray data.</a> Nature Communications. 4 (1), 2777(2013).</li>
</ol>

הפרוטוקול הנוכחי פותח כדי לעמוד בדרישות הכנת המדגם לניסויי MX ארוכי גל בוואקום בקו הקרן I23. זה היה בשימוש על קו הקרן בשנה האחרונה ותרם להשלמה מוצלחת של פרויקטים מרובים. כפי שעולה מהתוצאות המוצגות כאן, הפרוטוקול מאפשר העברה בטוחה ואמינה של דגימות לתחנת הקצה של הוואקום תוך שמירה על איכות העקיפה שלהן. זהו היבט חשוב לפעולת קו הקרן והוא ילווה בהכשרת משתמשים פנים אל פנים על ידי צוות beamline. חלק מהצעדים ראויים להדגשה כקריטיים להשלמתו המוצלחת והבטוחה של ההליך: העברת דגימות מבסיסי combipuck לבלוקים מדגם דורש דיוק ותשומת לב כדי למנוע דגימות מזיקות (ראה שלב 2.1.4); ניטור רמת החנקן הנוזלי בכל השלבים חשוב כדי למנוע דגימות להיחשף לאוויר או להיות במגע קרוב לחלקים שאינם מקוררים כראוי (2.1.3 ו 2.2.2); המתנה עד לסיום רצף Close (2.2.14), לפני הסרת המעבורת מתחנת הקצה (2.2.15), כדי למנוע השפלה של ואקום תחנת הקצה.
תפיסת הפרוטוקול החלה יחד עם מאמץ הנדסי שמטרתו פיתוח ציוד ייעודי להעברת גבישי חלבון לסביבת הוואקום. המוצרים הסופיים של פרויקט זה היו CTS וכלי הטיפול לדוגמה המשויכים שתוארו לעיל. ה- CTS מהווה שיפור משמעותי על קודמו, Leica EM VCT10014, ומסיר מגבלות מרובות, כגון היעדר מיגון מדגם וסביבת ואקום במהלך ההעברה, הצטברות קרח בתוך אמבט החנקן הנוזלי והיעדר ממשק משתמש אינטואיטיבי ותכונות בטיחות. מאפיינים נוספים של ה-CTS שמשפרים את חוויית המשתמש הם ניטור טמפרטורה ורמת חנקן נוזלי בתוך תחנת המעבורת והדגימה, אמבט בעל קיבולת גדולה יותר המאכלס ארבעה בלוקים בו זמנית, ולא אחד, ומנגנון בהדרכה עצמית לפעולת המעבורת. ה- CTS משולב באופן מלא במערכת בקרת קו הקרן עם ממשק מסך מגע ידידותי למשתמש ובטיחות ואקום ומכאני משופרת בעת התממשקות עם תחנת הקצה.
Beamline I23 הוא מכשיר סינכרוטרון MX באורך גל ארוך הראשון מסוגו, וככזה, החדרת גבישי חלבון לסביבה עתירת ואקום ואחסון שלהם בטמפרטורות קריוגניות, דרשה מאמצים ניכרים. שיפורים בכלי ההכנה לדוגמה ובפרוטוקול, כמו גם המאמצים לייעל תהליכים, הם מתמשכים. כחלק מתמיכת המשתמשים, צוות Beamline זמין תמיד כדי לסייע בפתרון בעיות. דוגמה לתרחיש אחד כזה תהיה בעיות שפוגעות בשלמות מערכת הוואקום, מה שמוביל לקשיים בהצמדה או הסרה של המעבורת אל / מ- CTS או מנעל האוויר של תחנת הקצה. רמות שונות של בדיקות מבוצעות על בסיס שבועי ויומיומי, והכשרת משתמשים תכסה בדיקות נוספות כדי למנוע כשלים פוטנציאליים, כמו בדיקה חזותית של טבעות O בממשקים שהמעבורת מתחברת אליהם. בעוד שסביבת הוואקום פותחת את ההזדמנות לבצע ניסויי עקיפה בטווח אורך גל שאינו נגיש בקורות אחרות, שלב ההעברה הנוסף מפחית את תפוקת הדגימה הכוללת.
ההעברה הידנית עם ארבע דגימות בלבד לכל בלוק העברה ועד חמישה בלוקים בתוך כלי הוואקום מגבילה את הקיבולת הכוללת ל -20 דגימות. לפיכך, עבור פרויקטים עם מדגם גדול כדי לדגום שונות, דגימות צריך להיות מוקרן מראש על beamlines תפוקה גבוהה יהלום, ולאחר מכן רק את הדגימות המבטיחות ביותר צריך להיות מועבר לניסוי אורך גל ארוך אופטימיזציה לאחר מכן. בעוד שמחזיקי המדגם ובלוקי ההעברה אינם משתנים מההקדמה הראשונית שלהם לפני מספר שנים, כלי הטיפול המוצגים כאן הם כל ההתפתחויות החדשות. מחזיקי הדגימה הייעודיים של I23 אינם ניתנים לשינוי בשל תפקידם בקונספט הקירור של קו הקרן. ככזה, העיצוב של כלי הטיפול בדגימות נועד ליצור קשר בין סוג חדש זה של מחזיק וכלים מסחריים סטנדרטיים הזמינים מסחרית שקהילת המשתמשים של MX אימצה במשך זמן רב, כגון combipucks, שרביט קצירת קריסטלים, ומערכת הובלת השולח היבש. העיצוב שלהם כלל התייעצות משמעותית עם קהילת המשתמשים ונדרש מספר איטרציות כדי להשלים. הציוד, הכלים והפרוטוקול המוצגים כאן מייצגים מערכת פשוטה וחזקה להעברת דגימות משתמשים לניסויים בקו הקרן I23 במקור אור יהלום. מכשיר זה לקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית באורך גל ארוך פותח הזדמנויות חדשות לביולוגיה מבנית.

עקיפה ארוכת-גל של קרני רנטגן משמשת לרתום את תכונות הפיזור החריגות של אטומי אור ספציפיים הנמצאים במקור במקרומולקולות. זה עוזר לפתור את בעיית השלב הקריסטלוגרפי ולאשר באופן חד משמעי את זהותם ומיקומם של אלמנטים כאלה בתוך מקרומולקולות. בעוד בימים הראשונים של קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, מבני דה נובו נפתרו על ידי תחליף איזומורפי מרובים1, עם הופעתם של קרני רנטגן טונה ב סינכרוטרון, phasing ניסיוני המבוסס על אורך גל רב גל ואורך גל יחיד (SAD) טכניקות עקיפה חריגה הפכו לשיטות הדומיננטיות2 . שתי השיטות הסתמכו היסטורית על האיתות איזומורפי או חריג ממתכות כבדות, אשר צריך להיות הציג באופן מלאכותי לתוך הגבישים על ידי התגבשות משותפת או טבילת קריסטל3. גישת הניסוי והטעייה והתוצאה הבלתי צפויה יכולות להפוך את הניסויים האלה לגוזלים זמן מתסכלים. השילוב של סלנו-מתיונין במהלך ביטוי חלבון4 היא דרך אלגנטית מאוד להתגבר על מגבלות אלה ולנצל עקיפה חריגה באורכי גל קצרים, אם כי זה יכול להיות מאתגר מאוד במערכות ביטוי חלבון אוקריוטי.
MX באורך גל ארוך מושך מאוד לקביעת מבנה על ידי ניסויי SAD מקוריים5,6 בשל הנוחות של שימוש בגבישים ישירות מניסוי התגבשות מוצלח ללא טיפול נוסף. בנוסף, גישה לשולי הקליטה של אלמנטים בעלי חשיבות ביולוגית גבוהה, כגון סידן, אשלגן, כלור, גופרית וזרחן, פותחת את ההזדמנות לזהות ישירות את מיקומם של אלמנטים אלה במקרומולקולות7,8,9,10. ברזולוציה בינונית ונמוכה, הקצאת אלמנטים המבוססת על צפיפות אלקטרונים 2Fo-Fc וסביבה כימית יכולה להיות קשה, במיוחד עבור אלמנטים עם מספר דומה של אלקטרונים או יונים קשורים חלש עם תפוסות חלקיות. ניתן לפתור את העמימות הזו על ידי איסוף נתונים מתחת ומעבר לקצה הקליטה של אלמנט העניין והפרשנות של ההבדל החריג בשלבי הדגם המתקבלים Fourier Maps11,12. איתור עמדות אטום גופרית במפות אלה יכול גם לסייע בבניית מודלים למפות צפיפות אלקטרונים ברזולוציה נמוכה13. קצות הספיגה של יסודות אור אלה נצפים באורכי גל בין λ = 3 ו- 6 Å (ראו איור 1, למעלה). טווח אורך גל זה היה הרבה מעבר ליכולות של כל קו קרן MX סינכרוטרון, ופעולה יעילה בטווח זה דורשת התגברות על מספר אתגרים טכניים, כמפורט להלן.
Beamline I23 במקור אור יהלום, בריטניה, הוא מכשיר ייחודי, שתוכנן במיוחד כדי להקל על ניסויי MX באורך גל ארוך, טונה בטווח אורך גל בין λ = 1.13 ו 5.9 Å (טווח אנרגיה בין E = 2.1 ו 11 keV). על ידי הפעלה בסביבה של ואקום גבוה14, ספיגת האוויר ופיזור מסולקים, וכתוצאה מכך משפרים את היעילות של ניסויי עקיפה ואת יחס האות לרעש. תחנת קצה גדולה של ואקום מקיפה את כל הרכיבים של סביבת המדגם, כולל גלאי פילטוס 12M חצי גלילי, גוניומטר רב-צירי, מערכות הצפייה והאיסוף המקוונות, וכן ציוד מותאם אישית להעברת דגימה ואחסון (איור 2). כל ציוד עבר אופטימיזציה כדי להבטיח שניתן יהיה לאסוף את נתוני אורך הגל הארוך באיכות הטובה ביותר. גלאי פילטוס 12M המעוקל יכול לאסוף לזוויות עקיפה של 2θ = ±100°, וכתוצאה מכך נתוני עקיפה ברזולוציה גבוהה מספיק אפילו באורכי הגל הארוכים ביותר (איור 1, למטה). 120 מודולי הגלאי נבחרו במיוחד עבור תאימות אנרגיה נמוכה וכיול עבור מצב רווח אולטרה גבוה נוסף סופקו.
סף הגלאי הנמוך ביותר האפשרי הוא 1.8 keV, מה שמוביל להגברת השפעות הפינה והקצה עבור אנרגיות נמוכות מ-3.6 keV ופגיעה באיכות הנתונים באורכי הגל הארוכים ביותר, במיוחד עבור גבישי פסיפס נמוכים, ניתן לראות. יש לקחת בחשבון את האפקט הזה בשילוב עם הירידה ביעילות הקוונטית של הגלאי15 בעת תכנון ניסוי. הגוניומטר הרב-צירי מאפשר ארגון מחדש של גבישים כדי לאפשר אסטרטגיות איסוף נתונים הממקסמות את האיכות והעוצמה של האות החריג, כמו גם את השלמות של הנתונים החריגים שנאספו. ספיגת הדגימה היא גורם מגביל לניסויים, במיוחד באורכי הגל הארוכים ביותר. תיקוני ספיגה, כפי המיושמים בחבילות תוכנה לעיבוד MX הנפוצות16,17, פועלים היטב לאורכי גל סביב 3 Å. אורכי גל ארוכים יותר ידרשו תיקוני ספיגה אנליטיים המבוססים על שחזורים טומוגרפיים18 או אבלציה בלייזר כדי להסיר חומר שאינו מתפזר ולחתוך את הגבישים לצורות מוגדרות היטב19. זה האחרון גם יסייע בהפחתת הגודל של גבישים גדולים יותר כמו ניסויי עקיפה קרני רנטגן באורכי גל ארוכים יותר יעילים יותר עבור גבישים קטנים יותר14. האתגר של שמירה על דגימות בטמפרטורות קריוגניות במהלך איסוף נתונים מטופל על ידי קירור מוליך, כמו באמצעות התקני זרם גז קר בזרימה פתוחה אינו תואם לסביבת ואקום. לפיכך, חומרים מוליכים תרמית, כגון נחושת, נדרשים לחיבור המדגם לקריוקולר שפופרת דופק. הפינים הסטנדרטיים של SPINE מפלדת אל-חלד המשמשים בכל MX, כמו גם כל תושבות מדגם זמינות מסחרית אחרות, אינן מתאימות ל-MX באורך גל ארוך ואקום בגלל מוליכות תרמית ירודה שלהן.
מחזיקי הדגימה (SHs) עבור MX בוואקום חייבים להיות חלק חיוני מהמסלול התרמי להסרת חום (איור 3A). ככזה, הם מורכבים גוף נחושת מוליך תרמית וסיכה וכוללים שני מאפיינים חשובים: בסיס מגנט חזק כדי להבטיח קישור תרמי נאות לראש הגוניומטר הקר, והר מדגם, עשוי פולימיד, כדי למזער את ספיגת קרני הרנטגן ופיזור20. נעשו מאמצים להבטיח שחוויית המשתמש של קצירת קריסטלים וקירור הבזקים כמעט זהה לזו הקשורה לנוהלי MX סטנדרטיים. מכיוון ש-I23 SHs הייעודיים אינם תואמים ישירות לקורות קרן סינכרוטרון אחרות, מתאם נירוסטה משמש לתאימות עם המטות המגנטיים קוצרי הגבישים וממשקי הגוניומטר הקיימים בקורות קרן MX אחרות (איור 3B). המתאם חשוב גם לשימוש במתקני האוטומציה על קרני יהלום MX אחרים, המבוססים על ראשי אחיזה רובוטיים מסוג ALS21 ופריסות בסיס בסגנון unipuck22, אם וריאציה מדגם דורשת הקרנה מוקדמת מהירה לבחירה של גבישי הדיפרטור הטובים ביותר. ניתן לפרק את פרוטוקול ההכנה והטעינה לדוגמה לשני שלבים:
שלב 1: קצירת גבישים והקפאת הבזק המבוצעים על ידי משתמשים במעבדות שלהם
לאחר הערכת התאמת הפרויקט לאיסוף נתוני I23, מחזיקי מדגם עם לולאות התואמות את גדלי הגביש (שהורכבו מראש עם מתאמים) נשלחים למעבדות משתמשים לקצירת קריסטלים. כדי למנוע נזק, אין להפריד בין SHs ומתאמים ויש להשתמש בהם כיחידה אחת לצורך דיג גבישים עם לולאות בגודל המתאים באמצעות שרביטים מגנטיים סטנדרטיים לקצירת גבישים. כמקובל ב- MX, משימה זו מתבצעת באופן ידני תחת המיקרוסקופ, וגבישים מקוררים מיד בדוואר קצף עם חנקן נוזלי23. בשל חוסר התאמה של כוחות מגנטיים, SHs אינם תואמים כרגע עם unipucks. האחסון והמשלוח מתממשים באמצעות מסרקים (ראו טבלת החומרים), הזמינים למשתמשים על פי בקשה, יחד עם תוספות השולח היבש התואמות (איור 3C). דיסקיות אלה חולקות את אותה צלחת בסיס עם unipucks בשימוש נרחב ולאפשר הקרנה מוקדמת מהירה של דגימות בקורות MX יהלום אחרות. השאלת ציוד זה למשתמשים היא כרגע ההסדר הטוב ביותר, עד שבעלי המדגם בהתאמה אישית יהיו זמינים מסחרית. הובלה לקו הקרן דורשת את השולחים היבשים הסטנדרטיים המשמשים בקהילת MX.
שלב 2: העברת דגימות מקוררות קריו לתחנת הקצה של הוואקום
ברגע שהדגימות מגיעות לקו הקרן, הן מוכנות להעברה לתחנת הקצה של הוואקום. זה כרוך בהסרת SHs מ combipucks והפרדה ממתאמים. החדרת דגימות ביולוגיות לוואקום מתבצעת באופן שגרתי בתחום מיקרוסקופיית הקריו-אלקטרונים. חלק מהמושגים המבוססים היטב הותאמו להעברת מדגם I23. בקיצור, SHs מועברים תחת חנקן נוזלי על בלוקי העברה (איור 3D). בלוקים אלה יש מוליכות תרמית מעולה ומסה תרמית משמעותית, מניעת הגבישים מלהגיע לטמפרטורת מעבר זכוכית כאשר בוואקום. עד ארבעה בלוקים, עם קיבולת של ארבע דגימות כל אחד, נטענים תחת חנקן נוזלי לתוך דיסקית בלוק (איור 3H), המשמשת להעברת דגימות למערכת ההעברה הקריוגנית (CTS) או לאחסון במחדלי חנקן נוזליים בין ניסויים.
מערכת ההעברה הקריוגנית שפותחה ב-Diamond Light Source מורכבת משני תתי-מכלולים, תחנת הדגימה והמעבורת (איור 4A). תחנת הדגימה מורכבת מאמבט חנקן נוזלי לאחסון זמני של גבישי חלבון ויש לה תכונות ספציפיות כדי להבטיח בטיחות ולאפשר חוויה ידידותית למשתמש (איור 5). ה- CTS נשלט על-ידי בקר לוגי הניתן לתכנות באמצעות ממשק מסך מגע ידידותי למשתמש. בתחנה לדוגמה יש דיודות פולטות אור שנבנו להדמיה טובה יותר ומערכת של תנורי חימום הנשלטים בלולאה קרובה כדי להפוך את הייבוש של אמבט החנקן הנוזלי לאוטומטי לאחר העברת הדגימות. יש לו גם מגוון חיישנים כדי להבטיח בטיחות ותפקוד יעיל של המערכת. תחנת הדגימה כוללת חומרה מותאמת אישית כדי לספק ממשק חשמלי אמין לאינטראקציה עם המעבורת לפעולות, כגון שאיבת ואקום גס להעברת דגימה, כמו גם ניטור של רמות החנקן הנוזלי והטמפרטורה בתוך המעבורת.
המעבורת (איור 6) היא מכשיר נייד המשמש לאיסוף בלוק העברה מאמבטיית החנקן הנוזלי Sample Station ולהעברתו בתוך סביבת קריוגנית ואקום לתחנת הקצה. הוא כולל חנקן נוזלי dewar כדי לשמור על הדגימות קר במהלך ההעברה, ניטור רמת הנוזלים dewar, ומגוון של חיישנים לפעולה ובטיחות המשתמש. זרוע ההעברה מצוידת בכונן מגנטי וכוללת חריצים במכונה כדי להנחות את המשתמשים בטעינה ופריקה בטוחה של בלוקי העברה לתחנת הקצה. ההעברה מהמעבורת לכלי הוואקום מתבצעת באמצעות מנעל אוויר. מנעל האוויר הוא ממשק עבור המעבורת בתחנת הקצה המשמשת לפינוי המרחב הבין-מרחבי בין המעבורת לתחנת הקצה, לפני פתיחת שסתומי ואקום המעבורת ותחנות הקצה. רצפי השאיבה והאוורור הם אוטומטיים לחלוטין וניתן להפעילם באמצעות מסך מגע גדול עם ממשק ידידותי למשתמש (איור 4C). הפרוטוקול הנוכחי משמש להעברת גביש תאומטין לתחנת הקצה ואקום לאיסוף נתונים.

<table><tbody><tr><td>גלאי 12M</td><td>Dectris, שוויץ</td><td></td><td>גלאי קרני רנטגן עם ספירת פוטונים בודדים</td></tr><tr><td>CombiPuck</td><td>MiTeGen</td><td>מק"ט: M-CBP-P1</td><td>CRYOPUCKS המשמשים לאחסון והובלה קריוגנית של מחזיקי דגימות I23 ודגימות</td></tr><tr><td>שרביט מגנטי לקצירת גבישים</td><td>מידות מולקולריות <</td><td>strong>MD7-411</td><td>משמש לקצירת גביש</td></tr><tr><td>משלוח יבש (CX100)</td><td>מידות מולקולריות</td> <td><חזק>MD7-21</חזק></td><td>משמש לאחסון והובלה קריוגניים של מחזיקי דגימות I23 ודגימות</td></tr> תוספת <tr><td>משלוח יבש (CombiPuck Transport Cane)</td> <td>MiTeGen</td><td><חזק>מק"ט: M-CBP-PTC1</td><td>משמש לאחסון והובלה קריוגניים של מחזיקי דגימות I23 ודגימות</td></tr><tr><td>קפטון פולימיד</td><td></td><td></td><td>תושבת לדוגמא עשויה מכסה אקרילי של Kapton polyimide</td></tr><tr><td>Perpsex</td><td></td><td></td><td>עם מפתח סיבוב מובנה</td></tr><tr><td>אבקת Thaumatin</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ</td><td>'<חזק>T7638</חזק></td><td>משמש לייצור גבישי תאומטין על ידי דיפוזיה של אדים</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן i23 במקור אור יהלום

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית באורך גל ארוך (MX) מנצלת את תכונות הפיזור החריגות של יסודות, כגון גופרית, זרחן, אשלגן, כלור או סידן, שלעתים קרובות נמצאים באופן טבעי במקרומולקולות. זה מאפשר פתרון מבנה ישיר של חלבונים וחומצות גרעין באמצעות פאזה ניסיונית ללא צורך בתיוג נוסף. כדי לחסל את ספיגת האוויר המשמעותית של צילומי רנטגן במשטר אורך גל זה, ניסויים אלה מבוצעים בסביבת ואקום. Beamline I23 במקור אור יהלום, בריטניה, הוא מכשיר סינכרוטרון הראשון מסוגו, תוכנן ואופטימיזציה לניסויי MX בטווח אורך הגל הארוך לכיוון 5 Å. 
כדי לאפשר זאת, כלי ואקום גדול מקיף את כל רכיבי תחנת הקצה של סביבת המדגם. הצורך לשמור על דגימות בטמפרטורות קריוגניות במהלך אחסון ואיסוף נתונים בריק דורש שימוש בבעלי מדגם מוליך תרמית. זה מאפשר הסרת חום יעילה כדי להבטיח קירור מדגם כ 50 K. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליכים המשמשים להכנת מדגם והעברת דגימות לוואקום בקו הקרן I23. הבטחת אחידות בפרקטיקות ובשיטות שכבר נקבעו בקהילת הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית, ניתן לבצע קירור מדגם לטמפרטורת החנקן הנוזלי בכל הגדרת מעבדה המצוידת בכלי MX סטנדרטיים. 
אחסון קריוגני והובלה של דגימות דורשים רק ציוד זמין מסחרית סטנדרטית. ציוד מיוחד נדרש להעברת גבישים מקוררים קריוגנית מחנקן נוזלי לתחנת הקצה של ואקום. כלי טיפול בדגימות בהתאמה אישית ומערכת העברה קריוגנית ייעודית (CTS) פותחו בבית. נתוני עקיפה שנאספו על דגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מראים סטטיסטיקות מיזוג מצוינות, המציינות כי איכות הדגימות אינה משתנה במהלך ההליך. זה פותח הזדמנויות ייחודיות עבור MX בוואקום בטווח אורך גל מעבר לקורות סינכרוטרון סטנדרטיות.

גביש תאומטין הוצג לתחנת הקצה של הוואקום באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. נתוני עקיפה נאספו באורך גל של 2.7552 Å (E = 4500 eV) כ- 3600 תמונות עם תוספת סיבוב של חשיפה של 0.1° ו- 0.1 שניות לתמונה. גודל הקרן הותאם ל-150 מיקרומטר x 150 מיקרומטר והופחת ל-10% שידור, עם מדידת שטף מקבילה של 7.1 x 109 פוטונים/ש'. הבחירה של λ = 2.7552 Å מבוססת על פשרה בין העלייה באפקטים חריגים של אותות חריגים וספיגת מדגם לבין הירידה ברזולוציה לאורכי גל ארוכים יותר. אמנם לא קרוב לקצה הקליטה התיאורטי של גופרית (λ = 5.0095 Å), באורך גל זה, התרומה הדמיונית לגורם הפיזור של גופרית f" היא 1.57 e- , גורם של 1.6-2.1 גדול יותר לעומת אורכי גל בין 1.7 ל 2 Å. האותות החריגים החזקים יותר הנובעים מכך מאפשרים דגש S-SAD מוצלח לפרויקטים מאתגרים יותר.
מגוון של ניסויי פאזה קשים כבר בוצעו על beamline I2324,25,26,27, עם נתונים שנאספו באורך גל זה. בעוד שלבים על ידי S-SAD אפשרי באמצעות אורכי גל קצרים בהרבה, זה לעתים קרובות דורש בניית אות חריג באמצעות מיזוג נתונים מגבישים איזומורפיים רבים כדי להגיע לערכי ריבוי מעל 10028. בשל האות החריג המשופר באורכי גל ארוכים יותר, רוב פרויקטי השלבים שנפתרו ב- I23 דרשו נתונים רק מגביש אחד. תמונת עקיפה מייצגת מוצגת באיור 7, משמאל. עיבוד נתונים באמצעות Xia2-3dii29 הפיק סטטיסטיקת מיזוג מעולה, כמפורט בטבלה 1. איור 7, נכון, מציג חלק מתמונת עקיפה מייצגת מערכת הנתונים של תאומטין וממחיש את הרקע הנמוך המקיף את השתקפויות Bragg, התורם לערכי ה- I/σ(I) הגדולים שנצפו בדרך כלל במערך הוואקום, ומבטיח שרק צילומי רנטגן הפזורים על ידי הדגימה יגיעו לגלאי.
הרזולוציה המקסימלית ברת השגה של 1.8 Å נובעת מגיאומטריית הגלאים ואורך הגל הנבחר של קרינת הרנטגן. ערכת הנתונים הניבה אות אנומלי חזק מאוד, משתקף באמצע השיפוע של פרמטר הסתברות נורמלית חריגה של 2.677, להקל על פתרון המבנה על ידי צינור phasing אוטומטי CRANK2. האיכות הגבוהה של מפת צפיפות האלקטרונים המתקבלת אפשרה בניית דגם אוטומטי מוצלחת על ידי מודול Buccaneer30 בתוך CRANK231, עם מיקום נכון עבור 100% מרצף חומצות האמינו של תאומטין. ההבדל החריג בשלבים מפת פורייה, המחושב עם ANODE11, חושף 16 אטומי גופרית מסודרים היטב ואטום גופרית אחד מ- Cys159 עם שתי קונפורמציות חלופיות, כפי שאושר על ידי 18 הגבהים המשמעותיים של הפסגות במיקומים של פיזורים חריגים בטבלה 2. 16 שאריות הציסטאין שבתוך תאומטין יוצרות 8 גשרים דיסולפידיים, שכולם נראים בבירור במפת 2Fo-Fc (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> איור 1: נתוני עקיפה ברזולוציה גבוהה מניסויי MX באורך גל ארוך. (A) חלקה של ערכי f" כנגד אנרגיה, המציינת את קצות הספיגה של יסודות אור הנגישים בקו הקרן I23. (ב) רזולוציה מרבית הניתנת להשגה בפינות גלאי P12M נגד אנרגיה. קיצור: MX = קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> איור 2: מקטע אופקי דרך כלי הוואקום עם כל מרכיבי תחנת הקצה. קיצור: OAV = מערכת צפייה על ציר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> איור 3: כלי טיפול לדוגמה. (א) מחזיק מדגם I23. (B) סיכה סטנדרטית לעמוד השדרה MX (משמאל) לצד מחזיק מדגם I23 עם מתאם (מימין). (C) מכסה Combipuck ובסיס עם מחזיקי מדגם I23 (כחול). חסום מכסה דיסקית ובסיס עם שני בלוקי העברה (זהב). מקל משלוח יבש, התואם הן מסרקיות והן עם דיסקיות בלוק, נראה מאחור. (ד) בלוק העברה עם ארבעה מחזיקי מדגם I23. (ה) כלי מפתח המשמש לסיבוב של בסיס דיסקית הבלוק. (ו) שרביט מפריד. (ז) הכלי מפריד דיסקית עם שני חצים המציגים את ההגדרות הגבוהות והנמוכות. (H) לחסום בסיס דיסקית עם ארבעה בלוקים Cu ריקים. (אני) מכסה עבור דיסקית הבלוק. (J) מיכל קצף עם כל הכלים הדרושים להעברת מחזיקי מדגם מבסיסי combipuck לבלוקים נחושת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> איור 4: מערכת העברה קריוגנית. (A) תחנת מדגם CTS עם הסעות מחוברות והמשפכים המשמשים למילוי. (ב) דיסקית בלוק עם שני בלוקים העברה הממוקמים בתוך CTS. (C) CTS בקרת מסך מגע של תוכנת בקרה. קיצור: CTS = מערכת העברה קריוגנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> איור 5: תחנת מדגם מערכת העברה קריוגנית. קיצורים: נורות LED = דיודות פולטות אור; LN2 = חנקן נוזלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> איור 6: מעבורת מערכת העברה קריוגנית. קיצורים: נורות LED = דיודות פולטות אור; LN2 = חנקן נוזלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> איור 7: תמונות עקיפה. משמאל, תמונת עקיפה מקבוצת הנתונים שנאספה על גביש הטאומטין. מימין, נקודת עקיפה המוקפת בפיקסלים ברקע בספירה נמוכה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> איור 8: פתרון מבנה של תאומטין עם צינור אוטומטי CRANK2 (הגדרות ברירת מחדל, ללא עידון עוקב). (A) סקירה כללית של תאומטין עם מפת 2Fo-Fc ב- 1.6σ (כחול) והפרש חריג בשלבים מפת פורייה ב- 5σ מחושבת ב- ANODE (ירוק). (ב) סקירה כללית של תאומטין המציגה רק את ההבדל החריג בשלבים מפת פורייה ב 5σ. (ג) מבט מקרוב על גשר דיסולפיד הנמצא בתאומטין עם מפת 2Fo-Fc ב 1.6σ (כחול) והבדל חריג בשלבים מפת פורייה ב 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>תאומטין</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך גל לאיסוף נתונים (Å) (אנרגיה (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר התמונות x גודל טריז (°)</td>
			<td>3600 x 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>קבוצת חלל</td>
			<td>
עמ' 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>קבועי תא יחידה</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>רזולוציה (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>השלמות</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ISa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>רמיאס</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>רפים</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>הריבוי</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מדרון אמצעי</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סטטיסטיקת איסוף ועיבוד נתונים עבור Thaumatin ב- 2.755 אורך גל של Å בקו קרן I23, DLS. לרזולוציה, שלמות, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) וריבוי, פגזים ברזולוציה גבוהה מוצגים בסוגריים. קיצור: DLS = מקור אור יהלום.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>האטום הקרוב ביותר</td>
			<td>גובה שיא (סיגמא)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: הפרש חריג פורייה מפה גבהים שיא כפי שחושב על ידי ANODE באמצעות הדגם בשלבים שנבנה באופן אוטומטי מ CRANK2.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת מדגם קריוגני והעברת גבישים לתוך תחנת הקצה ואקום על קו קרן I23 במקור אור יהלום, לניסויים קריסטלוגרפיה באורך גל ארוך רנטגן מקרומולקולרי.

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית באורך גל ארוך מנצלת את האות החריג מאטומי אור הנמצאים במקור בחלבונים וחומצות גרעין. טכניקה זו משמשת לפתרון ניסיוני של בעיית הפנים הקריסטלוגרפיות ולקביעת זהותם ומיקוםם של אלמנטים אלה. Beamline I23 ב-Diamond Light Source הוא מכשיר סינכרוטרון ייחודי המותאם לניסויים באורכי גל ארוכים עד חמישה אנגסטרום.זה מאפשר גישה לשולי הקליטה של אלמנטים בעלי רלוונטיות ביולוגית גבוהה, כגון סידן, אשלגן, כלור, גופרית וזרחן. בשל הספיגה המשמעותית של צילומי רנטגן באוויר במשטר אורך הגל הארוך, ניסויים אלה מבוצעים בסביבת ואקום. כדי לשמור על דגימות בטמפרטורות קריוגניות בתוך סביבת הוואקום, הגבישים מותקנים על מחזיקי מדגם ייעודיים מוליכים תרמית.העברת מדגם הקריוגני מחנקן נוזלי לתחנת קצה הוואקום דומה מאוד לטכניקות המשמשות במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. פרוטוקול זה מציג את ההליך להעברת גבישים לסביבת הוואקום באמצעות הכלים והציוד שפותחו ב- Diamond Light Source. התחל על ידי הפרדת המכסה מבסיס CombiPuck כך שמחזיקי המדגם יישארו מחוברים לבסיס ובקבוקונים נשמרים במכסה.טבול את המכסה עם בקבוקונים בחנקן נוזלי, ולאחר מכן לחבר מחזיק מדגם ומתאם לשרביט מגנטי ולקצור את הגבישים. יש לשטוף כל דגימה ישירות לתוך CombiPuck, וציין את מיקום המדגם. כדי לסגור את הדיסקית, השתמש בשרביט דיסקית כדי לחבר את הבסיס למכסה.העבר את CombiPuck מחנקן נוזלי לשולח היבש או לאחסון. מניחים את הבסיס של דיסקית הבלוק כבר מאוכלס עם בלוקי העברה ריקים על בסיס התמיכה שלה במיכל קצף, ולאחר מכן למלא עם חנקן נוזלי. לאחר מכן, מניחים את CombiPuck במיכל הקצף מלא חנקן נוזלי, לוודא כי הבסיס של הדיסקית מאובטח למחזיק המגנטי בתוך מיכל הקצף.מצננים מראש את כל הכלים הדרושים בחנקן נוזלי. לאחר מכן, להפריד את המכסה מהבסיס באמצעות הכלי מפריד דיסקית על ההגדרה הגבוהה, כך הבסיס נשאר מחובר למחזיק המגנטי, חשיפת מחזיקי המדגם בתוך חנקן נוזלי. הנח את שרביט המפריד מעל מחזיק הדגימה והמתאם ככל האפשר, וודא שהשביט אנכי.הזז את הידית הקטנה על שרביט המפריד כלפי מטה עם האגודל עד שהוא לוחץ כדי לאבטח את מחזיק הדגימה בפנים, ומשוך את מחזיק הדגימה מהמתאם. הנמך את המפריד מעל מיקום בלוק ההעברה הרצוי, וודא שאחד משלושת השיניים יתאים לחור המרכזי של בלוק ההעברה. שחרר את מחזיק הדגימה על-ידי הזזת הידית למעלה.כדי לטעון דוגמאות לבלוק ההעברה הבא, השתמש בכלי מקש הקרוסלה כדי לסובב בלוק העברה ריק למיקום האופקי. לאחר העברת כל מחזיקי הדגימה, סגור את דיסקית הבלוק על ידי הצבת המכסה בחנקן נוזלי. המתן עד שהטמפרטורה תשתווה, ולאחר מכן התאם את המכסה מעל הבסיס והרם בעדינות כדי לשחרר מהקרוסלה.חבר את המעבורת לתחנה. פתח את גז החנקן ושסתומי האוויר וודא שהגזים זורמים. לאחר מכן, הפעל את CTS.מצננים גם את האמבטיה וגם את המעבורת עם חנקן נוזלי. מניחים את המשפך שסופק ביציאת המילוי על המעבורת ויוצקים לאט לאט חנקן נוזלי לתוך המשפך תוך ניטור הרמה על המסך. עצור כאשר המחוון הופך מאדום לכחול.מלאו את האמבטיה בחנקן נוזלי באמצעות המשפך. מעבירים דיסקית בלוק מחנקן נוזלי לאמבטיית CTS באמצעות כלי הפרדת הדיסקוס המצורף. הסר את המכסה של דיסקית הבלוק וסגור את המכסה של אמבט CTS.כדי להכניס בלוק העברה למעבורת, לפתוח את ידית המעבורת על ידי סיבוב 90 מעלות בכיוון השעון ולקדם אותו לכיוון האמבטיה, כך המסלול המודרך על הידית אוכף את הנתיב הנכון של הנסיעה. לאחר כיסוי הבלוק מקורר, לקדם את הידית כדי להציג את הבלוק לתוך המעבורת. כדי לנעול את בלוק ההעברה על המעבורת, סובב את הידית 180 מעלות בכיוון השעון.משוך את הידית למיקום האחורי המקורי, ונעל אותה במקומה על-ידי סיבוב של 90 מעלות נגד כיוון השעון. לחץ על סגור משאבת שסתום הסעות במסך התצוגה כדי להתחיל בפינוי המעבורת. ברגע שההודעות מעבורת מוכנה לזוז ואל תזיז מוט, שסתום סגור מוצגים על מסך המגע, לחץ על הידית מתחת למעבורת ולהרים אותו בזהירות באמצעות הידית בחלק העליון.יש לשאת את המעבורת למנעל האוויר בתחנת קצה הוואקום בתנוחה זקופה ולחבר אותה. בחר מיקום בלוק ריק בתוך כלי השיט על ידי לחיצה על הכפתור המתאים במסך המגע והעברת המלון לדוגמה לעמדת הטעינה הנכונה. ברגע שמלון לדוגמה נמצא במיקום, לחץ על לחצן פתח כדי ליזום את רצף שילובי הוואקום.לאחר השלמת הרצף ושינויי המצב ל- Airlock פתוח, לחסום במעבורת, לסובב את הידית 90 מעלות בכיוון השעון כדי לפתוח את המוט. דחוף בעדינות את המוט לתוך כלי השיט כך שהמסלול המודרך אוכף את הנתיב הנכון של נסיעה לכיוון המלון לדוגמה. הכנס באיטיות את בלוק ההעברה למלון באמצעות הזנת הווידאו המוצגת על המסך לקבלת הדרכה, והבטח שסמל מיקום החסימה בתצוגת המגע מופעל.לאחר ההפעלה, לסובב את הידית 180 מעלות נגד כיוון השעון כדי לשחרר את בלוק ההעברה ולמשוך את המוט מתוך הכלי. לאחר נסיגה מלאה, לסובב את הידית 90 מעלות נגד כיוון השעון כדי לנעול את המוט. לחץ על כפתור סגור כדי לסגור את שסתום ואקום תחנת הקצה ולפרוק את הרווח בין המעבורת לבין כלי השיט ללחץ אטמוספרי.הסר את המעבורת כאשר תצוגת מנעל האוויר מציגה את המצב אישור לניתוק. החזר את המעבורת לאמבטיית CTS ולחץ על שסתום הסעות פתוח כדי לפנות את המעבורת לפני טעינת בלוק הדגימה הבא. ברגע שהרמזור ירוק וההודעה אישור להזיז מוט מופיעה, ניתן להציג את בלוק ההעברה הבא למעבורת.כדי להכין את בלוק ההעברה הבא, סובב את דיסקית הבלוק בתוך האמבטיה. דחפו את מקש הסיבוב המובנה בחלק העליון של מכסה האקריליק כלפי מטה אל תוך המנעול במרכז דיסקית הבלוק. תוך כדי החזקתו, סובבו את המפתח למיקום בלוק ההעברה הרצוי בתנוחת האיסוף.לאחר שכל הבלוקים הועברו, ודאו ששסתום המעבורת פתוח, לחצו על כפתור האפייה במסך המגע, בחרו גם באת' וגם ב-Shuttle ולאחר מכן לחצו על 'התחל לאפות'. קרן הקריסטלוגרפיה המקקרומולקולרית הארוכה באורך גל I23 במקור אור היהלום יכולה לגשת לשולי הקליטה של אלמנטים בעלי חשיבות ביולוגית גבוהה, כגון סידן, אשלגן, כלור, גופרית וזרחן, מה שנותן אות חריג משופר שניתן להשתמש בו כדי להדגיש או לאתר אלמנטים אלה בתוך מקרומולקולות. נתוני עקיפה נאספו מגביש תאומטין יחיד באורך גל 2.75 אנגסטרום, שנבחרו כפשרה בין אות חריג מוגבר לבין השפעות ספיגת מדגם באורכי גל ארוכים יותר.הגדרת הוואקום מבטיחה שרק צילומי רנטגן הפזורים על ידי המדגם יגיעו לגלאי, ומספקים רקע נמוך סביב השתקפויות בראג. ערכת הנתונים הניבה אות חריג חזק מאוד, להקל על פתרון המבנה על ידי צינור phasing אוטומטי CRANK2. האיכות הגבוהה של מפת צפיפות האלקטרונים המתקבלת אפשרה בניית מודל אוטומטית מוצלחת, עם מיקום נכון עבור 100% מרצף חומצות האמינו של תאומטין.16 שאריות ציסטאין בתוך תאומטין יוצרות שמונה גשרים דיסולפידיים, שכולם נראים בבירור במפת צפיפות האלקטרונים. מכיוון שקריסטלוגרפיה של חלבון באורך גל ארוך היא תחום חדש, פיתחנו כלים וציוד חדשים לטיפול בדגימות. פרוטוקול זה מנחה את המשתמשים בהעברת דגימות בבטחה לתחנת קצה הוואקום בקו הקרן I23 במקור אור היהלום.סביבת הוואקום פותחת הזדמנויות ייחודיות לביצוע ניסויי עקיפה בטווח אורך גל שאינו נגיש בקורות אחרות. קריסטלוגרפיה ארוכת-גל של קרני רנטגן מאפשרת phasing ניסיוני של מקרומולקולות ישירות מגבישים מקומיים. זה גם מאפשר זיהוי חד משמעי של יונים הקשורים למולקולות.

sample-preparation-transfer-protocol-for-vacuum-long-wavelength

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול מוצג עבור קריסטלוגרפיה רנטגן באמצעות microcrystals חלבון. שתי דוגמאות ניתוח vivo- microcrystals מגודלים לאחר טיהור או תאמול מושווים.

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

מחזיק לדוגמה הרומן לקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן יחד עם פרוטוקול טיפול מתאים מוצג. המערכת מאפשרת צמיחה גביש, הטבילה גביש באוסף נתונים עקיפה באתרו בשניהם, הסביבה ואת הטמפרטורה הקריוגני ללא צורך של כל מניפולציה גביש או הרכבה.

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

אנו מציגים מדריך מקיף להכנת מדגם יעד קבוע, איסוף נתונים ועיבוד נתונים עבור קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתית בקו קרן יהלום I24.

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

הקרנת שברים קריסטלוגרפיים במלון הלמהולץ-זנטרום ברלין מתבצעת באמצעות זרימת עבודה עם ספריות מורכבות ייעודיות, כלי טיפול בגבישים, מתקני איסוף נתונים מהירים וניתוח נתונים אוטומטי ברובו. הפרוטוקול שהוצג מתכוון למקסם את התפוקה של ניסויים כאלה כדי לספק נקודות התחלה מבטיחות לתכנון ליגנד מבוסס מבנה במורד הזרם.

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

יחס אות לרעש של נתונים הוא אחד השיקולים החשובים ביותר בביצוע מדידות עקיפה של קרני רנטגן ממיקרו-קריסטלים. קו הקרן VMXm מספק סביבה עם רעש נמוך ומיקרואורגניזם לניסויים כאלה. כאן, אנו מתארים שיטות הכנה לדוגמה עבור microcrystals הרכבה וקירור עבור VMXm וקווי קרן קריסטלוגרפיה מיקרומוקולריים אחרים.

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

מאמר זה מתאר את תהליך XChem המלא לסינון מקטעים מבוסס גביש, החל מהגשת בקשה לגישה וכל השלבים הבאים להפצת נתונים.

השגת סינון מקטעים יעיל במתקן XChem ב-Diamond Light Source

אנו מציגים פרוטוקול להתגבשות חלבונים באמצעות מתקן ההתגבשות במתחם המחקר בהארוול ולאחר מכן באתרו איסוף נתונים קריסטלוגרפיים מקרני רנטגן מגבישים בתוך הלוחות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית רב-תכליתית באתרו (VMXi) של דיאמונד. אנו מתארים דרישות לדוגמה, פרוטוקולי התגבשות והנחיות לאיסוף נתונים.

התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source

אנו מתארים נהלים להכנה ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון ממברנה בשלב מעוקב ליפידי עבור קריסטלוגרפיה סדרתית בלייזרים אלקטרונים חופשיים של קרני רנטגן ומקורות סינכרוטרון. ניתן ליישם פרוטוקולים אלה גם לשילוב ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון מסיסים, מה שמוביל להפחתה משמעותית בצריכת הדגימה בהשוואה להזרקת נוזלים.

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

למד פרוטוקול להכנת קריסטלים מקרומולקולריים בטמפרטורה קריוגנית והעברתם לסביבת ואקום לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בקו קרן I23 במקור אור יהלום.

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

גלה סרטונים נוספים