פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום
23 באפריל 2021
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת מדגם קריוגני והעברת גבישים לתוך תחנת הקצה ואקום על קו קרן I23 במקור אור יהלום, לניסויים קריסטלוגרפיה באורך גל ארוך רנטגן מקרומולקולרי.
קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית באורך גל ארוך מנצלת את האות החריג מאטומי אור הנמצאים במקור בחלבונים וחומצות גרעין. טכניקה זו משמשת לפתרון ניסיוני של בעיית הפנים הקריסטלוגרפיות ולקביעת זהותם ומיקוםם של אלמנטים אלה. Beamline I23 ב-Diamond Light Source הוא מכשיר סינכרוטרון ייחודי המותאם לניסויים באורכי גל ארוכים עד חמישה אנגסטרום.
זה מאפשר גישה לשולי הקליטה של אלמנטים בעלי רלוונטיות ביולוגית גבוהה, כגון סידן, אשלגן, כלור, גופרית וזרחן. בשל הספיגה המשמעותית של צילומי רנטגן באוויר במשטר אורך הגל הארוך, ניסויים אלה מבוצעים בסביבת ואקום. כדי לשמור על דגימות בטמפרטורות קריוגניות בתוך סביבת הוואקום, הגבישים מותקנים על מחזיקי מדגם ייעודיים מוליכים תרמית.
העברת מדגם הקריוגני מחנקן נוזלי לתחנת קצה הוואקום דומה מאוד לטכניקות המשמשות במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. פרוטוקול זה מציג את ההליך להעברת גבישים לסביבת הוואקום באמצעות הכלים והציוד שפותחו ב- Diamond Light Source. התחל על ידי הפרדת המכסה מבסיס CombiPuck כך שמחזיקי המדגם יישארו מחוברים לבסיס ובקבוקונים נשמרים במכסה.
טבול את המכסה עם בקבוקונים בחנקן נוזלי, ולאחר מכן לחבר מחזיק מדגם ומתאם לשרביט מגנטי ולקצור את הגבישים. יש לשטוף כל דגימה ישירות לתוך CombiPuck, וציין את מיקום המדגם. כדי לסגור את הדיסקית, השתמש בשרביט דיסקית כדי לחבר את הבסיס למכסה.
העבר את CombiPuck מחנקן נוזלי לשולח היבש או לאחסון. מניחים את הבסיס של דיסקית הבלוק כבר מאוכלס עם בלוקי העברה ריקים על בסיס התמיכה שלה במיכל קצף, ולאחר מכן למלא עם חנקן נוזלי. לאחר מכן, מניחים את CombiPuck במיכל הקצף מלא חנקן נוזלי, לוודא כי הבסיס של הדיסקית מאובטח למחזיק המגנטי בתוך מיכל הקצף.
מצננים מראש את כל הכלים הדרושים בחנקן נוזלי. לאחר מכן, להפריד את המכסה מהבסיס באמצעות הכלי מפריד דיסקית על ההגדרה הגבוהה, כך הבסיס נשאר מחובר למחזיק המגנטי, חשיפת מחזיקי המדגם בתוך חנקן נוזלי. הנח את שרביט המפריד מעל מחזיק הדגימה והמתאם ככל האפשר, וודא שהשביט אנכי.
הזז את הידית הקטנה על שרביט המפריד כלפי מטה עם האגודל עד שהוא לוחץ כדי לאבטח את מחזיק הדגימה בפנים, ומשוך את מחזיק הדגימה מהמתאם. הנמך את המפריד מעל מיקום בלוק ההעברה הרצוי, וודא שאחד משלושת השיניים יתאים לחור המרכזי של בלוק ההעברה. שחרר את מחזיק הדגימה על-ידי הזזת הידית למעלה.
כדי לטעון דוגמאות לבלוק ההעברה הבא, השתמש בכלי מקש הקרוסלה כדי לסובב בלוק העברה ריק למיקום האופקי. לאחר העברת כל מחזיקי הדגימה, סגור את דיסקית הבלוק על ידי הצבת המכסה בחנקן נוזלי. המתן עד שהטמפרטורה תשתווה, ולאחר מכן התאם את המכסה מעל הבסיס והרם בעדינות כדי לשחרר מהקרוסלה.
חבר את המעבורת לתחנה. פתח את גז החנקן ושסתומי האוויר וודא שהגזים זורמים. לאחר מכן, הפעל את CTS.
מצננים גם את האמבטיה וגם את המעבורת עם חנקן נוזלי. מניחים את המשפך שסופק ביציאת המילוי על המעבורת ויוצקים לאט לאט חנקן נוזלי לתוך המשפך תוך ניטור הרמה על המסך. עצור כאשר המחוון הופך מאדום לכחול.
מלאו את האמבטיה בחנקן נוזלי באמצעות המשפך. מעבירים דיסקית בלוק מחנקן נוזלי לאמבטיית CTS באמצעות כלי הפרדת הדיסקוס המצורף. הסר את המכסה של דיסקית הבלוק וסגור את המכסה של אמבט CTS.
כדי להכניס בלוק העברה למעבורת, לפתוח את ידית המעבורת על ידי סיבוב 90 מעלות בכיוון השעון ולקדם אותו לכיוון האמבטיה, כך המסלול המודרך על הידית אוכף את הנתיב הנכון של הנסיעה. לאחר כיסוי הבלוק מקורר, לקדם את הידית כדי להציג את הבלוק לתוך המעבורת. כדי לנעול את בלוק ההעברה על המעבורת, סובב את הידית 180 מעלות בכיוון השעון.
משוך את הידית למיקום האחורי המקורי, ונעל אותה במקומה על-ידי סיבוב של 90 מעלות נגד כיוון השעון. לחץ על סגור משאבת שסתום הסעות במסך התצוגה כדי להתחיל בפינוי המעבורת. ברגע שההודעות מעבורת מוכנה לזוז ואל תזיז מוט, שסתום סגור מוצגים על מסך המגע, לחץ על הידית מתחת למעבורת ולהרים אותו בזהירות באמצעות הידית בחלק העליון.
יש לשאת את המעבורת למנעל האוויר בתחנת קצה הוואקום בתנוחה זקופה ולחבר אותה. בחר מיקום בלוק ריק בתוך כלי השיט על ידי לחיצה על הכפתור המתאים במסך המגע והעברת המלון לדוגמה לעמדת הטעינה הנכונה. ברגע שמלון לדוגמה נמצא במיקום, לחץ על לחצן פתח כדי ליזום את רצף שילובי הוואקום.
לאחר השלמת הרצף ושינויי המצב ל- Airlock פתוח, לחסום במעבורת, לסובב את הידית 90 מעלות בכיוון השעון כדי לפתוח את המוט. דחוף בעדינות את המוט לתוך כלי השיט כך שהמסלול המודרך אוכף את הנתיב הנכון של נסיעה לכיוון המלון לדוגמה. הכנס באיטיות את בלוק ההעברה למלון באמצעות הזנת הווידאו המוצגת על המסך לקבלת הדרכה, והבטח שסמל מיקום החסימה בתצוגת המגע מופעל.
לאחר ההפעלה, לסובב את הידית 180 מעלות נגד כיוון השעון כדי לשחרר את בלוק ההעברה ולמשוך את המוט מתוך הכלי. לאחר נסיגה מלאה, לסובב את הידית 90 מעלות נגד כיוון השעון כדי לנעול את המוט. לחץ על כפתור סגור כדי לסגור את שסתום ואקום תחנת הקצה ולפרוק את הרווח בין המעבורת לבין כלי השיט ללחץ אטמוספרי.
הסר את המעבורת כאשר תצוגת מנעל האוויר מציגה את המצב אישור לניתוק. החזר את המעבורת לאמבטיית CTS ולחץ על שסתום הסעות פתוח כדי לפנות את המעבורת לפני טעינת בלוק הדגימה הבא. ברגע שהרמזור ירוק וההודעה אישור להזיז מוט מופיעה, ניתן להציג את בלוק ההעברה הבא למעבורת.
כדי להכין את בלוק ההעברה הבא, סובב את דיסקית הבלוק בתוך האמבטיה. דחפו את מקש הסיבוב המובנה בחלק העליון של מכסה האקריליק כלפי מטה אל תוך המנעול במרכז דיסקית הבלוק. תוך כדי החזקתו, סובבו את המפתח למיקום בלוק ההעברה הרצוי בתנוחת האיסוף.
לאחר שכל הבלוקים הועברו, ודאו ששסתום המעבורת פתוח, לחצו על כפתור האפייה במסך המגע, בחרו גם באת' וגם ב-Shuttle ולאחר מכן לחצו על 'התחל לאפות'. קרן הקריסטלוגרפיה המקקרומולקולרית הארוכה באורך גל I23 במקור אור היהלום יכולה לגשת לשולי הקליטה של אלמנטים בעלי חשיבות ביולוגית גבוהה, כגון סידן, אשלגן, כלור, גופרית וזרחן, מה שנותן אות חריג משופר שניתן להשתמש בו כדי להדגיש או לאתר אלמנטים אלה בתוך מקרומולקולות. נתוני עקיפה נאספו מגביש תאומטין יחיד באורך גל 2.75 אנגסטרום, שנבחרו כפשרה בין אות חריג מוגבר לבין השפעות ספיגת מדגם באורכי גל ארוכים יותר.
הגדרת הוואקום מבטיחה שרק צילומי רנטגן הפזורים על ידי המדגם יגיעו לגלאי, ומספקים רקע נמוך סביב השתקפויות בראג. ערכת הנתונים הניבה אות חריג חזק מאוד, להקל על פתרון המבנה על ידי צינור phasing אוטומטי CRANK2. האיכות הגבוהה של מפת צפיפות האלקטרונים המתקבלת אפשרה בניית מודל אוטומטית מוצלחת, עם מיקום נכון עבור 100% מרצף חומצות האמינו של תאומטין.
16 שאריות ציסטאין בתוך תאומטין יוצרות שמונה גשרים דיסולפידיים, שכולם נראים בבירור במפת צפיפות האלקטרונים. מכיוון שקריסטלוגרפיה של חלבון באורך גל ארוך היא תחום חדש, פיתחנו כלים וציוד חדשים לטיפול בדגימות. פרוטוקול זה מנחה את המשתמשים בהעברת דגימות בבטחה לתחנת קצה הוואקום בקו הקרן I23 במקור אור היהלום.
סביבת הוואקום פותחת הזדמנויות ייחודיות לביצוע ניסויי עקיפה בטווח אורך גל שאינו נגיש בקורות אחרות. קריסטלוגרפיה ארוכת-גל של קרני רנטגן מאפשרת phasing ניסיוני של מקרומולקולות ישירות מגבישים מקומיים. זה גם מאפשר זיהוי חד משמעי של יונים הקשורים למולקולות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להכנת דגימות קריוגניות והעברת גבישים לתחנת ואקום בקו I23 ב-Diamond Light Source. הדגש הוא על ניסויי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן במקרומולקולות עם אורך גל ארוך, אשר מנצלים אותות חריגים מאטומים קלים במקרומולקולות ביולוגיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- קריסטלוגרפיה של מקרומולקולות
- ביולוגיה מבנית
- טכניקות קרינת סינכרוטרון
רקע
- קריסטלוגרפיה של מקרומולקולות באורך גל ארוך משתמשת באותות חריגים מאטומים קלים.
- קו I23 מותאם לניסויים באורך גל ארוך, ומאפשר גישה לאלמנטים ביולוגיים קריטיים.
- הניסויים מתבצעים בוואקום כדי להפחית את ספיגת קרני הרנטגן באוויר.
- טמפרטורות קריוגניות נשמרות באמצעות מחזיקי דגימות מיוחדים.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מקיף להעברת גבישים לסביבת ואקום.
- להבטיח את שלמות הדגימות בתהליך ההעברה.
- לאפשר ניסויי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן באורך גל ארוך.
שיטות בשימוש
- הפרדת מכסה CombiPuck מבסיס לגישה לדגימה.
- טבילת דגימות בחנקן נוזלי לשימור קריוגני.
- שימוש בכלי מפריד puck לצורך העברת דגימות מדויקת.
- יישום סביבת ואקום מבוקרת להכנסת דגימות.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של גבישים משומרים קריוגנית לתחנת הסוף בוואקום.
- הוכחת יעילות הפרוטוקול בשמירה על שלמות הדגימות.
- אימות הנוהל לקריסטלוגרפיה של מקרומולקולות באורך גל ארוך.
- ביסוס שיטה אמינה לניסויים עתידיים ב-Diamond Light Source.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק מסגרת חזקה להעברת דגימות קריוגנית.
- הוא משפר את הכדאיות של ניסויי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן באורך גל ארוך.
- יישומים עתידיים יכולים לבנות על המתודולוגיה הזו עבור מחקרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography on beamline I23 enables direct experimental phasing and native ion identification in proteins and nucleic acids, eliminating the need for external labeling. This capability enhances predictive confidence in structural biology, supporting early discovery and target validation inflection points across biopharma portfolios. The protocol's reproducibility and data quality facilitate risk-adjusted advancement of structural targets for downstream drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct structure solution of macromolecules using native anomalous scatterers for robust target validation.
- Supports mechanistic de-risking by unambiguously identifying biologically relevant ions and cofactors.
- Improves predictive confidence in target structure and binding site characterization.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality, reproducible structural data for assay development and compound screening campaigns.
- Facilitates standardization of sample preparation and transfer workflows across research teams.
- Enables reliable evaluation of ligand binding and structural perturbations in validated systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural insights with disease-relevant systems by resolving native ion binding and post-translational modifications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and data quality.
- Supports translational biomarker identification through precise structural mapping.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification and preclinical validation, leveraging in-vacuum crystallography for high-confidence structural outputs.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling native anomalous phasing and ion identification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative diffraction data supporting assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides robust statistical outputs and electron density maps for comparative analysis of structural conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining sample fidelity and enabling biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for structural studies across multiple targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target structures.
- Operational Value: Standardizes sample handling and transfer, ensuring reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through high-quality structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic sample handling and macromolecular crystallography.
- Demands access to specialized instrumentation, including the Cryogenic Transfer System and vacuum-compatible sample holders.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and transfer protocols.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or crystal morphologies.
- Practical limitations include the need for vacuum-compatible infrastructure and specialized training.
