ניתוח הרכב השומנים של מיקובקטריה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה

ליפידים Mycobacteria הם מאפיין חשוב של הסוג והם קריטיים באינטראקציות Mycobacteria המארח. מהירות ורב-תכליתיות הם היתרונות העיקריים של הליך זה. שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין את התפקיד של שומנים ואת הפתוגניות של mycobacteria ואת האפקט immunostimulatory שלהם.

עבור מיצוי שומנים מקושרים שאינם קוולנטיים, להוסיף 15 מיליליטר של כלורופורם אחד עד שניים לפתרון מתנול צינור זכוכית עם כובע בורג אניה PTFE מתחת למכסה המנוע זרימה למינאר. לאחר מכן, לגרד 200 מיליגרם של mycobacteria מדיום מוצק, ולהוסיף את mycobacteria לצינור הזכוכית. לדגור על הצינור לילה עם ערבוב מתמיד.

למחרת, לסנן את הממסים האורגניים דרך משפך זכוכית מרופד בנייר מסנן לתוך צינור זכוכית. לאחר שימוש בשטף גז חנקן, כדי לאדות את השלב הנוזלי בצינור, למלא את הצינור עם גז חנקן, כדי לאחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 15 מיליליטר של שניים לאחד כלורופורם לפתרון מתנול לפסולת הסלולר ולדגירה על הצינור לילה עם ערבוב מתמיד.

למחרת בבוקר, לאפשר את התערובת לנוח במשך שעה אחת, לפני השימוש פיפטה פסטר להעביר את הממסים האורגניים לתוך משפך זכוכית מרופד נייר מסנן לתוך אותו צינור איסוף זכוכית. לאחר מכן, לאדות את השלב הנוזלי כפי שהוכח, לפני מילוי הצינור עם גז חנקן עבור ארבע מעלות צלזיוס אחסון. להפקת חומצה מיקולית, הוסיפו שניים עד חמישה מיליליטרים של תמיסה מעוררת ו-200 מיליגרם של ביומסה של מיקובקטריה לצינור זכוכית הרמטי עם מכסה בורג PTFE, וערבבו את התוכן על ידי מערבולת.

לדגור על התערובת בתוך אמבטיה יבשה ב 80 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, כאשר הצינור יש טמפרטורת החדר מקורר, להוסיף שני מיליליטר של N hexane, ולערבב את התוכן במשך 30 שניות על ידי מערבולת. אפשר לצינור להתיישב עד ששני שלבים ברורים יופיעו והעבירו את שלב ה- N הקסאן העליון לצינור חדש.

מערבבים שני מיליליטרים נוספים של הקסאן N עם תוכן הצינור ולאסוף את השכבה העליונה שוב. לאחר מכן, לאדות את תוכן הצינור על ידי זרימת חנקן ולאחסן את המדגם מכוסה חנקן בארבע מעלות צלזיוס כפי שהודגם. כדי לנתח את הדגימות על ידי TLC לכסות קיר אחד של תא TLC עם פיסת נייר מסנן, להוסיף וזלין בפינות התא כדי לאטום את התא, כדי יכול תערובת ממס על נייר המסנן ולהוסיף את הנפח הנותר של הממס לתחתית תא TLC.

סגור את תא TLC למשך 20 דקות לפחות לרוויה. בינתיים, להמיס את השומנים בצינור הזכוכית ב 200 עד 1000 microliters של כלורופורם ולהשתמש צינור זכוכית נימי כדי להחיל 10 microliters של השעיית כלורופורם השומנים ישירות על צלחת TLC. לאחר מתן אפשרות לדגימה להתייבש במשך חמש דקות, הכנס את הצלחת לתא TLC הרווי ואפשר לשלב הנייד לרוץ דרך TLC.

כאשר הממס מגיע סנטימטר אחד מהקצה העליון של הצלחת, מניחים את הצלחת מתחת לשטף למינאר עד שהסיליקה יבשה לחלוטין. לאחר מכן, לרסס את הצלחת היבשה עם 15 עד 20 מיליליטר של 10% נתונים טוחנים חומצה זרחתית לחות באתנול עד הצלחת הוא צהוב בהיר, ולחמם את הצלחת במשך שתיים עד חמש דקות ב 120 מעלות צלזיוס. בניתוח מייצג זה, החומצה המיקולית המופקת ממיני מיקובקטריה שונים, נותחה באמצעות TLC חד ממדי באמצעות שתי מערכות אלוציה שונות ו- TLC דו ממדי.

שני סוגים של הליכי מתילציה בוצעו גם כדי לאשר את נוכחותה של חומצה מיקולית מסוג חמש. בשתי מערכות ההבחנה, החומצות המיקוליות היו ממוקמות בערך באמצע הצלחת, אם כי, הנקודה המתאימה לחומצה מיקולית מסוג חמש, נצפתה רק לאחר הספוניפיקציה. TLC דו מימדי מאפשר גם זיהוי של סוגי חומצה מיקולית בודדים.

לדוגמה, mycobacterium brumae מבטא רק סוג אחד חומצות מיקוליות, mycobacterium bovis BCG מבטא סוג אחד וארבע, מזל mycobacterium מבטא סוג אחד וחמש, ו mycobacterium abcessus מבטא סוג אחד ושני פרופילי חומצה מיקולית. סך תמציות השומנים ממיני מיקובקטריה שונים נותחו בתפקוד הקוטביות והגודל שלהם. הוא מגלה כי רוב שומנים קוטביים, כגון PDIMs, נמצאים במיקובקטריום bovis BCG, אך לא במוצקי מיקוביצריום, מיקובקטריום בומה והמורפוטיפ החלק של M abcessus.

GlycoLipids פנולי נמצאים רק mycobacterium bovis BCG, בעוד GlycoPeptidoLipids נצפים רק בדגימות מ mycobacterium abcessus. בדומה לחומצות מיקוליות, אציליצרילס ו- PDIMs, PIMs, ניתן גם לדמיין בקלות באמצעות ניתוח TLC חד ממדי או 2D TLC. שני סוגים של כתמים שימשו כדי לחשוף PIMs ב- TLC חד ממדי.

הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה הוא לא להשתמש בכל מכשירים מפלסטיק לאורך כל ההליך.